产生高产的沙门氏菌减毒菌株的方法

产生高产的沙门氏菌减毒菌株的方法
【专利摘要】本发明涉及可用于培养伤寒沙门氏菌(Salmonella?typhi)减毒突变株的新方法，所述菌株不具有半乳糖表异构酶活性并且含有重组的DNA分子。所述方法包括这样的步骤：培养所述伤寒沙门氏菌菌株但在发酵过程中不向培养基中添加葡萄糖，起始的葡萄糖含量在达到平台期之前耗尽。本发明还涉及可通过所述方法获得的伤寒沙门氏菌减毒突变株以及涉及可用作疫苗的含有编码VEGF受体蛋白的重组DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株。
【专利说明】产生高产的沙门氏菌减毒菌株的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及新的可用于产生伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi)减毒突变株的方 法，所述菌株不具有半乳糖表异构酶活性并且含有重组的DNA分子。所述方法包括培养所 述伤寒沙门氏菌菌株的步骤，在发酵过程中不向培养基中添加葡萄糖，所述培养基中起始 的葡萄糖含量在达到平台期之前耗尽。本发明还涉及可通过所述方法获得的伤寒沙门氏菌 减毒突变株以及涉及可用作疫苗的含有编码VEGF受体蛋白的重组DNA分子的伤寒沙门氏 菌减毒突变株。

【背景技术】
[0002] 在疫苗开发的多种不同方法中，活菌苗是其中最有前景的，由于其模拟了许多病 原菌的侵入途径并且能够在全身和粘膜腔两个水平上诱导有效的体液和细胞免疫应答。活 菌苗可通过口腔或经鼻给药，与肠胃外给药相比其具有简单和安全的优势。批量制备成本 较低并且活菌苗制剂具有高稳定性。通过缺失基因可实现减毒，所述基因包括毒性基因、调 节基因和代谢基因。
[0003] 减毒细菌疫苗不仅可被用于诱导其相应病原菌菌株的免疫，而且可被改进后用于 递送一种或多种异种抗原。
[0004] 肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica)的减毒产物用作递送异种抗原到哺乳动物 免疫系统的载体是非常有前景的，因为肠炎沙门氏菌菌株可通过免疫系统的粘膜途径递送 并且具有入侵宿主组织并存留的能力，同时可持续产生异种抗原。此外，沙门氏菌菌株可在 全身和粘膜腔两种水平激发体液和细胞免疫应答。
[0005] 通过aro突变减毒的数种鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium)已显示是动 物模型中异种抗原的安全和有效的递送载体。
[0006] W003/073995中描述了通过活的鼠伤寒沙门氏菌减毒菌株将编码异种抗原 的DNA结构，特别是VEGF受体蛋白递送到小鼠祀细胞的方法。Niethammer等（Nature Medicine2002, 8 (12)，1369)揭示了含有编码鼠血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2或 FLK-1)的表达载体的减毒的鼠伤寒沙门氏菌aroA菌株SL7207具有肿瘤疫苗的功能，所述 鼠血管内皮生长因子受体2对肿瘤血管发生是必要的。
[0007] 但是，只有一种减毒的肠炎血清型沙门氏菌菌株，其称为肠炎血清型伤寒沙门氏 菌Ty21a(简称：伤寒沙门氏菌Ty21a)可被接受用于人。
[0008] 通过化学诱变野生型毒性细菌分离株伤寒沙门氏菌Ty2并且包含galE基因的功 能缺失突变以及其他未经发现的突变可获得这种耐受性好的针对伤寒的活口服疫苗。在现 场试验显示有效并且安全后，其已在许多国家被批准作为伤寒疫苗。
[0009] 对于可安全用于人的活的减毒细菌载体用作异种抗原一特别是肿瘤抗原的递送 载体具有很大的需求。提供这种减毒的细菌载体用作DNA疫苗还需要高效、高产地培养所 述异种抗原DNA转化的所述减毒细菌菌株。使用重组DNA构建转化细菌菌株经常会导致细 胞生长的下降。因此，通常需要改良优化的大规模培养过程以获得高产的具有活力和功能 活性的细胞。
[0010] 发明目的
[0011] 本发明的目的是改进现有技术中培养伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法。尤其是， 本发明的目的是开发可获得含有编码异种抗原的重组DNA分子的高产有活力细菌的有效 培养方法。所述方法和可通过所述方法获得的伤寒沙门氏菌减毒突变株将满足对安全的沙 门氏菌作为可用于人的疫苗的需求。所述方法将尤其适合于商业大规模生产基于减毒沙门 氏菌的DNA疫苗。


【发明内容】

[0012] 令人意外地发现，如果在达到平台期以前培养基中葡萄糖含量减少到零，缺失半 乳糖表异构酶活性的伤寒沙门氏菌减毒菌株的细胞产量会显著增加。本发明显示，在发酵 过程中向培养基中添加葡萄糖未产生更高的细胞量/更高的0D值。相反地，在培养所述减 毒沙门氏菌过程中不添加葡萄糖，在细胞生长平台期的初始阶段的0D值约为6到8,而相同 的培养在葡萄糖水平约1到约4g/l，优选约2到约3g/l时（例如，通过向培养基中持续添 加葡萄糖实现）得到的0D值仅为约3到约5. 5。
[0013] 与含有葡萄糖培养的细胞相比，本发明所述用于培养伤寒沙门氏菌减毒突变株的 方法还可产生不同形态的细胞。与含有葡萄糖培养的细胞相比，无葡萄糖条件下培养的伤 寒沙门氏菌细胞更小且更短。但是，与含有葡萄糖的培养基中培养的细胞类似，这些形态不 同的细胞具有完全的生物学活性，并未表现出任何细胞裂解的趋势。
[0014] 无论所选择的伤寒沙门氏菌减毒菌株含有编码异种抗原的重组DNA分子（例如 pcDNA3. 1-FLK1或其衍生的质粒例如pVAXIO. VR2-1)或者不含重组DNA分子（空的减毒菌 株），通过本发明的方法在培养过程中不添加葡萄糖获得的细胞产量的增加都可以实现。
[0015] 因此，一方面，本发明涉及培养缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝含 有表达盒的DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法，其包括在含有蛋白胨起始pH值接 近中性的缓冲培养基中以发酵规模培养所述菌株的步骤，其中发酵过程中对培养基中葡萄 糖的量进行调整以使得在达到平台期之前葡萄糖含量减少到零。
[0016] 在一个具体的实施方案中，发酵过程中不向培养基中添加葡萄糖，并且在达到平 台期之前起始的葡萄糖被耗尽。
[0017] 在一个具体的实施方案中，所述伤寒沙门氏菌突变株是伤寒沙门氏菌Ty21a。
[0018] 在一个具体的实施方案中，所述表达盒是真核表达盒。在一个具体的实施方案中， 所述表达盒编码VEGF受体蛋白。在一个具体的实施方案中，所述VEGF受体蛋白选自人 VEGFR-2及与其具有至少约80%同一性的同源蛋白。在一个优选的实施方案中，人VEGFR-2 的氨基酸序列如SEQ ID N01所示。
[0019] 在一个具体的实施方案中，所述缓冲的培养基包含非动物来源的蛋白胨。在一个 优选的实施方案中，所述缓冲的培养基是非动物来源的胰蛋白酶大豆液体培养基（TSB)。
[0020] 在一个具体的实施方案中，所述培养基的体积是至少约10L，更具体地是从约10L 到约10, 000L，更具体地是从约30L到约1，000L，最具体地是从约100L到约500L。
[0021] 在一个具体的实施方案中，所述起始葡萄糖浓度与细菌基本培养基一致或更低， 具体地所述起始葡萄糖浓度从约〇g/l到约4g/l。
[0022] 在一个具体的实施方案中，所述起始pH值是从约5到小于约9,具体地从约6到约 8,更具体地从约6. 5到约7. 5。
[0023] 在一个具体的实施方案中，在所述培养过程中将所述pH值调整到约6到约8,具体 地调整到pH值约6. 5到约7. 5。
[0024] 在一个具体的实施方案中，所述培养进程是通过测定光密度（0D)确定的，具体地 是通过原位检测培养物的光密度或者通过取样并测定样品的光密度确定的。
[0025] 在另一个具体的实施方案中，所述培养进程是通过测定细胞浓度确定的，具体地 是通过显微镜或通过测定电阻或通过流式细胞仪确定的。
[0026] 在另一个具体的实施方案中，所述培养进程是通过取样并接种到琼脂平板上来测 定菌落形成单位（CFU)值确定的。
[0027] 在一个具体的实施方案中，在达到光密度约6时收获细胞，具体地在光密度约5到 约6时收获细胞。
[0028] 在一个具体的实施方案中，所述伤寒沙门氏菌减毒突变株是伤寒沙门氏菌Ty21a， 所述重组DNA分子包括卡那霉素抗性基因、pMBlori和受CMV启动子控制的编码人VEGFR-2 的真核表达盒。在一个具体的实施方案中，所述人VEGFR-2具有SEQ ID N02所示的核酸序 列。
[0029] 另一方面，本发明涉及缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝含有表达盒 的重组DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株，其可通过培养所述菌株获得，包括以发酵规 模在含有蛋白胨起始pH值接近中性的缓冲培养基中培养所述菌株的步骤，其中发酵过程 中对培养基中葡萄糖的量进行调整以使得在达到平台期之前葡萄糖含量减少到零。
[0030] 在一个具体的实施方案中，在所述发酵过程中不向所述培养基中添加葡萄糖，并 且在达到平台期之前起始量的葡萄糖被耗尽。
[0031] 在一个具体的实施方案中，所述表达盒是编码VEGF受体蛋白的真核表达盒。在一 个具体的实施方案中，所述真核表达盒编码选自人VEGFR-2及与其具有至少约80%同一性 的同源蛋白的VEGF受体蛋白。在一个具体的实施方案中，所述人VEGFR-2的氨基酸序列如 SEQ ID N01 所示。
[0032] 在一个具体的实施方案中，所述减毒突变株是伤寒沙门氏菌Ty21a并且所述重组 DNA分子包括卡那霉素抗性基因、pMBlori、和受CMV启动子控制的编码人VEGFR-2的真核 表达盒。在一个具体的实施方案中，所述人VEGFR-2具有SEQ ID N02所示的核酸序列。
[0033] 还有另一方面，本发明涉及用作疫苗的伤寒沙门氏菌Ty21a减毒突变株，其包括 至少一个拷贝的含有编码VEGF受体蛋白的真核表达盒的重组DNA分子。
[0034] 在某些实施方案中，所述VEGF受体蛋白选自人VEGFR-2及与其具有至少约80 %同 一性的同源蛋白。
[0035] 在一个优选的实施方案中，所述人VEGFR的氨基酸序列如SEQ ID N01所示。
[0036] 对于安全和经济地生产基于减毒沙门氏菌菌株例如已批准的伤寒沙门氏菌Ty21a 菌株的商业DNA疫苗来说，通过本发明的方法能够获得更高细胞产量的伤寒沙门氏菌减毒 突变株是重要的。伤寒沙门氏菌Ty21a携带编码异种抗原的重组DNA分子例如所述表达质 粒pVAXIO. VR2-1，因而可以更高产地培养产生更高产量的可用于人的DNA疫苗。这也符合 生产和培养沙门氏菌即使是减毒沙门氏菌时的高安全性原则。

【具体实施方式】
[0037] 通过参考以下对本发明的详细描述及其中所包含的实施例可更容易地理解本发 明。
[0038] 1)伤寒沙门氏菌包括野生型伤寒沙门氏菌Ty2和减毒伤寒沙门氏菌Ty21a。
[0039] 在所述受试方法中，可使用任意伤寒沙门氏菌减毒菌株。伤寒沙门氏菌减毒菌 株 Ty21a 是 Typhoral L'?也称为 Vivotif1、（生产商：Berna Biotech Ltd.，a Crucell Company，瑞士）中的活性成分。其是目前仅有的已许可针对伤寒的活性口服疫苗。该疫苗 已在超过40个国家被许可。Typhoral L?的市场许可证号为：PL15747/0001，许可时间： 1996年12月16日。一剂疫苗含有至少2 X109个有活力的伤寒沙门氏菌Ty21a菌落形成 单位和至少5 X 109个无活力的伤寒沙门氏菌Ty2la细胞。所述疫苗菌株是在发酵罐内控制 条件下培养的，其所用培养基中包含消化的酵母提取物、酸消化酪蛋白、葡萄糖和半乳糖。
[0040] 本发明中，所述伤寒沙门氏菌Ty21a细菌菌株的一个生物化学性质是其不具有代 谢半乳糖的能力。所述重组的减毒细菌菌株也不具有将硫酸盐还原为硫化物的能力，这将 其与野生型伤寒沙门氏菌Ty2菌株相区别。对于伤寒沙门氏菌Ty21a菌株的血清学特性， 其含有09-抗原（其是所述细菌的外膜上的多糖）并且缺少05-抗原（其是伤寒沙门氏菌 Ty2的特征组分）。另一方面，该血清学特性支持在分批释放的鉴定试验中包含合适的测 试。
[0041] 在一个具体的实施方案中，通过本发明的方法培养的伤寒沙门氏菌减毒突变株是 携带至少一个拷贝的pVAXIO. VR2-1质粒DNA的伤寒沙门氏菌Ty21a，所述质粒DNA编码人 血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的真核表达盒。该减毒突变株命名为VXM01并可被用 作口服肿瘤疫苗。
[0042] 本发明中，所述伤寒沙门氏菌Ty21a减毒株在口服递送命名为VXM01的DNA疫苗 中用作编码异种抗原血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)的质粒DNA的细菌载体。
[0043] 基于质粒DNA技术递送疫苗可产生广谱的粘膜和全身免疫应答。活的复制型载体 可原位产生它们自身的免疫调节因子例如脂多糖（LPS)，这形成了相对于其他给药形式例 如微囊化的优势。此外，使用自然侵入途径证明是有利的，因为许多细菌例如沙门氏菌通过 派尔集合淋巴结的Μ细胞从肠腔流出并最终迁移进入淋巴结和脾，从而使疫苗靶向免疫系 统的诱发位点。迄今为止，所述伤寒沙门氏菌Ty21a疫苗株已被证明具有非常好的安全范 围。当通过Μ细胞从肠腔逸出后，所述细菌被吞噬细胞例如巨噬细胞和树突细胞吸收。这 些细胞被病原体激活并可能迁移进入淋巴结和脾。由于它们的减毒突变，所述伤寒沙门氏 菌Ty21菌株在这些吞噬细胞中不能存活而是从此死亡。迄今为止，没有数据表明伤寒沙门 氏菌Ty21a能够进入全身血液系统。因此，所述活的伤寒沙门氏菌Ty21a减毒疫苗株可特 异地靶向免疫系统，从而具有非常好的安全范围。
[0044] 携带编码靶抗原的DNA的活的减毒细菌携带者可用作口服递送这些抗原的载体。 活的复制型载体可原位产生它们自身的免疫调节因子例如脂多糖（LPS)，这形成了相对于 其他给药形式例如微囊化的优势。
[0045] 基因免疫接种可具有相对于传统疫苗接种的优势。所述靶DNA可在很长时间内检 测到，因而可作为储存的抗原。一些质粒中的基序如GpC岛是免疫调节因子并且还可作为 由LPS和其他细菌组分引起的免疫刺激的佐剂。
[0046] 如上所述，通过Μ细胞从肠腔逸出后所述重组沙门氏菌被吞噬细胞吸收。这些吞 噬细胞是被病原体激活并开始分化的，并且可迁移进入淋巴结和脾。该过程中，所述细菌 由于它们的减毒突变而死亡并且释放基于所述质粒的真核表达载体，然后所述质粒通过特 有的运输系统或者通过胞内渗透转移进入细胞液。最后，所述载体进入细胞核并转录，在 宿主细胞的细胞液中产生抗原表达。针对所述异种抗原的具体的细胞毒性Τ细胞，优选人 VEGFR-2,被活化的抗原呈递细胞（APC)所诱导。
[0047] 在一个具体的实施方案中，由所述伤寒沙门氏菌Ty21a菌株所携带的重组DNA分 子是pVAXIO. VR2-1质粒DNA(7. 58kb)，含有真核的人巨细胞病毒（CMV)早期瞬时启动子以 保证在宿主细胞中有效转录VEGFR-2蛋白，并且含有原核的复制起始点（ori)以保证在细 菌宿主内增殖。对可从商业途径（Invitrogen)获得的pcDNA3载体进行改良以符合调节 需要，以此将在大肠杆菌中复制非必需的序列或者在哺乳动物细胞中表达所述重组蛋白非 必需的序列移除以限定所述DNA序列与人类基因组可能的同源性并且最小化染色体整合 的可能性。此外，使用卡那霉素抗性基因替代氨苄霉素抗性基因。对于本发明方法产生的 伤寒沙门氏菌减毒突变株VXM01，将pVAXl-Flk-Ι质粒中的高拷贝pUC复制起始点替换为 pVAXIO. VR2-1质粒中的低拷贝复制起始点pBR322。进行所述低拷贝调整以减少代谢负荷 并使所述结构更加稳定。VAX10. VR2-1质粒结构的细节如图2所示。
[0048] 2)血管内皮生长因子受体：
[0049] 血管内皮生长因子VEGF(Kd75-760pM)是六个结构相关蛋白家族（VEGF-A[也称作 VEGF]，-B，-C，-D，-E和PLGF[胎盘生长因子，也称作PGF或PIGF-2])的成员之一，其调节 血管系统多种组分特别是血液和淋巴管的生长和分化。VEGF在血管发生中的作用是通过 该蛋白与VEGFR-2的相互作用介导的。VEGFR-2也称作含激酶插入区受体（KDR)，其是具有 1356个氨基酸、分子量为200-230kDa对VEGF以及VEGF-C和VEGF-D高亲和的受体。通过 筛选内皮cDNA鉴定的人酪氨酸激酶受体VEGFR-2与以前发现的鼠 VEGFR-2 (也称为胎肝激 酶l，Flk-l)具有85%序列同一性。VEGFR-2通常在内皮和造血干细胞前体以及内皮细胞、 初期造血干细胞和脐带间质中表达。但是，在静止的成人脉管系统中VEGFR-2mRNA是被下 调的。
[0050] VEGFR-2的胞外域含有18个可能的N-连接糖基化位点。VEGFR-2最初合成 为150kDa的蛋白并迅速糖基化为200kDa的中间体，然后以较低的速率进一步糖基化为 230kDa在细胞表面表达的成熟蛋白质。
[0051] 克隆进入pVAXIO. VR2-1质粒的编码cDNA序列的人VEGFR-2氨基酸序列如图1所 /_J、1 〇
[0052] 3)制造空的和工程伤寒沙门氏菌Ty2la
[0053] 本发明所实施的伤寒沙门氏菌减毒突变株的生产过程包括在含有蛋白胨作为氨 基酸和肽源的培养基中培养所述伤寒沙门氏菌减毒突变株。适合于本发明方法的培养基包 括但不限于标准TSB培养基和非动物来源的TSB培养基。标准TSB培养基和非动物来源的 TSB培养基都含有2. 5g/l葡萄糖。通常，TSB或TSB-类似培养基中含有的起始葡萄糖大致 会在伤寒沙门氏菌减毒株培养3 - 5h后被耗尽，并且必须每3 - 5h用新的葡萄糖替换以保 持所述培养基中葡萄糖水平的相对稳定。在培养伤寒沙门氏菌减毒突变株（其可任选地含 有编码异种抗原的DNA分子）的过程中省略添加葡萄糖的步骤发现会导致与添加葡萄糖的 培养相比细胞生长增加，这是非常令人意外的并且显示所述细菌细胞中的某些代谢途径被 葡萄糖的缺失所启动。如果在所述培养过程开始的TSB或TSB-类似培养基中不含有葡萄 糖，也能观察到所描述的效应。因此，除更高的细胞产量及由此产生的更高的最终DNA疫苗 产量之外，通过阐明发酵过程中给料葡萄糖的步骤不是必需的，本发明的方法还具有更便 宜、更简单的优点。
[0054] 本发明所实施的伤寒沙门氏菌Ty21a减毒突变株的生产过程示例性的描述于下 表1 :
[0055]

【权利要求】
1. 一种培养缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝的含有表达盒的重组DNA 分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法， 其包括以发酵规模在起始pH值接近中性的含有蛋白胨的缓冲培养基中培养所述菌株 的步骤， 其中发酵过程中对所述培养基中葡萄糖的量进行调整以使得在达到平台期之前葡萄 糖含量减少到零。
2. 权利要求1的方法，其中发酵过程中不向所述培养基中添加葡萄糖并且起始的葡萄 糖含量在达到平台期之前耗尽。
3. 权利要求1或2中任一项的方法，其中所述伤寒沙门氏菌减毒突变株是伤寒沙门氏 菌 Ty21a。
4. 权利要求1到3任一项的方法，其中所述表达盒是真核表达盒，优选编码VEGF受体 蛋白，优选选自人VEGFR-2及与其具有至少约80 %同一性的同源蛋白的VEGF蛋白，特别地 其中人VEGFR-2具有SEQ ID N01所示的氨基酸序列。
5. 权利要求1到4任一项的方法，其中所述缓冲的培养基包含非动物来源的蛋白胨，优 选地其中所述缓冲的培养基是非动物来源的胰蛋白酶大豆液体培养基（TSB)。
6. 权利要求1到5任一项的方法，其中所述培养基的体积是至少约10L，优选地从约 10L到约10, 000L，更优选地从约30L到约1，000L，最优选地从约100L到约500L。
7. 权利要求1到6任一项的方法，其中所述起始葡萄糖浓度相当于细菌基本培养基中 的葡萄糖浓度或更低，优选地其中所述起始葡萄糖浓度为从约〇g/l到约4g/l。
8. 权利要求1到7任一项的方法，其中所述起始pH值是从约5到小于约9,优选地从 约6到约8,更优选地从约6. 5到约7. 5。
9. 权利要求1到8任一项的方法，其中所述pH值在所述培养过程中被调整到约6到小 于约8,优选地被调整到约6. 5到约7. 5。
10. 权利要求1到9任一项的方法，其中培养进程通过以下确定：（i)测定光密度（OD) 确定的，优选地通过（ia)原位监测所述培养物中的光密度或通过（ib)取样并测定所取样 品的光密度，或者通过（ii)测定细胞密度，优选地（iia)通过显微镜或（iib)通过测定电 阻，或者（iic)通过流式细胞仪，或通过（iii)取样并铺在琼脂平板上，然后测定菌落形成 单位（CFU)值。
11. 权利要求1到10任一项的方法，其中在光密度达到约6. 0之前，优选地在光密度约 5到约6时收获细胞。
12. 权利要求1到11任一项的方法，其中所述伤寒沙门氏菌减毒突变株是伤寒沙门氏 菌Ty21a并且所述重组DNA分子含有卡那霉素抗性基因、pMBlori、受CMV启动子控制的编 码人VEGFR-2的真核表达盒，特别地其中所述人VEGFR-2具有如SEQ ID N02所示的核酸序 列。
13. -种缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝的含有表达盒的DNA分子的伤 寒沙门氏菌减毒突变株， 其可通过培养所述菌株的方法获得，包括以下步骤： 以发酵规模在含有蛋白胨起始pH值接近中性的缓冲培养基中培养所述菌株，其中所 述培养基中葡萄糖的量在发酵过程中被调整以使得在达到平台期之前葡萄糖含量减少到 零，优选地其中在发酵过程中不向所述培养基中添加葡萄糖并且起始的葡萄糖含量在达到 平台期之前耗尽。
14. 权利要求13的减毒突变株，其中所述表达盒是编码VEGF受体蛋白的真核表达盒， 优选选自人VEGFR-2及与其具有至少约80 %同一性的同源蛋白的VEGF受体蛋白，其中所述 人VEGFR-2具有SEQ ID N01所示的氨基酸序列。
15. 权利要求14的减毒突变株，其中所述减毒突变株是伤寒沙门氏菌Ty21a并且所述 重组DNA分子含有卡那霉素抗性基因、pMBlori、受CMV启动子控制的编码人VEGFR-2的真 核表达盒，其中所述人VEGFR-2具有如SEQ ID N02所示的核酸序列。
16. -种用作疫苗的伤寒沙门氏菌Ty21a减毒突变株，其含有至少一个拷贝的含有真 核表达盒的重组DNA分子，所述真核表达盒编码VEGF受体蛋白，优选选自人VEGFR-2及与 其具有至少约80%同一性的同源蛋白的VEGF受体蛋白，特别地其中所述人VEGFR-2具有 SEQ ID N01所示的氨基酸序列。
【文档编号】A61K39/00GK104066834SQ201280064144
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2011年12月22日
【发明者】海因茨·尤贝瑙诺, 霍尔格·西德, 雷纳特·詹森, 马尔科·施普林格 申请人:万科斯蒙股份有限公司