本发明涉及兽用生物制品
技术领域：
，进一步涉及兽用生物制品的制剂技术，具体涉及一种I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂的制备方法。
背景技术：
：鸭病毒性肝炎(DuckVirusHepatitis，DVH)是由小RNA病毒科肠病毒属的鸭肝炎病毒(DuckHepatitisVirus，DHV)引起雏鸭的一种急性、高度致死性、烈性传染病。鉴于其传染性强、发病较快的临床特征，养殖业中主要以疫苗免疫作为预防手段，若免疫无效的情况下，该病一旦确诊就应当立即对患病个体进行隔离和药物治疗，现有技术中，针对鸭病毒性肝炎的可选药物有限，其中卵黄抗体是一种疗效突出的生物制品。现有技术研究表明，卵黄抗体在鸭病毒性肝炎的治疗中具有突出的技术优势。首先，由于分泌卵黄抗体的免疫应答反应发生于被治疗动物体体外，因此安全性较高；此外，卵黄抗体是机体在抗原刺激下自然生成的混合抗体，因此免疫覆盖范围较大，可应对的抗原血清型相对广泛；另外其产生机理是当机体受到外来抗原刺激后B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，由于IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG，单个卵黄(约15ml)中卵黄抗体含量可高达200mg左右。除了药理作用方面，卵黄抗体在药物稳定性方面也具有一定的优势。首先，其热稳定性、pH稳定性良好，在低于75℃的条件下性质稳定，90℃处理15min后才会出现失活现象；在PH<4时，仅有少量卵黄抗体失去活性，在pH4～12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响。而且，实验表明卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存6个月，4℃保存可达5年以上，活性仅下降5％左右。虽然具有以上技术优势，但目前卵黄抗体药物在剂型方面仍存在制约因素。(1)目前使用的I型鸭肝炎卵黄抗体均为注射制剂，不但使用费时费力,而且无法避免因注射引起的疫病传播与各种严重应激反应(食欲废绝，肌肉坏死，生长受抑等)；(2)目前使用的I型鸭肝炎卵黄抗体注射剂不具有缓释功能，导致其半衰期较短，在疫病高发、频发时需多次使用才可达到效果；(3)目前使用的I型鸭肝炎卵黄抗体均为液体制剂，抗体效价受温度、光照等因素影响较大，导致临床使用中疗效降低。微囊化是固定化技术的一种，是用成膜材料将微观颗粒物包覆于其中的技术方法，可依据膜材料及包覆方法的不同赋予微囊不同的化学特性。由于微囊具有保护作用和选择透过性，因此可掩盖异味和颜色、降低毒性、改善物质的可加工性和稳定性，延长挥发性物质储存时间，延缓或控制囊心的释放，将不可混的化合物隔离等独特的优点，在医药、食品、化工等领域具有广阔的发展前景。然而，作为一项通用性的技术方法，如何应用于具体的技术环境则需要围绕实际情况进行针对性设计，例如，选用何种膜材料才能保证适宜的通透性、所得产物如何保证适宜的缓释性能，选择何种包覆工艺才能保证微囊微观结构的完整性，此外，选用何种剂型、怎样的操作条件等等，均需要依据产物性能要求、被包覆物的微观形态、化学性能、药理特征等条件进行针对性设计。目前，现有技术尚未针对I型鸭肝炎卵黄抗体的具体情况开发出成型的工艺条件。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂的制备方法，以解决现有技术缺乏一种I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂制备方法的技术问题。本发明要解决的另一技术问题是现有技术中I型鸭肝炎卵黄抗体常规制剂疗效较低。本发明要解决的再一技术问题是现有技术中I型鸭肝炎卵黄抗体药物因剂型仅限于注射剂从而导致不良反应较高。本发明要解决的又一技术问题是现有技术中I型鸭肝炎卵黄抗体无法实现缓释特性。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：一种I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂的制备方法，包括以下步骤：1)配制壳聚糖终浓度为0.1～0.3％(w/v)、CaCl2终浓度为0.3～0.7％(w/v)的混合溶液，用醋酸溶液调整所述混合溶液的pH值至3.2～3.8，真空脱气，过滤，取滤液即为成囊溶液；2)取I型鸭肝炎卵黄抗体溶液，向其中加入海藻酸钠至终浓度1.5～2.5％(w/v)；3)将步骤2)所得的抗体溶液与步骤1)所得的成囊溶液以1:(8～12)的比例混合，而后搅拌25～35min；4)将步骤3)所得产物喷雾干燥，即得到所述I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂。作为优选，步骤1)中的过滤是利用500目尼龙膜实现的。作为优选，步骤1)中壳聚糖终浓度为0.1～0.3％(w/v)、CaCl2终浓度为0.3～0.7％(w/v)的混合溶液是通过以下方法配制的：取壳聚糖，用8～12％醋酸溶液溶解，再加纯化水至其中壳聚糖含量0.1～0.3％(w/v)，而后加入CaCl2至其中CaCl2终浓度为0.3～0.7％(w/v)。作为优选，步骤3)包括以下操作：在搅拌条件下将步骤2)所得的抗体溶液滴加至步骤1)所得的成囊溶液中，混合后继续搅拌25～35min。作为优选，步骤2)所述I型鸭肝炎卵黄抗体溶液是通过以下方法制备的：取I型鸭肝炎病灭活疫苗高免鸡蛋，卵黄液经60目尼龙筛过滤后，用胶体磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黄液体积的50℃～56℃，PH4.8～5.2的醋酸缓冲液稀释，搅拌30分钟，再缓慢加入总体积4％的正辛酸搅拌90分钟，用100目滤布过滤过夜，即可得到澄清的抗体溶液。作为优选，所述高免鸡蛋是经I型鸭肝炎病灭活疫苗免疫三次后的鸡所产鸡蛋。作为优选，所述高免鸡蛋的效价高于1:2048。作为优选，所述高免鸡蛋是通过以下方法制备的：用I型鸭肝炎病灭活疫苗免疫120日龄产蛋母鸡，免疫三次，免疫间隔10日；三免后1周取抗体中和效价高于1:2048的鸡蛋即为I型鸭肝炎病高免鸡蛋。本发明提供了一种I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂的制备方法，该方法基于药物微囊化技术对常规卵黄抗体剂型进行了改进，针对卵黄抗体的微观物质基础设计了适宜的包材配方并确定了包覆方法，使得成囊产物既保证了较高的包覆率又具有适宜的缓释特性，同时性质更加稳定，适宜作为口服剂给药。实验结果表明，本发明制备的卵黄抗体应激反应更低，药效持续时间更加平稳，同时对I型鸭肝炎具有突出的疗效，再加之本发明方法工艺简便、成本较低，因此便于工艺的放大。本发明以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低、易于实现，因此具有良好的推广前景。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。实施例11卵黄抗体口服剂的制备将18公斤高免蛋浸入1％的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min。取出消毒后的鸡蛋自然晾干或吹干，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒后备用。采取人工打蛋，打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集4L卵黄。将卵黄用胶体磨进行研磨后加入10L的PH值为5.0的醋酸缓冲液，搅拌30min后缓慢加入终浓度为4％的正辛酸搅拌90min，用100目滤布过滤过夜，收获10L滤液，将200g海藻酸钠溶解于10L卵黄抗体溶液中，搅拌均匀，静止过夜脱气，即得到含有海藻酸钠的卵黄抗体溶液。将200g壳聚糖用1000ml10％醋酸溶解后，加入99000ml纯化水，配制成壳聚糖溶液，再在壳聚糖溶液中加入500gCaCl2，用醋酸将溶液PH值调节至3.5，真空脱气，用500目尼龙筛过滤，配置成100000ml的成囊溶液，将以上制备的10L含有海藻酸钠的卵黄抗体溶液，缓慢加入100000ml成囊溶液中并搅拌，在滴加完成后再搅拌30分钟，反应完全，经喷雾干燥设备脱水，收获I型鸭肝炎抗体口服制剂。2攻毒治疗取3日龄I型鸭肝炎病易感雏鸭50只，均分为五组，不同组别的试验雏鸭隔离饲养。四组试验雏鸭全部肌肉注射200LD50的I型鸭肝炎强毒，于第二日，将第一组试验雏鸭灌服防治I型鸭肝炎的卵黄抗体口服制剂(0.5ml/只，所含中和效价为1:512)，第二组雏鸭正常饮水，水中含有中和效价为1:512的I型鸭肝炎卵黄抗体，第三组试验雏鸭灌服常规卵黄抗体液(0.5ml/只，所含中和效价1:512)，第四组试验雏鸭肌肉注射常规卵黄抗体液(0.5ml/只，所含中和效价1:512)，第五组为攻毒对照组，五组试验雏鸭均持续饲养10天，记录发病死亡情况，实验结果如表1所示。表1不同治疗方法疗效验证结果分组雏鸭数量措施死亡数治愈率灌服口服制剂组10只攻毒后治疗0只100％饮水口服制剂组10只攻毒后治疗0只100％口服常规制剂组10只攻毒后治疗8只20％肌注常规制剂组10只攻毒后治疗0只100％攻毒对照组10只攻毒后不治疗10只0％上述结果表明灌服及饮水途径使用防治I型鸭肝炎的卵黄抗体缓释制剂，注射途径使用常规卵黄抗体均具有良好的治疗效果，而口服途径使用常规卵黄抗体的治疗效果较差。实施例2一种I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂的制备方法，包括以下步骤：1)配制壳聚糖终浓度为0.1％(w/v)、CaCl2终浓度为0.3％(w/v)的混合溶液，用醋酸溶液调整所述混合溶液的pH值至3.2，真空脱气，过滤，取滤液即为成囊溶液；2)取I型鸭肝炎卵黄抗体溶液，向其中加入海藻酸钠至终浓度1.5％(w/v)；3)将步骤2)所得的抗体溶液与步骤1)所得的成囊溶液以1:8的比例混合，而后搅拌25min；4)将步骤3)所得产物喷雾干燥，即得到所述I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂。在以上技术方案的基础上，满足以下条件：步骤1)中的过滤是利用500目尼龙膜实现的。步骤1)中壳聚糖终浓度为0.1％(w/v)、CaCl2终浓度为0.3％(w/v)的混合溶液是通过以下方法配制的：取壳聚糖，用8％醋酸溶液溶解，再加纯化水至其中壳聚糖含量0.1％(w/v)，而后加入CaCl2至其中CaCl2终浓度为0.3％(w/v)。步骤3)包括以下操作：在搅拌条件下将步骤2)所得的抗体溶液滴加至步骤1)所得的成囊溶液中，混合后继续搅拌25min。步骤2)所述I型鸭肝炎卵黄抗体溶液是通过以下方法制备的：取I型鸭肝炎病灭活疫苗高免鸡蛋，卵黄液经60目尼龙筛过滤后，用胶体磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黄液体积的50℃，PH4.8的醋酸缓冲液稀释，搅拌30分钟，再缓慢加入总体积4％的正辛酸搅拌90分钟，用100目滤布过滤过夜，即可得到澄清的抗体溶液。所述高免鸡蛋是通过以下方法制备的：用I型鸭肝炎病灭活疫苗免疫120日龄产蛋母鸡，免疫三次，免疫间隔10日；三免后1周取抗体中和效价高于1:2048的鸡蛋即为型鸭肝炎病灭活疫苗高免鸡蛋。实施例3一种I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂的制备方法，包括以下步骤：1)配制壳聚糖终浓度为0.3％(w/v)、CaCl2终浓度为0.7％(w/v)的混合溶液，用醋酸溶液调整所述混合溶液的pH值至3.8，真空脱气，过滤，取滤液即为成囊溶液；2)取I型鸭肝炎卵黄抗体溶液，向其中加入海藻酸钠至终浓度2.5％(w/v)；3)将步骤2)所得的抗体溶液与步骤1)所得的成囊溶液以1:12的比例混合，而后搅拌35min；4)将步骤3)所得产物喷雾干燥，即得到所述I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂。在以上技术方案的基础上，满足以下条件：步骤1)中壳聚糖终浓度为0.3％(w/v)、CaCl2终浓度为0.7％(w/v)的混合溶液是通过以下方法配制的：取壳聚糖，用12％醋酸溶液溶解，再加纯化水至其中壳聚糖含量0.3％(w/v)，而后加入CaCl2至其中CaCl2终浓度为0.7％(w/v)。步骤3)包括以下操作：在搅拌条件下将步骤2)所得的抗体溶液滴加至步骤1)所得的成囊溶液中，混合后继续搅拌35min。步骤2)所述I型鸭肝炎卵黄抗体溶液是通过以下方法制备的：取I型鸭肝炎病灭活疫苗高免鸡蛋，卵黄液经60目尼龙筛过滤后，用胶体磨研磨破碎一遍，加入2.5倍卵黄液体积的56℃，PH5.2的醋酸缓冲液稀释，搅拌30分钟，再缓慢加入总体积4％的正辛酸搅拌90分钟，用100目滤布过滤过夜，即可得到澄清的抗体溶液。所述高免鸡蛋是经I型鸭肝炎病灭活疫苗免疫三次后的鸡所产鸡蛋。所述高免鸡蛋的效价高于1:2048。实施例4一种I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)配制壳聚糖终浓度为0.2％(w/v)、CaCl2终浓度为0.5％(w/v)的混合溶液，用醋酸溶液调整所述混合溶液的pH值至3.5，真空脱气，过滤，取滤液即为成囊溶液；2)取I型鸭肝炎卵黄抗体溶液，向其中加入海藻酸钠至终浓度2％(w/v)；3)将步骤2)所得的抗体溶液与步骤1)所得的成囊溶液以1:10的比例混合，而后搅拌30min；4)将步骤3)所得产物喷雾干燥，即得到所述I型鸭肝炎卵黄抗体口服制剂。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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