制备人类原代肝细胞的球体的方法

制备人类原代肝细胞的球体的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于制备人类原代肝细胞的球体的方法。所述方法包括在允许肝细胞球体形成的条件下，在多糖支架上培养分离的人类原代肝细胞；并且随后使所述多糖支架溶解以释放所述肝细胞球体。通过本发明的方法得到的球体尤其适用于被移植到经受肝脏疾病折磨的受试者中。
【专利说明】制备人类原代肝细胞的球体的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及制备人类原代肝细胞的球体的方法。所述方法包括：在允许肝细胞球 体形成的条件下，在多糖支架上培养分离的人类原代肝细胞，W及随后使多糖支架溶解W 释放肝细胞球体。通过本发明的方法得到的球体尤其适用于被移植到经受肝脏疾病折磨的 雙试者中。

【背景技术】
[0002] 对于基于肝脏的代谢性障碍或肝功能衰竭，原位肝脏移植是最实用的根治疗法。 但由于器官短缺，因此强烈需要发展一种维持或恢复正常肝脏功能的替代疗法。有趣的 是，仅有少量巧％至10% )移植的肝脏组织就能够提供足够的功能来消除代谢性肝脏 缺陷，并且甚至在患肝脏衰竭的患者中仅需要肝重量的1 %至5%来进行再生（Puppi等 人.（2009), Methods Mol Biol 481, l;Pietrosi 等人.（2009), World J Gastroenterol 15, 2074)。
[0003] 本领域中，已经设想使用单细胞息浮液进行肝脏细胞移植，并且该方法已经用 于来自不同中也的超过80个的病例报告中（Fitzpatrick等人.（2009),J Intern Med 266,339)。遗憾的是，由于低细胞植入率，在大多数肝脏疾病中仅得到有限的成功。来 自大鼠模型的数据证实：在大多数移植方法中，仅移植肝细胞的0.5%最终植入到受体肝 脏中，并且将移植肝细胞长期植入到人类中是比较鲜为人知的（Allen等人（2001) J L油 Clin Med 138,298)。在患有雷弗素姆氏病（Refsum'S disease)的婴儿的情况中，单肝细 胞经八次口静脉输注仅产生不高于0.25%的植入（Sokal等人（2003), Transplantation 76, 735)。涉及受体肝脏中低植入率和再生率的问题体现了在人类中通过肝细胞移植来成 功治疗肝脏疾病的主要障碍。
[0004] H维（3D)支架的移植是另一种替代方式。在本领域中已经设想使用该方式来克 服在单细胞息浮液移植方法中所观察到的低细胞植入率。在3D支架的移植中，在该3D支架 上已经培养了肝细胞。该3D支架的移植方法是基于如下的假设：由于改进的稳定性和耐应 力性，H维的肝脏微组织更有可能植入到病变的肝脏组织中。例如，聚a-乳酸）任LLA)聚 合物已经作为支架用于肝组织工程中（Torok等人.（2011)Liver Transpl. 17, 104-114)。 该些支架被移植到受体中，并且在移植后的一段时间内被缓慢地降解。然而，已知基于支架 的移植经常与被移植肝细胞的供血不足相关，而且也与不良的胆汁去除相关。
[0005] 因此，需要一种用于根治肝脏障碍或肝脏衰竭的新的治疗方法。本发明提供了一 种用于将分离的人类肝细胞，优选人类原代肝细胞培养成H维肝脏微组织的方法。该些肝 脏微组织（通常被称作肝细胞球体）尤其适用于被植入到受体的病变肝脏组织和/或功能 障碍的肝脏组织中。本发明的方法提供了分离的肝细胞球体，该分离的肝细胞球体没有任 何诸如PLLA聚合物的人造支架或承载物。根据本发明的方法，肝细胞培养在多糖支架上， 该多糖支架在球体形成之后被溶解。在溶解多糖支架之后，能够收获完整的肝细胞球体W 用于后续的体内或体外应用，例如用于毒性研究或被移植到受体中。该样，本发明的方法克 服了已经报道的与单细胞输注和基质植入相关的缺点。分离的球体与高细胞植入率W及快 速整合到受体肝脏组织中相关，从而在消除代谢性肝脏缺陷和暴发性肝脏衰竭中提供了实 质性帮助。


【发明内容】

[0006] 本发明提供了一种用于制备尤其适用于移植医学中的人类肝细胞的H维聚集体， 优选人类原代肝细胞的H维聚集体的方法。
[0007] 因此，在第一方面中，本发明提供了一种用于制备培养的人类原代肝细胞球体的 方法，所述方法包括W下步骤：
[0008] (a)在允许肝细胞球体形成的条件下，在多糖支架上培养人类原代肝细胞；
[0009] 化）使所述多糖支架溶解W释放所述肝细胞球体；
[0010] (C)使所述肝细胞球体与培养基分离。
[0011] 本发明的方法针对肝脏球体的制备，所述肝脏球体包括代谢所必需的人类肝细胞 或由代谢所必需的人类肝细胞组成，并且所述肝脏球体尤其用于在移植后长期维持肝脏功 能。如本文所使用的，"肝细胞球体"是指人类肝细胞的H维球状细胞聚集体，它们通过细 胞间连接诸如紧密连接而相互连接。通过本领域中已知的众多方法，例如通过透射电子显 微镜能够检测细胞间存在的连接。或者，通过检测闭锁小带蛋白1狂〇-1)能够验证紧密连 接的发生。通过本发明的方法所得到的聚集体具有一尺寸，该尺寸使该些聚集体适用于经 由口静脉输注的移植中。优选地，球体的直径为至少50 y m、至少100 y m、至少150 y m、至少 200 y m或更大。
[0012] 该球体被培养在多糖支架的表面上和/或在多糖支架的孔内。作为第一步骤，本 发明的用于制备可移植球体的方法包括将分离的人类原代肝细胞接种至多糖支架。如本文 所使用的，"原代"肝细胞是已经通过本领域已知的方法从人类肝脏中分离出来的肝细胞。 例如，肝细胞可源自外植的健康供体器官。或者，原代肝细胞也可从患有肝脏疾病的受试者 的外植器官中得到。然而，在后一情况中，将在根据本发明的方法中使用的肝细胞优选来自 于有功能的肝脏组织，即来自于肝脏中未受疾病影响的部分。
[0013] 在又一实施方式中，通过肝脏活组织检查来得到人类原代肝细胞。例如，肝脏活组 织检查可在腹部手术期间通过从肝脏的一个或多个位点移除组织样品来进行。或者，活组 织检查可通过穿过血管经静脉来进行，或通过使用中空针经由皮肤来进行，该中空针穿过 皮肤进入肝脏。还可使用CT扫描和超声影像在活组织检查期间来引导针。或者，可进行腹 腔镜肝脏活组织检查W收获本发明的方法所需的人类原代肝细胞。在本发明的优选实施方 式中，已经通过肝脏活组织检查从活的人类供体中得到了人类肝细胞，该人类肝细胞用于 接种至多糖。
[0014] 通常，从活组织检查中得到的组织样品在从器官上移除之后立即给予合适的缓 冲液灌注。可用于组织灌注的合适的缓冲液包括Cu别Odiol⑩HTK溶液，威斯康星大学 溶液扣W溶液）或在本领域中记载的与器官灌注相关的其它溶液。随后，常常对组织样 品进行处理W得到肝脏的单细胞息浮液。该可例如通过胶原酶消化程序，例如Damlri等 人.（2001)，化patology 33, 981中所述的两步程序来实现。可对从组织样品中释放出来的 肝细胞进行过滤，并且用合适的缓冲液（诸如肝细胞洗涂介质化epatocyte Wash Medium) (Invitrogen(英杰公司））进行洗涂，且立即用于接种多糖支架，或在液氮中急速冷冻并储 存在-8(TC下直至进一步的使用。
[0015] 本发明的方法的具体优点在于；能够从需要进行肝细胞细胞移植的受试者中直接 得到人类肝细胞。在该样的实施方式中，通过本发明的方法所产生的球体源自于患者自身 的原代肝细胞，该样做的具体优点是在将肝细胞聚集体转移到受体中后能够避免进行免疫 抑制，而在异体细胞移植后经常是需要的该免疫抑制。自身球体的移植尤其有助于如下的 情况；患者受肝脏疾病的折磨，从而导致肝脏的某些区域被破坏，但器官的其它区域仍然由 有功能的肝脏组织构成。在该些情况中，通过肝脏活组织检测能够得到来自器官有功能区 域的肝细胞，并且该些细胞能够用作本文所述方法的起始材料。其中肝脏仍然保持功能和 必需肝组织的肝脏缺陷包括例如慢性非传染性肝脏疾病，如肝硬化和代谢性肝脏疾病。
[0016] 或者，本发明的肝细胞球体也能从人类供体中得到，而不是从将要接受肝细胞球 体移植治疗的受试者中得到。在该方法中，用作本发明方法的起始材料的原代肝细胞源 自于供体受试者，该供体受试者与接受该球体的受体受试者在遗传学上是不同的（异体 移植）。当要被移植的球体对于受体是异体时，通常需要进行慢性免疫抑制W避免受体内 发生移植细胞的排斥。可给予接受本发明的异体肝细胞球体的受试者的免疫抑制剂包括： 例如，皮质类固醇；抗代谢物，诸如甲氨蝶岭、咪哇硫嘿岭、来氣米特、环抱霉素、他克莫司 (tacrolimus)、西罗莫司（sirolimus)、依维莫司（everolimus)、霉酷酸醋；W及抗体，诸如 莫罗莫那（muromon油）-CD3和利妥昔单抗。
[0017] 如上所述，从供体中得到的且经处理的原代肝细胞随后被接种至多糖支架，并且 被培养成球体。该步骤优选离体进行，即在人体外进行。如本文所使用的，支架或承载物为 H维聚合物基质，其能够维持细胞附着并且使得接种至所述基质的细胞之间能够形成细胞 间接触。术语"支架"和"承载物"在本文中可交换使用。优选地，支架或承载物是允许细胞 接种其上W在表面上和/或孔内生长的多孔材料。接种至多糖支架的细胞的数目将取决于 不同的因素，诸如要接种肝细胞的支架的具体材料和尺寸、在肝细胞后续培养时所使用的 条件W及用于接种支架的细胞的代龄（age)。当使用新鲜分离的原代肝细胞进行接种时，用 于接种直径约15?20mm且厚度为1?2mm的单一支架的细胞数目将在约IX 10\5 X 104、 1X105、5X105、1X106、5X106、1X107、5X107、1X108、5X109 或更大的范围中。优选地， 用于接种到该尺寸的支架上的细胞数目将在1 X 1〇6至1 X 1〇8的范围内，更优选为1 X 1〇6。 接种例如通过使预定数目的分离的肝细胞息浮在合适体积的缓冲液（例如200?400 y 1) 中，并且将该溶液施加至支架来实现。
[0018] 在制备可移植的球体中所使用的多糖支架可为在组织工程领域中已经描述过的 作为基质的任何多糖材料，细胞能够附着至该基质。优选地，多糖支架在性质上是高度多孔 性的，从而在孔隙中为球体形成提供有利的微环境。根据本发明的待使用的支架由在温和 条件下能够溶解的材料组成，该温和条件不会对已在支架的表面上和/或支架的孔内形成 的球体的存活率和结构完整性产生不利的影响。合适的材料包括常见的胶凝剂，例如藻酸 盐、琼脂、角叉菜胶、经加工的牒麟藻（euchema seaweed)、刺槐豆胶、瓜尔胶、黄著胶、阿拉 伯胶、黄原胶、培拉胶、结冷胶、果胶和纤维素（例如甲基纤维素）。也可使用在温和条件下 能够溶解的其它多糖。
[0019] 在特别优选的实施方式中，用于培养本发明的肝细胞球体的支架包括藻酸盐或 由藻酸盐组成。如本文所使用的，藻酸盐是指杂多糖藻酸的盐或醋，杂多糖藻酸的醋是由 目（1-4) D-甘露糖酵酸和a (1-4化-古洛糖酵酸的重复单元组成。支架可包括例如藻酸的 轴盐、钟盐、巧盐或馈盐，或由例如藻酸的轴盐、钟盐、巧盐或馈盐组成。用于组织工程的藻 酸盐支架是可商购的，例如英杰公司（卡尔斯己德（Carlsbad),美国）的Algi-Matrix?3D 培养系统。
[0020] 在允许肝细胞球体形成的环境中，后续培养已经被接种到支架上的分离的肝细 胞。具体地，将使用适于使人类肝细胞生长的培养基。适于人类肝细胞需求的细胞培养基 是本领域已知的，并且包括例如威廉姆斯介质E (Wi 11 iams'Medium E)(英杰公司，卡尔斯己 德，美国）、肝细胞培养基化巧atowte ^lture Medium)炬D Bioscience (抓生命科学），海 德尔堡，德国）、Basal HepaRG medium(基础 HepaRG 介质）（3H Biomedical AB (3H 生物医 学AB),乌普萨拉，瑞典）、HBM基础介质（Lonza Cologne GmbH,科隆，德国）或Hepatocyte Basal Medium(干细胞基础介质）（United States Biological (美国生物），斯瓦姆斯科 特，美国）。介质可补充有进一步的化合物诸如生长因子、缓冲液、抗生素等，W最优化在具 体支架上的球体形成。
[0021] 例如，已经证实尤其有用的培养基是补充有下列成分的Williams' Medium E : 200mM低内毒素心丙氨醜A-谷氨醜胺炬ioc虹om(柏檐公司），柏林，德国）、1M肥PES缓冲 液炬io-c虹om)、100mM丙丽酸轴（英杰公司）、4]ig/mL膜岛素（英杰公司）、5nM地塞米松 (Sigma-Al化ich (西格玛-奧德里奇），圣路易斯（St. Louis)，密苏里州（MO))、1化g/mL表 皮生长因子（英杰公司）、lOng/mL重组人类血小板生长素（Cell Systems (细胞系统），圣 凯特莉，德国）、IOng/血重组人类肝细胞生长因子炬achem(己亨公司），普鲁±王，美国）、 10%热灭活的胎牛血清（英杰公司）W及1 %青霉素/链霉素（英杰公司）。在下面实施 例中使用的培养基已经在Bierwolf 等人.（2011)，Biotechnol Bioeng. ;108(1) :141-50 中 进行了描述。
[0022] 能够在支架上培养肝细胞中使用的另一培养基为补充有下列成分的无血清的 Williams' E medium(无1-谷氨醜胺）；2mM N-己醜-k谷氨醜胺炬ioc虹om)、20mM 4-(2-轻己基）-1-脈嗦己賴酸缓冲液炬;[0(3虹0111)、411肖/1111^膜岛素佑比(306化）、11111丙丽 酸轴（Gibco B化)、5nM地塞米松（Sigma(西格玛），圣路易斯，美国）、10ng/mL表皮生长因 子（Gibco B化）和1%青霉素/链霉素炬ioc虹om)。
[0023] 可在约5% C〇2和95%空气的潮湿气氛中，在赔育箱中W静态条件赔育支架。支架 可在3(TC至4(TC之间的温度，优选在33 C至38 C之间的温度下，更优选37 C在进行培养。 细胞培养持续1至21天，优选3至10天，并且更优选5至7天的时段。
[0024] 或者，经接种的支架也可培养在循环生物反应器中。为了使肝细胞暴露于循环的 介质流，经接种的支架被固定在垂直于流动向量（flow vector)的Cellmax Quad流动模件 中（参见 Torok 等人.（2011), Liver Transplantation 17:104-114)。例如，可使用 10 ? 40mL/分钟，例如24mL/分钟的脉动培养基流。在整个培养时段中，每隔一天应当更换H分 之二体积的再循环培养基。技术人员能够容易地确定替代的培养条件，该替代的培养条件 可用于使接种在支架上的肝细胞生长为H维肝细胞球体。
[00巧]在支架上的肝细胞球体已经达到其预定的尺寸和分化状态之后，使支架溶 解W将球体释放到培养基中。溶解支架的时间点将根据所使用的特定培养条件和球 体的期望尺寸和分化状态而发生变动。例如通过电子显微镜定期检查球体，能够监 测球体的分化状态。用于溶解支架的特定程序取决于已经用于培养肝细胞的支架材 料。在本发明的一个实施方式中，将酶加入至支架，其中酶降解支架同时不会对球体产 生影响。已经描述了许多特异性降解多糖的酶，其中多糖诸如黄原胶化ashimoto等 人.（2003)，J Biol Chem, 278 巧）：7663-73)、琼脂（Leon 等人.（1992) ,Appl and Environ Microbiology 58 (12): 4060-4063)、纤维素（Lynd 等人.（2002) ,Microbiol Mol Biol Rev, 66 (3) :506-77)、果胶炬Ianco 等人.（1999)，阳MS Microbiol Lett, 175 (I) :^9)等。
[0026] 当多糖支架由藻酸盐组成时，优选通过加入馨合剂，诸如巧樣酸盐或邸TA来使其 溶解。藻酸盐需要二价阳离子，诸如Ca"来维持其聚合结构。通过馨合剂诸如邸TA来夺 去阳离子，从而导致藻酸盐发生降解。例如，如果使用英杰公司的Algi-Matrix?3D培养系 统，根据制造商的建议，可使用含巧樣酸轴的溶解缓冲液或含维尔帰（versene)的溶解缓 冲液。在适当量的含巧樣酸或含维尔帰的缓冲液的存在下，将支架赔育5?30分钟，直至 支架完全溶解且球体完全释放到周围介质中。通过溶解步骤得到的球体没有在培养步骤中 用于环绕它们的藻酸盐支架。
[0027] 通常，在溶解期间应当小也不要损坏已经在多糖支架的表面上生长的肝细胞聚集 体。应当确保在不影响组织样肝细胞球体的完整性和代谢功能的情况下来溶解支架材料。 例如，当通过在培养基中加入巧樣酸盐来溶解支架材料时，巧樣酸盐的浓度不能如此之高， W至于使得附着在支架材料上的肝细胞被裂解。对于技术人员来说，可利用本领域已知的 几种方法来评估肝细胞的存活率。如下文实施例3中所述，例如可W确定从受损细胞中释 放的乳酸脱氨酶（LDH)来确定细胞存活率，并且筛选用于溶解承载支架的试剂所引起的毒 性效应。
[0028] 在承载物被溶解之后，通过使球体与培养基分离而收获息浮在溶液中的球体。例 如通过W 200 X g离也3?5分钟来收获球体。或者，通过过滤材料进行过滤也可收获球体， 该过滤材料的孔径保留直径至少为50、100或150 y m的细胞聚集体。可选地，收获的球体 可被洗涂一次或多次W移除任何不需要的物质，该些不需要的物质可能干扰所需的下游应 用，例如移植。例如，球体可经肝细胞洗涂介质化巧atocyte Wash Medium)(英杰公司，卡 尔斯己德，美国）洗涂，W移除细胞碎片或用于溶解承载物的物质，诸如酶等。收获的球体 可直接被移植到受体中或用于体外研究，或它们可在液氮中被急速冷冻并储存在-8(TC下 直至下次使用。
[0029] 在进一步的方面中，本发明涉及能够通过上述方法获得的人类原代肝细胞的分离 的球体。优选地，通过W下步骤得到人类原代肝细胞的分离的球体：
[0030] (a)在允许肝细胞球体形成的条件下，在藻酸盐支架上培养人类原代肝细胞；
[0031] (b)优选通过加入馨合剂，诸如巧樣酸盐或邸TA使所述藻酸盐支架溶解W释放所 述肝细胞球体；
[0032] (C)优选通过过滤或离也使所述肝细胞球体与培养基分离。
[0033] 通过上述方法得到的球体优选用于如本文其它部分所述的肝脏细胞移植的方法 中。
[0034] 在又一进一步的方面中，本发明涉及培养的人类原代肝细胞的分离的肝细胞球 体，其中，所述球体不含有任何人造支架材料。该就意味着，球体并未附着至人造支架材料 或不与人造支架材料相关联，其中人造支架材料通常应用在组织工程领域中，诸如藻酸盐、 化LA等。如本文所使用的，人造支架材料是指在天然肝脏组织中不存在的合成基质。该术 语并不意味着包含例如天然存在的细胞外基质。
[0035] 本发明的肝细胞球体显示出了保存良好的肝脏细胞特异性的功能和形态。例如， 通过检测闭锁小带蛋白1狂〇-1)证实球体内的肝细胞功能性地彼此附着。Zo-I是紧密连接 的标记物，用于表明在肝脏内相邻肝细胞之间胆小管的形成。在优选的实施方式中，相邻肝 细胞之间的胆小管存在于本发明提供的球体内的至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或 更多的肝细胞中。
[0036] 与通过培养由已建立的细胞系得到的细胞所提供的细胞聚集体不同，本发明的球 体包括高度分化的肝细胞或由高度分化的肝细胞组成，该高度分化的肝细胞显示出优良的 代谢特性，该表明肝细胞维持天然肝脏组织的解毒功能。例如，球体保持产生人类白蛋白和 a 1-抗膜蛋白酶的能力。在本发明的一个优选实施方式中，当在相同条件下进行测试时，例 如在下文中实施例5所述的化ISA测定中或在基于核酸的检测测定中（例如定量RT-PCR)， 球体肝细胞中人类a 1-抗膜蛋白酶的生成量是在新鲜分离的人类原代肝细胞中确定的生 成量的至少50 %，更优选60 %、70 %、80 %、90 %或甚至高达95 %或更多。相似地，在本发明 的球体肝细胞中人类白蛋白的生成量是在相同条件下测试的新鲜分离的人类原代肝细胞 所确定的生成量的至少50%，更优选至少60%、70%、80%、90%或甚至高达95%或更多。 用于确定肝细胞中人类白蛋白生成量的方法例如在下文实施例4中所描述的。然而，也可 使用其它测试法来测量白蛋白的表达，例如定量RT-PCR。
[0037] 本发明提供的分离的球体尤其适用于医学领域，优选移植医学领域中。现有技术 中描述的肝细胞植入方法通常与在大多数肝脏疾病中实现的低细胞植入率和边际效应相 关联。本发明提供的球体的移植产生高度功能性的组织，该高度功能性的组织快速整合到 受体肝脏中。因此，作为单细胞的替代，细胞球体的移植改进了在受体肝脏中的植入率和增 殖率。
[0038] 如下文中的实施例所示，来自患有代谢性肝脏疾病的H名供体的肝脏的肝细胞用 于在藻酸盐支架上进行H维细胞培养。在培养3天后，观察到球体的形成，并且在第7天，观 察到接近它们最大直径近100 y m的球体。进行免疫组化研究，W检验支架孔隙内细胞与细 胞的相互作用和再组织，或新组织的再生。该些研究反映了在藻酸盐支架上培养的肝细胞 球体建立了精细结构，通过CK18免疫英光染色证实该精细结构为典型的肝脏组织。此外， 通过毒伞素（Phalloidin)标记的肌动蛋白纤维的检测和Zo-I的阳性染色反映了胆小管的 再形成和双极性配置（参见实施例7)。极性细胞和膜结构的保存对于胆汁分泌和异型生物 质的消除是必不可少的。此外，肝细胞特异性的转录因子HNF-4的阳性核染色证实在新肝 脏组织内存在高度分化的细胞（参见实施例7)。进一步地，实时（real time)-PCR研究提 供了该样的证据；在藻酸盐支架上培养的球体由高度分化的肝细胞构成，但观察到与天然 组织相比具有表达的损失。总而言之，该些结果证实根据本发明得到的球体高度适用于替 换和/或补充病变的肝脏组织。
[0039] 本发明提供的球体具有至少50、100或150 U m的直径。通过改变培养时间能够调 整球体的尺寸。在下文实施例中所使用的条件下，在7天的培养时间之后，得到尺寸约为 100?150 y m的球体。如果特定移植需要小于100 y m的肝细胞聚集体，能够容易地缩短培 养时间，例如缩短至3?4天。优选地，移植到受体中的球体的尺寸应不超过150 y m，从而 最大限度地降低口脉形成血栓和供体细胞进入肺形成栓塞的风险。
[0040] 由于它们能够整合到肝脏组织中并且提供肝脏组织功能，本发明的分离的球体 尤其适用于治疗患者的肝脏疾病的方法。本文中所使用的术语"肝脏疾病"是W肝脏的 功能受损为特征的多种症状。能够通过本发明的肝细胞球体的移植进行治疗的肝脏疾病 包括但不限于：甲型肝炎、己型肝炎和丙型肝炎，肝硬化，a 1-抗膜蛋白酶缺乏症，威尔 森氏症，血色沉着病，胆道梗阻，糖原胆积病，幼童中的瑞氏综合症化eye's syn化ome in young Chil化en)，遗传性酪氨酸血症I型，寄生物感染，原发性硬化性胆管炎，继发性硬化 性胆管炎，慢性布加氏综合症（C虹onic Budd化iari syn化ome)，多囊肝脏疾病，草酸过 多症（primary oxalosis),尿素循环障碍，线粒体耗竭综合症，艾欧吉勒综合征（Alagille syn化ome)，克里格勒-纳贾尔综合症把Tigler-Naj jar syn化ome)，原发家族性肝内胆汁 齡积症，新生儿肝炎，胆道闭锁，暴发性肝功能衰竭，酒精性肝硬化，自身免疫性肝炎，重叠 综合症，由于对己醜氨基酷、毒伞素或其它药剂引起的肝中毒。
[0041] 本发明的肝细胞球体的移植可W不同的方式来实现，例如，通过移植到脾或膜腺 中，或例如经由口脉输注直接引入到肝脏中。
[0042] 如本文其它部分所概述的，尤其优选肝细胞球体源自患者自身的原代肝细胞。该 意味着原代肝细胞采自于受试者的肝脏W制备H维肝细胞球体，并且离体培养的球体随后 被移植回同一患者中。在该方式中，能够避免受体的免疫系统对移植的肝细胞球体的排斥。
[0043] 本发明的另一具体优点是能够将高质量肝细胞聚集体的可用性延长若干天。在常 规细胞移植方法中，在从供体器官移除原代肝细胞时，可能没有适当的患者来立即接受该 细胞。在本领域中已经表明了人类肝细胞的低温储藏会损害细胞质量W及细胞到肝脏组织 中的成功植入。根据本发明的方法，将分离的原代肝细胞培养几天，而其代谢功能没有任何 显著的损失，从而将高度功能化的细胞的可用性延长至移除原代肝细胞后的7天、10天或 甚至更长。或者，本发明的球体也可在液氮中冷冻且在-2(TC至-8(TC之间的温度下储藏直 至用于移植。
[0044] 因此，本发明还涉及一种将培养的人类肝细胞的肝细胞球体移植到有需要的受体 中的方法，所述方法包括：
[0045] (a)在允许肝细胞球体形成的条件下，在多糖支架上培养分离的人类原代肝细 胞；
[0046] 化）使所述多糖支架溶解W释放所述肝细胞球体；
[0047] (C)使所述肝细胞球体与培养基分离，W及
[0048] (d)将从上述步骤（C)得到的肝细胞球体移植到受体中。
[0049] 需要该种移植的受体优选为患有一种上述提及的肝脏疾病的受试者。
[0050] 与本发明的肝细胞球体相关的另一优点是能够从患有肝脏疾病的患者中得到原 代肝细胞，该肝脏疾病是由单一基因缺陷引起的。例如，代谢性肝脏疾病可能基于单一基因 缺陷，而肝脏的其它功能正常。在该些情况下，在基因治疗方法中能够采用本发明的方法。 具体地说，将异常突变的基因的功能形式插入到从患者得到的原代肝细胞基因组的非特异 性位置或特异性位置中。根据本发明上述的方法，W该方式修饰的肝细胞随后用于制备球 体。在最后的步骤中，球体随后被植入到需要治疗的患者中，该患者优选为从中得到肝细胞 的患者。
[0051] 为了替换引起肝脏疾病的功能障碍基因，将所述基因的完整拷贝克隆到病毒载体 或非病毒载体中。基因将可操作地与启动子元件连接，并且可选地与增强子元件连接W确 保其在肝细胞中的表达。载体通常为病毒载体。用于本发明的合适的病毒载体为重组的DNA 或RNA病毒，更优选为复制缺陷型病毒，并且包含例如脱毒的逆转录病毒、腺病毒、慢病毒， 腺相关病毒（AAV)、疮疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德毕斯病毒（Simlbis virus)、多瘤病毒（诸如猿猴病毒40 (SV40))、人类免疫缺陷病毒化IV)，W及其它病毒。
[0052] 由于腺病毒的转导效率通常比其它病毒高，所W腺病毒是尤其优选的。腺病 毒可为5型人腺病毒（Md5)载体、El-缺失的腺病毒和/或E3-缺失的腺病毒。例如， 能够通过McGrory等人.（1988), Virology 163:614-617中所述的补救重组（rescue recombination)技术来构建腺病毒载体。简而言之，将感兴趣的转基因克隆到穿梭载体中， 该穿梭载体含有启动子、多接头和已经缺失了 E1A/E1B基因的侧翼腺病毒序列。合适的穿 梭载体包含例如质粒"pACr，(McGrory 等人.（1988)，Virology 163:614-617)，质粒"pACl" 编码人类腺病毒5基因组的左端部分，但其中缺少早期蛋白域，该早期蛋白域包括对于病 毒复制必不可少的ElA和ElB序列。其它合适的穿梭质粒为"ACCMVPLPA" (Gomez-Foix等 人.（1992)，J. Biol. Chem. 267:25129-25134)，该"ACCMVPLPA"含有多接头、CMV 启动子和 SV40聚腺巧酸化信号，两侧具有已经缺失E1A/E1B基因的部分腺病毒序列。例如通过脂质 转染或磯酸巧转染，可将穿梭质粒与包括整个人类腺病毒5基因组的质粒一起共转染到合 适的宿主细胞中（例如人类293细胞），该整个人类腺病毒5基因组的长度因太长而不能 被包装。在一些细胞中，会发生穿梭载体和辅助质粒之间的"补救重组"，产生在E1A/E1B基 因的位置处和之前太大而使质粒不能被包装的额外序列的位置处含有感兴趣的基因。其可 通过本领域所熟知的目-半乳糖甘酶/X-半乳糖巧体系来监测。所得到的感兴趣的质粒 将足够小从而能够被包装，但是具有复制缺陷（参见，例如Giordano等人.（1996),化化re Medicine 2:5:34-539)。
[0053] 重组病毒载体可根据标准技术被瞻斑纯化（plaque-purified)。例如，重组腺病毒 载体可在人类293细胞（反式（in trans)提供ElA和ElB功能）中繁殖至在IO7?10" 病毒微粒/mL范围中的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法诸如琼脂糖 柱来脱盐，并且通过后续过滤来纯化。纯化降低了对将给予载体的受试者的潜在毒害效应。 给予的病毒基本上不含有野生型和有复制能力的病毒。通过合适的方法诸如PCR扩增可证 明病毒的纯度。
[0054] 非病毒表达载体也可用于将功能性AGAT基因引入到人类受试者中。合适的表 达载体允许AGAT基因在祀细胞中的体内表达。非病毒表达载体的实例包含载体诸如 cage(笼）载体（Niwa 等人.（1991)，Gene, 108:193-200)、地K-CMV、pcDNA3. UpZeoSV(英 杰公司，Stratagene)。该些载体例如可通过直接注入或非侵入性导管或注射器方法来给 予。或者，在离体方法中可使用载体构建体来转染祀细胞，该祀细胞例如通过活组织检查方 法已经从受试者中移出。随后，该细胞可被植入到受试者中或被给予受试者，该受试者优选 为从中得到该些细胞的受试者。用于将非病毒载体转移到祀细胞中的合适方法例如为脂 质转染方法、磯酸巧共沉淀方法、DEAE-右旋糖酢方法和利用微玻璃管的直接DNA引入方法 等。在引入载体之前，肝细胞可用透化剂来处理，诸如磯脂醜胆碱、链球菌溶血素、癸酸轴、 癸醜肉碱、酒石酸，溶血卵磯脂、Triton X-IOO等。
[0055] 在现有技术中已经证实了通过基因疗法能够成功治疗肝脏疾病。例如，Grossmann 等人（1994)，化t Genet 6, 335描述了基因治疗家族性高胆固醇血症的离体方法。简而言 之，将自身肝细胞移植到患有该疾病的患者中，该自身肝细胞已经用携带LDL受体的重组 逆转录病毒进行了基因学纠正。患者对该程序的耐受良好，并且在该疗法之后的4个月对 肝脏组织的分析显示了转基因表达细胞植入的证据。患者的LDL/皿L比率从基因治疗前的 10?13下降至基因疗法后的5?8,并且该些改进稳定地保持超过18个月。能够通过基 因疗法治愈的另一疾病为先天鸟氨酸转氨甲醜酶缺乏症（OTCD)，一种由编码鸟氨酸转氨甲 醜酶的基因中存在多个不同突变而导致的罕见的尿素循环障碍。
[0056] 根据进一步的方面，本发明的肝细胞球体也可用于毒性研究中。例如，球体将有助 于评估化合物（诸如候选药物）的肝毒性。为此目的，可W在与候选药物给予患者体内后的 体内环境相对应的浓度和条件下，使候选药物与本发明的肝细胞球体相接触。通常，候选药 物将与H维球体相接触并且赔育预定的赔育时间，例如约1?24小时。在使球体与候选药 物相接触之后，可测量一种或多种肝脏特异性因子或参数，诸如HNF-4转录因子的表达和/ 或a 1-抗膜蛋白酶的表达。将测量结果与未与候选药物相接触的球体对照的测量结果进 行比较。肝脏特异性因子表达的任何降低都可表明候选药物可能具有肝毒性。由于肝毒性 通常来自于两种或多种不同药物之间的相互作用，本发明的球体可进一步用于研究候选药 物与其它已知药物的组合。
[0057] 在另一方面，从病变肝脏组织制备的球体也能便利地用作药物筛选测定中的模型 体系，W分析候选药物在治愈或缓解相应疾病的症状的疗效。

【专利附图】

【附图说明】
[005引图1示出通过DNA含量来衡量的肝细胞在14天培养期间的损失（图1A)，和通过 受损细胞所释放的LDH来衡量的肝细胞在14天培养期间的损失（图1B)。
[0059] 图2示出测量在藻酸盐支架上培养的球体的上清液中不同肝细胞因子的结果。图 2A描述了 W绝对值表示的人类白蛋白的浓度；而图2B示出了人类白蛋白相对于每一支架 DNA含量的浓度。图2C示出了 Ql-抗膜蛋白酶的浓度。图2D示出Ql-抗膜蛋白酶相对 于每一支架DNA含量的浓度。图2E示出了尿素的生成量。图2F示出了尿素相对于每一支 架DNA含量的生成量。
[0060] 图3示出了与天然组织和新鲜分离的细胞相比，通过实时-PCR确定的在藻酸盐支 架上培养的肝细胞的基因表达结果。1 =分离之前的组织；2 =分离后的细胞；3 =培养1 天后；4 =培养7天后；5 =培养14天后。
[006。 图4示出了在移植到鼠科动物的肝脏中之后，通过实时-PCR确定的本发明的肝细 胞球体的基因表达。1 =天然肝脏组织；2 =分离后的原代肝细胞；3 =培养1天后；4 =培 养7天后；5 =移植入到小鼠中后8周。

【具体实施方式】
[006引本研究是由Arz化kammer汉堡（Hamburg)委员会根据国家指导方针和1975赫尔 辛基宣言值eclaration Of Helsinki)批准。该研究是在收到来自每位患者的父母书写的 知情同意书之后进行。
[0063] 连施例1 :原代肝细胞的分离
[0064] 从患有代谢性疾病的3名个体的肝脏中分离原代人类肝细胞，该3名个体经历过 肝脏移植。两名患者经受尿素循环障碍的折磨，而一名患者患有原发性草酸过多症。表1 中示出了关于供体数据的更多细节。
[0065]

【权利要求】
1. 一种培养的人类原代肝细胞的分离的肝细胞球体，其中，所述球体没有任何人造支 架材料。
2. 根据权利要求1所述的分离的球体，其中，人类α?-抗胰蛋白酶在所述球体的肝细 胞中的生成量为在新鲜分离的人类原代肝细胞中所确定的生成量的至少50%。
3. 根据权利要求1至2中任一项所述的分离的球体，其中，人类白蛋白在所述球体的肝 细胞中的生成量为在新鲜分离的人类原代肝细胞中所确定的生成量的至少50%。
4. 根据权利要求1至2中任一项所述的分离的球体，其中，在相邻肝细胞之间的胆小管 存在于所述球体中的至少50%的肝细胞中。
5. 根据权利要求1至2中任一项所述的分离的球体，其中，所述球体具有至少50 μ m的 直径。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的分离的球体用于肝脏细胞移植医学中。
7. 根据权利要求1至5中任一项所述的分离的球体用于治疗患者的肝脏疾病的方法 中。
8. 根据权利要求7所述的分离的球体，其中，所述肝脏疾病选自由甲型肝炎、乙型肝炎 和丙型肝炎，肝硬化，α 1-抗胰蛋白酶缺乏症，威尔森氏症，血色沉着病，胆道梗阻，糖原贮 积病，幼童中的瑞氏综合症，I型遗传性酪氨酸血症，寄生物感染，原发性硬化性胆管炎，继 发性硬化性胆管炎，慢性布加氏综合症，多囊肝脏疾病，草酸过多症，尿素循环障碍，线粒体 耗竭综合症，艾欧吉勒综合征，克里格勒-纳贾尔综合症，原发家族性肝内胆汁淤积症，新 生儿肝炎，胆道闭锁，暴发性肝功能衰竭，酒精性肝硬化，自身免疫性肝炎，重叠综合症，由 对乙酰氨基酚、毒伞素或其它药剂引起的肝中毒所组成的组。
9. 根据权利要求8所述的分离的球体，其中，所述球体源自于患者自身的原代肝细胞。
10. -种用于制备人类原代肝细胞的球体的方法，包括以下步骤： (a) 在允许肝细胞球体形成的条件下，在多糖支架上培养分离的人类原代肝细胞； (b) 使所述多糖支架溶解以释放所述肝细胞球体；以及 (c) 使所述肝细胞球体与培养基分离。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述多糖支架是藻酸盐支架。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤（b)中，通过加入柠檬酸或EDTA使所述 藻酸盐支架溶解。
13. 根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中，在步骤（d)中，分离所述肝细胞 球体包括过滤和/或离心。
14. 根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中，在步骤（a)中，所述培养进行7 天至14天。
15. -种能通过权利要求10至14中任一项所述的方法得到的人类原代肝细胞的分离 的肝细胞球体。
16. 权利要求1至9或权利要求15中任一项所述的分离的肝细胞球体在体外肝毒性研 究或药物筛选测定中的应用。
【文档编号】A61K35/407GK104302762SQ201280069227
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月16日
【发明者】约格·马蒂亚斯·波洛克, 珍妮特·彼尔沃尔夫 申请人:思维斯克公司