中药复方药物组合物的新用途
【专利摘要】本发明公开了含有下述重量配比的原料药在制备提高母胎免疫耐受的药物中的用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份、川牛膝1-16份、龟板胶1-16份。本发明补肾复方左归丸可以提高母体的母胎免疫耐受性，有望治疗母胎免疫失衡导致的习惯性流产、妊高征、IUGR等病理性妊娠，临床应用前景良好。
【专利说明】中药复方药物组合物的新用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种中药复方药物组合物的新用途，具体地，是在制备提高母胎免疫 耐受的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 妊娠是一个复杂的生理过程。从免疫学角度看，带有父方抗原的胎儿及其附属物 类似半异体移植物，将引致母体免疫系统对其进行免疫识别及应答；从妊娠结局来看，又与 移植不同，母体对胎儿存在免疫耐受，即母胎免疫耐受，使胎儿不致被排斥。母胎免疫耐受 对于成功妊娠十分重要，一旦母胎免疫失衡，将发生习惯性流产、妊高征、IUGR等病理性妊 娠。
[0003] 传统上人们普遍认为，任何细胞膜上都有MHC- I作为其表面标志，MHC-I反映了 细胞内部的基因构成。然而研究进展，母胎免疫耐受的机制是直接接触母血液及免疫系统 的胎儿滋养细胞，表面却不表达反映细胞内部基因构成的MHC- I抗原，而是表达不具备多 态性的HLA-G。
[0004] HLA-G，人白细胞抗原-G (human leucocyte antigen-G)，其与 M HC-I 有相似的结 构域功能，但是其在不同物种见具有高度同型特征，因此母体NK细胞不能识别表达了此抗 原的滋养细胞，故对胎儿胎盘不具备杀伤力。此外，HLA-G还有免疫趋化作用，这种作用在 胎儿发育中起到关键作用。对HLA-G的识别导致母体免疫细胞释放特定的化学信号，这些 信号对妊娠期免疫系统进行调。研究发现。在体外受精时，排卵前可溶性HLA-G水平过低 与早期流产有关；另外，HLA-G在正常妊娠的滋养细胞上表达增加，而在先兆子痫患者的胎 盘中则减少或缺乏。换句话说，HLA-G表达水平是反应机体母胎免疫耐受情况的重要指标， 可以通过检测HLA-G表达水平的变化来判断机体母胎免疫耐受情况。
[0005] 此外，研究发现，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF)受体超家族Fas/ FasL、卩引哚胺 2, 3-二氧化酶（indoleamine 2, 3-dioxygenase, IDO)、α V β 3 也在母胎免疫 耐受中具有关键作用，它们的表达水平可以反应机体母胎免疫耐受情况。
【发明内容】
[0006] 本发明的技术方案是提供了中药复方药物组合物的新用途。具体地，是在制备提 高母胎免疫耐受的药物中的用途。
[0007] 本发明提供了含有下述重量配比的原料药在制备提高母胎免疫耐受的药物中的 用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶 8-16份、川牛膝1-16份、龟板胶1-16份。
[0008] 所述原料药的重量配比如下：熟地为24份、山茱萸为9-12份、山药为12份、枸杞 子为9-12份、菟丝子为12份、鹿角胶为12份、川牛膝9份、龟板胶12份。
[0009] 所述原料药的重量配比如下：熟地为24份、山茱萸为12份、山药为12份、枸杞子 为12份、菟丝子为12份、鹿角胶为12份、川牛膝9份、龟板胶12份。
[0010] 所述药物是以前述组合物为活性成分，加上药物上可接受的辅料或者辅助性成分 制备而成的制剂。
[0011] 所述的制剂是口服制剂。
[0012] 所述的口服制剂是颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊剂、片剂或口服液。
[0013] 本发明补肾复方左归丸可以上调HLA-G、Fas/FasL、IDO和α V β3基因的表达，表 明其具有提高母体的母胎免疫耐受性的作用，可以制备成提高母胎免疫耐受的药物，有望 治疗母胎免疫失衡导致的习惯性流产、妊高征、IUGR等病理性妊娠，临床应用前景良好。
[0014] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0015] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1左归丸含药血清组、阳性对照组及空白组中各种基因转录表达情况；纵坐标 为2 Λet，其中与"表示两组比较P < 0. 05 ;
[0017] 图2左归丸含药血清组、阳性对照组及空白组中各种基因转录表达情况；纵坐标 为2Aet，其中与"表示两组比较P < 0.05 ;
[0018] 图3为5%浓度的含药血清各基因时间梯度表达情况，横坐标为基因，纵坐标为 2Aet，其中与"_"表示两组比较P < 0.05 ;
[0019] 图4左归丸含药血清组、阳性对照组及空白组中α V β 3蛋白表达情况；纵坐标 为ng/mg prot，其中与表示两组比较P < 0· 05 ;
[0020] 图5左归丸含药血清组、阳性对照组及空白组中HLA-G蛋白表达情况；纵坐标为 ng/mg prot，其中与表示两组比较P < 0· 05 ;
[0021] 图6 5%浓度的含药血清α V β 3蛋白表达的时间梯度情况；横坐标为时间，纵坐 标为ng/mg prot，其中与"表示两组比较P < 0· 05 ;
[0022] 图7 5%浓度的含药血清HLA-G蛋白表达的时间梯度情况横坐标为时间，纵坐标 为ng/mg prot，其中与表示两组比较P < 0· 05 ;
【具体实施方式】
[0023] 实施例1本发明药物组合物的制备（左归丸）
[0024] 称取原料：熟地黄200g、菟丝子100g、牛膝75g、龟板胶100g、鹿角胶100g、山药 100g、山茱萸100g、枸杞子IOOg ;
[0025] 制备方法：以上八味，除鹿角胶、龟板胶外，其余熟地黄等六味粉碎成细粉，过筛混 匀。取鹿角胶、龟板胶烊化，与上述细粉混匀。每l〇〇g粉末加炼蜜IOg与适量的水，泛丸， 干燥，即得；或不加蜜，仅为粉末散剂；或取粉末，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成 分制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液。
[0026] 实施例2本发明药物组合物的制备
[0027] 称取原料：熟地黄18g、菟丝子8g、牛膝lg、龟板胶lg、鹿角胶8g、山药8g、山茱萸 9g、枸杞子9g ;
[0028] 按照实施例1的方法制备。
[0029] 实施例3本发明药物组合物的制备
[0030] 称取原料：熟地黄30g、宽丝子12g、牛膝16g、龟板胶16g、鹿角胶16g、山药16g、山 茱萸12g、枸杞子16g ;
[0031] 按照实施例1的方法制备。
[0032] 上述原料可以用原生药,也可以用原生药的炮制品。
[0033] 以下是通过药效实验及临床实验证明本发明的有益效果。
[0034] 实验例1本发明补肾复方上调母胎免疫耐受相关基因的表达
[0035] 1、实验材料
[0036] 1 材料
[0037] I. 1标本来源标本来自2013年10月至2014年4月在成都中医药大学附属医院孕 5?10周行人工流产术的正常妊娠妇女的孕早期绒毛组织。
[0038] 1. 2实验仪器细胞培养箱（Thermo公司，3111型），电热恒温水浴箱（上海医疗七 厂），倒置显微镜（Leica 公司，DMI3000B型），酶标仪（Thermo 公司，Multiskan spectrum)， 定量PCR仪（Bio-Rad公司，CFX96)，内切式组织匀浆器（ART-MICCRA)，紫外分光光度仪 (BECKMAN)〇
[0039] 1. 3试剂及引物RPMI1640培养液、胎牛血清、I型胶原酶、EDTA、双 抗（Gibco-BRL，MD, USA);无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷（成都科龙化工试剂厂）； Diagnostic Kit for Human leukocyte antigen G(HLA-G)(ELISA)(Sichuan xinchuang Biotech co.，CTD) ;Human Total Integrina v 0 3ELISA(R&D Systems, Catalog No.DYC30502,USA) ； Trizol? reagents(Macherey-Nagel,15596-026) ；iScript cDNA Synthesis Kit (BI0-RAD，Lot :170-8891) ;Q-PCR 分析试剂盒（Roche 公司，FastStart Universal SYBR Green Master(ROX));引物（上海捷瑞生物工程有限公司、英潍捷基贸易 有限公司）（表1为引物序列）等。
[0040] 2 方法
[0041] 2. 1绒毛组织培养手术前将负压吸引瓶等手术器械高压灭菌，取材后，用PBS洗涤 绒毛组织随即放入RPMI1640培养液（青链霉素：100U/ml)中。在显微镜下除去血凝块等 杂质，挑选绒毛短、分支多、有微绒毛的部分，PBS清洗，置平皿中剪成糜状，加入2mg/ml I 型胶原酶（0. 02% EDTA)水浴消化10-20min，用等体积RPMI1640培养液（10%胎牛血清） 终止消化，l〇〇〇rpm/min，离心3min,弃上清。如此漂洗1?2次，加入少量完全培养液，制 成组织细胞悬液，按5块/cm2的浓度接种于24孔板中，37°C、5% C02培养，24h后补足培 养液，此后每3d换液一次，每天镜下显微观察。
[0042] 2. 2左归丸含药血清的制备
[0043] 将10只体重均一、雌雄各半的大鼠在予左归丸灌服，给药剂量均为5. 0g/kg， 给药容量均为20ml/kg。于给药后30min、60min、90min眼底静脉丛取血，血液静置2h， 3000rpm离心IOmin,分离不同时间段血清，将3个时间段的血清混勻，高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析血清，过滤除菌备用。
[0044] 2. 3左归丸含药血清处理绒毛组织①组织培养5天后进行分组实验，即浓度为 的左归丸含药血清组，阳性对照组（control组，即孕酮：1000ng/ml)和空白 组（blank组，即无 FBS的RPMI1640培养基），进行连续处理72h ;③检测获得高表达的含药 血清组，进行时间梯度（24h、48h、72h)的筛选，检测方法同前。以上实验分组均设3个复孔 并重复实验2次。
[0045] 2. 4绒毛组织中相关基因表达的检测弃各组上清，提取相关孔组织的总RNA，经紫 外分光光度仪定量并检测其纯度（A260/A280均在1. 8?2. 0之间），立即合成cDNA，最后 以cDNA为模板，利用Sybr Green Qpcr试剂进行实时荧光定量PCR分析以测子宫内膜容受 性及母胎免疫耐受相关基因的转录表达水平。检测基因为a Vi33、HLA-G、Fas/FasL、IDO， 内参基因为人β -Actin。针对上述基因的检测引物采用软件PrimerExpress3. 0设计，引物 信息如表1。
[0046] 2. 5绒毛组织中α V β 3和HLA-G基因蛋白表达的检测用PBS收集各组绒毛组织， 加入1%蛋白酶抑制剂，利用组织勻楽器进行勻楽后，1000rpm/min，离心IOmin,吸取上清， 采用ELISA法检测各组上清中α V β3、HLA-G蛋白表达，严格按照α V β3、HLA-G试剂盒 说明书的实验步骤进行，用全自动酶标仪在450nm处读取OD值，获得α νβ3、HLA-G的浓 度；双缩脲法则按照总蛋白测定试剂盒说明书操作，酶标仪于562nm处检测其总蛋白浓度。 计算α V i33、HLA_G蛋白与组织总蛋白的比值，如此获得α V i33、HLA_G的实际蛋白含量。
[0047] 2. 6数据分析实验数据均采用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果以X ±s表示， 各组间两样本均数比较采用独立样本t检验，P < 0. 05则为具有统计学意义。
[0048] 表1针对不同子宫内膜容受性及母胎免疫耐受相关基因的Qpcr引物
[0049]
【权利要求】
1. 含有下述重量配比的原料药在制备提高母胎免疫耐受的药物中的用途：熟地18-30 份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份、川牛膝 1-16份、龟板胶1-16份。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述原料药的重量配比如下：熟地为24 份、山茱萸为9-12份、山药为12份、枸杞子为9-12份、菟丝子为12份、鹿角胶为12份、川 牛膝9份、龟板胶12份。
3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述原料药的重量配比如下：熟地为24 份、山茱萸为12份、山药为12份、枸杞子为12份、菟丝子为12份、鹿角胶为12份、川牛膝 9份、龟板胶12份。
4. 根据权利要求1?3任意一项所述的用途，其特征在于：所述药物是以权利要求1? 3任意一项所述组合物为活性成分，加上药物上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的 制剂。
5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的制剂是口服制剂。
6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的口服制剂是颗粒剂、散剂、丸剂、胶 囊剂、片剂或口服液。
【文档编号】A61K36/8945GK104352711SQ201410549398
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】陆华, 梁丽梅, 刘芊辰, 刘志斌 申请人:成都中医药大学