一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子及制备方法与流程

本发明属药物制剂技术领域，涉及抗肿瘤药物的仿生纳米制剂，具体涉及一种激活的中性粒细胞膜包覆的仿生纳米粒子及制备方法，尤其是一种能包载脂溶性药物的具有聚合物-细胞膜核壳结构的仿中性粒细胞的纳米载体及其制备方法。

背景技术：

资料显示，恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要杀手，具有侵袭性和转移能力是其最重要的生理特征。临床实践中，手术、化学治疗等干预手段虽然在短期内能起到一定作用，但预后一般较差，肿瘤的复发和转移是治疗面临的最大挑战。研究显示肿瘤转移中血管是肿瘤细胞侵入机体各个器官的主要“高速公路”，肿瘤表皮细胞大量增殖脱落，侵入血管形成具有高侵袭力和运动能力的循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,ctc)，这种具有内皮细胞样形态的ctc到达远处合适的寄居部位，形成转移灶，成为日后致命的隐患，也是临床肿瘤治疗失败的根本原因所在。

现有技术公开了人体白细胞可分为多种亚群，包括中性粒细胞、淋巴细胞以及单核细胞等，研究发现占白细胞总数70％左右的中性粒细胞对ctc和转移部位具有天然靶向作用，其分子基础在于这两种细胞表面的粘附分子表达的改变，即肿瘤微环境中的炎性因子激活中性粒细胞，上调其细胞膜上的粘附分子表达，增强了中性粒细胞与ctc高表达的特异性配体亲和力从而介导了肿瘤的转移。

基于激活中性粒细胞对ctc高效靶向的生物学基础，本申请的发明人拟提供一种激活的中性粒细胞膜包覆的生物可降解的仿生粒子，具体涉及一种能包载脂溶性药物的具有聚合物-细胞膜核壳结构的仿中性粒细胞的纳米载体系统，该系统将在血循环中高度靶向并杀伤ctc，从而抑制肿瘤的转移。

技术实现要素：

本发明的目的在于构建一种表面包覆激活的中性粒细胞膜的生物可降解的仿生粒子(neutrophillikenanopartiles,简称nlp)及其制备方法。

本发明以聚合物聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，简称plga)，或聚乳酸共聚物(polylacticacid，简称pla)，或聚己内酯共聚物(polycaprolactone，简称pcl)为材料制备纳米粒作为内核并包载模型药物，将天然激活中性粒细胞膜作为衣壳包覆于纳米粒表面，制成激活的中性粒细胞膜包覆的生物可降解的仿生粒子纳米载体系统。该纳米载体系统中，一方面利用激活的生物膜蛋白，在血液中长循环并高度靶向杀伤ctc；另一方面利用中性粒细胞天然募集至炎症部位血管的原理，靶向炎症状态的早期微转移病灶并释放药物，从而抑制肿瘤的转移。

本发明中，采用的模型药物为卡非佐米、硼替佐米或紫衫烷类化疗药物，均为fda批准的小分子化疗药物；其中，卡非佐米、硼替佐米或紫衫烷类化疗药物，能作用于多种与转移、耐药相关的通路，诱导肿瘤细胞凋亡，具有一定抑制肿瘤转移活性，将这些化疗药物包载于上述纳米载体中，一方面能够延长其在血液中的半衰期，诱导循环肿瘤细胞凋亡；另一方面能够抑制基质金属蛋白酶和相关炎症因子的生成，调节早期微转移病灶局部炎症环境，遏制肿瘤细胞的定植和侵袭。

本发明中，聚合物plga，pla，pcl构建的纳米粒作为内核，能包载疏水性药物，具有较高的机械稳定性，其分子量为10000-30000da。

本发明中，所述中性粒细胞膜囊泡通过从同种类动物外周血分离得到中性粒细胞，将其进行体外诱导从而上调相关粘附分子的表达，采用差速离心法提取得到；

本发明中，所述激活的中性粒细胞膜表面相关粘附分子中，lps脂多糖激活的中性粒细胞膜上调β2整合素类、l-选择素、趋化因子受体、β1整合素等膜蛋白的表达。

本发明通过下述方法构建粒子方法仿生粒子纳米载体系统：

①从同种类动物外周血分离得到中性粒细胞，将其进行体外诱导从而上调相关粘附分子的表达，差速离心法提取得到细胞膜分散于水溶液中的囊泡；

②以plga或pla或pcl为材料采用乳化溶媒挥发法制得粒径均一的纳米粒，同时包载难溶性小分子模型药物；

③将预先制备的中性粒细胞膜囊泡与plga或pla或pcl纳米粒共孵育并往复过膜挤压。

本发明中，所述外周血细胞物种来源是小鼠或者大鼠。

本发明中，所述聚合物构建的纳米粒内核和细胞膜囊泡通过疏水作用以及静电作用相结合，在聚合物内核表面包被膜-蛋白脂质双分子层，形成核壳结构的纳米级仿生粒子。

本发明中，所述细胞膜囊泡平均粒径为200nm左右，聚合物纳米内核平均粒径为80-100nm，包被中性粒细胞膜之后最终粒径在100-120nm左右；相比于微米尺度的细胞，比表面积较大，能更高效地发挥膜结构的作用。

本发明采用人脐静脉内皮细胞(huvec细胞)为早期微转移病灶内皮细胞模型，以改良的椎板粘度计对乳腺癌肺高转移细胞(4t1细胞)产生一定剪切力为循环肿瘤细胞模型，此两种细胞均为本领域公认且熟知。

本发明描述了该药物递释系统的制备方案，并提供了该系统体内外靶向性的结果以及药效学评价。

本发明通过采用改良的锥板粘度计模拟血液流动状态，评价在一定的血液剪切力作用下nlp对流动状态的4t1肿瘤细胞的靶向功能，并且能够显著提高卡非佐米诱导流动状态的4t1细胞的凋亡的能力。肺转移模型裸鼠活体近红外/生物发光双模成像实验证明，该药物能够特异性地蓄积至肺转移病灶。体内药效学评价监测显示，相比于游离药物和普通纳米制剂，该递药系统能够显著抑制转移病灶的形成，具有明显的抗肿瘤效果。

本发明所制得的新型靶向药物递释系统其给药方式为静脉注射。

本发明的优点在于：

制得的仿生粒子纳米载体系统不同于一种或者多种分子修饰的主动靶向纳米粒子，该简易的中性粒细胞仿生粒子(neutrophil-likeparticles,nlp)在防治肿瘤转移方面具有其独特的优势：

①激活的中性粒细胞膜表面相关粘附分子能高度靶向ctc；

②plga或pla或pcl内核载药能力强，且具缓释效果；

③纳米粒利用中性粒细胞膜的伪装，能够逃避自身单核巨噬细胞的吞噬，有别于传统的聚乙二醇修饰，为实现制剂的长循环提供新思路；

④生物相容性和安全性高：nlp表面包覆的中性粒细胞膜不存在遗传物质以及细胞器等，免疫原性极低；内核为fda所认可的生物可降解材料；因此具有较高的安全性和医学转化前景。

附图说明：

图1是纳米递药系统的粒径和电位表征图，

图中a,b,c分别是几种纳米制剂的粒径分布，平均粒径和zeta电位。

图2是纳米递药系统的透射电镜图，

图中a,b,c分别是裸露的plga纳米粒，中性粒细胞膜囊泡和包被中性粒细胞膜的plga纳米粒透射电镜放大图，d是包被中性粒细胞膜的plga纳米粒分散于水溶液中。

图3是纳米粒表面粘附和趋化蛋白的定性检测结果，

图中a是免疫印迹法测定l-selectin,cxcr4,lfa-1,β1intergrin等几类蛋白在样品中的表达情况；(a)中性粒细胞,(b)中性粒细胞膜，(c)包被中性粒细胞膜的纳米粒，(d)经过lps刺激后的中性粒细胞，(e)经过lps刺激后的中性粒细胞膜，(f)经过lps刺激后的中性粒细胞膜包被的纳米粒；b是考马斯亮蓝染色法测定经过lps刺激后的中性粒细胞，中性粒细胞膜，纳米粒表面的总体蛋白印记。

图4是免疫印迹法测定粘附和趋化分子表达的半定量结果，

图中^***p<0.001，是指与未经过lps刺激的中性粒细胞相比显著增加。

图5是纳米递药系统在静止和流动状态中的4t1乳腺癌细胞中的摄取定性和定量结果，

图中a是包载香豆素-6(荧光探针)的相同浓度的np和nlp在静止和流动的4t1乳腺癌细胞中的荧光显微镜摄取图，b是在静止状态下平均单个4t1细胞摄取不同浓度np和nlp高内涵扫描结果，c是在剪切力为188s^-1的流动状态下平均单个4t1细胞摄取不同浓度的np和nlp高内涵扫描结果；^**p<0.01，^*p<0.05，是指与37℃静止状态下的np相比，在4t1细胞中的摄取相比显著增加；^###p<0.001，^#p<0.05，是指与37℃流动状态下的np相比，在4t1细胞中的摄取相比显著增加。

图6是纳米粒分散在流动血液中后在huvec细胞上的摄取定性和定量结果，其中，

a是未经过tnf-α刺激的huvec细胞对np摄取的共聚焦图，b是未经过tnf-α刺激的huvec细胞对nlp摄取的共聚焦图，c是经过tnf-α刺激的huvec细胞对np摄取的共聚焦图，d是经过tnf-α刺激的huvec细胞对nlp摄取的共聚焦图，e是各种情况下的摄取定量结果。

图7是游离cfz，np-cfz和nlp-cfz纳米粒诱导流动状态下的4t1细胞凋亡情况。

图8是采用近红外成像检测np和nlp纳米粒在小鼠肺转移模型上的组织分布。

图9是纳米制剂和游离药物在尾静脉注射luc-4t1细胞的小鼠肺转移模型的药效结果，

图中a是尾静脉注射相同量的luc-4t1细胞后给予裸鼠游离cfz，np-cfz和nlp-cfz纳米粒三次(第1天，第7天，第14天)后的生物发光活体成像检测。b是在第16天获取裸鼠各个主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)后进行活体成像检测。

具体实施方式

实施例1激活的中性粒细胞膜的制备和表征

小鼠5％水合氯醛麻醉后，心脏取血于加入肝素的ep管中。取一支50ml离心管，小心加入15ml小鼠外周血中性粒细胞分离液。用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面上，500g离心25min。离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层，上层细胞为单个核细胞层，下层细胞为中性粒细胞层。用吸管小心吸取分离液中的中性粒细胞层，加入3倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解10min，300g离心10min，弃红色上清。重复裂解步骤一次，即得中性粒细胞。向所得细胞中加入10mlpbs混匀细胞，250g离心10min，弃上清。重复清洗步骤，得到纯净的中性粒细胞。为了刺激中性粒细胞上调粘附分子的表达，加入2μg·ml^-1的lps(一种脂多糖)孵育2h；

采用差速离心法提取中性粒细胞膜，向上述所得中性粒细胞中加入15mlib-1溶液重悬，转移至玻璃匀浆器中，冰上匀浆100次。将所得溶液加入50ml离心管中，1000g离心5min。吸取上层清液，10,000g离心20min。吸取上层清液，加入6.5ml离心管中，100,000g离心1h。弃去上层清液，沉淀用三蒸水重悬。溶液-80℃冷冻后，真空冻干得到中性粒细胞膜，-20℃保存；

将中性粒细胞和细胞膜、nlp用十二烷基硫酸钠sds溶解，page凝胶电泳之后采用经典的考马斯亮蓝染色法对膜蛋白的完整性进行表征；

采用免疫印迹法(westernblot)对lps刺激前后的中性粒细胞，中性粒细胞膜和nlp的几类特异性粘附蛋白进行表征；

结果显示：通过比较nlp与细胞膜的考马斯亮蓝染色结果发现，中性粒细胞膜上的蛋白条带与nlp的蛋白条带基本一致，说明将细胞膜转移到plga内核表面的同时，膜蛋白也成功转移到plga纳米粒表面。完整中性粒细胞中位于电泳前段20kda以下的小分子量蛋白多为细胞核结构中的小分子物质，细胞膜和nlp蛋白条带这类物质几乎全部被除去，而整合素类，选择素和趋化蛋白等蛋白分子量多集中在120kda,38kda，300kda左右，在图上均可观察到。通过免疫印迹实验证明经过2小时lps孵育和刺激后，lfa-1(β2整合素类)、l-选择素、cxcr4(趋化因子受体)、β1整合素等在各个样品中表达明显提高。

实施例2激活的中性粒细胞膜包被的载卡非佐米纳米递药系统制备和表征

精密称取10mg的plga聚合物材料，加入卡非佐米的二氯甲烷溶液1ml溶解为有机相，加入2ml1.0％的胆酸钠水相溶液，240w，50s超声乳化，然后立即倒入一定量0.5％胆酸钠溶液，磁力搅拌5min，旋转蒸发抽尽有机溶剂，低温高速离心(14500rpm，4℃，60min)即得载卡非佐米的np纳米粒(简称cfz-np)；

精密称取中性粒细胞膜，采用迷你型avanti脂质体/纳米挤出器，反复过孔径为200nm的聚碳酸酯膜使其在水相中聚集成为小的脂质囊泡，与质量比为1:1的plga材料所制备的纳米粒均匀混合，超声100hz,60s，即得载卡非佐米的nlp纳米粒(cfz-nlp)；

采用粒度/zeta电位测定仪测定纳米粒的粒径、多分散性(pdi)和zeta电位。采用透射电镜观察其形态；

结果显示：纳米粒包被膜前后粒径均在150nm以内，中性粒细胞膜的包被使纳米粒粒径增大了约20nm左右，zeta电位由原来的-39mv左右变为-34mv左右，与中性粒细胞膜囊泡相一致。两种纳米粒大小均一，外观圆整，经过对比可以清晰分辨出cfz-nlp的plga内核外包被了较暗的中性粒细胞膜脂质层。

实施例3nlp在静止和流动状态的4t1细胞上摄取的定性和定量研究

定性分析

a.静止状态下的孵育过程：以每孔2×10⁴个4t1细胞的密度接种于24孔培养板，于培养箱中孵育24h贴壁后吸去培养液，分别加入包载0.1％香豆素-6的nlp和np(纳米粒浓度400μg·ml^-1)，孵育2h后4％多聚甲醛固定，hoechst染细胞核；

b.流动状态下的孵育过程：采用brookfield锥板粘度计产生一定的剪切力，循环水浴保证恒温37℃，4t1细胞悬液按照5×10⁴个/ml的密度加入样品池中500μl，然后加入500μl的包载0.1％香豆素-6的nlp和np(纳米粒浓度800μg·ml^-1)，在188s^-1的剪切速率下孵育2h之后将细胞离心弃上清，加入pbs洗涤并用新鲜培养液重悬计数，按照每孔2×10⁴的密度接种到24孔板中，使细胞贴壁24h；

荧光显微镜下观察上述两种情况下的nlp和np在4t1细胞上的摄取差异，4％多聚甲醛固定，hoechst染细胞核；

定量分析

a.4t1细胞以每孔5×10³个细胞接种于96孔培养板，孵育24h后，考察静止状态下纳米粒浓度、孵育时间、以及温度对摄取的影响；

①纳米粒浓度的影响：分别用不同浓度的入包载0.1％香豆素-6的nlp和np(纳米粒浓度50-800μg·ml^-1)，孵育2h；

②温度的影响：将入包载0.1％香豆素-6的nlp和np溶液分别按不同浓度(纳米粒浓度50-800μg·ml^-1)每孔加入100μl，分别放入37℃及4℃孵育2h；

上述实验结束后，弃去纳米粒溶液，细胞用4％多聚甲醛固定，hoechst染核，最后用kineticscan全自动高内涵药物筛选仪定量扫描；

b.采用brookfield锥板粘度计产生一定的剪切力，循环水浴保证恒温模拟人体血流情况，将4t1悬液按照5×10⁴个/ml的密度加入500μl到样品池中，流动状态下考察纳米粒浓度、孵育时间、以及温度对摄取的影响；

①纳米粒浓度的影响：分别加入500μl不同浓度的入包载0.1％香豆素-6的nlp和np(纳米粒浓度50-800μg·ml^-1)在样品池中，在188s^-1的剪切速率下孵育2h；

②温度的影响：将入包载0.1％香豆素-6的nlp和np溶液分别按不同浓度(纳米粒浓度50-800μg·ml^-1)加入500μl到样品池中，分别在37℃及4℃，188s^-1的剪切速率下孵育2h；

按照以上条件处理的细胞离心弃上清，加入pbs洗涤并用新鲜培养液重悬计数，按照每孔5×10³的密度接种到96孔板中，使细胞贴壁24h之后弃去培养液，细胞用4％多聚甲醛固定，hoechst染核，最后用kineticscan全自动高内涵药物筛选仪定量扫描；

结果显示：在静止状态下，直接孵育的培养孔板的4t1细胞摄取载香豆素-6作为荧光探针的nlp相比于np的绿色荧光强度具有一定的提高，但是并不明显，而在流动状态下的4t1细胞的摄取中，nlp绿色荧光显著强于np，定量结果与定性结果相一致，说明4t1细胞对nlp的摄取在血液剪切力作用下相比于np更强，可能是由于细胞膜表面多种粘附分子发挥的协同性作用，介导了更加稳固的粘附，从而增强其摄取；静止和流动状态下4t1细胞在37℃时的摄取强于4℃说明这是一种能量依赖的内吞过程。

实施例4纳米粒在huvec细胞上的摄取定性和定量结果

将人huvec细胞按照每孔2×10⁴个的密度接种于底部铺有盖玻片的24孔板中，使其在盖玻片上贴壁24小时，加入tnf-α的溶液刺激2小时，用镊子将盖玻片取出，生长有细胞的一面朝上，用动物油脂固定于brookfield锥板粘度计样品杯中央，加入含有香豆素-6的nlp，np纳米粒(800μg·ml^-1的pbs溶液，在188s^-1的剪切速率下孵育2小时，循环水浴保证恒温37℃，之后将盖玻片放回孔板中，加入pbs洗涤3次，4％多聚甲醛固定，hoechst染细胞核，荧光显微镜下观察上述两种情况下的nlp和np在经过tnf-α激活前后的huvec细胞上的摄取差异。定量检测是按照以上条件处理的huvec用kineticscan全自动高内涵药物筛选仪定量扫描；

定性和定量结果显示：经过tnf-α刺激后的huvec细胞对两种纳米制剂的摄取都有所提高，且在细胞内的分布呈簇状。nlp的摄取明显强于np，但是未经过刺激的huvec细胞对nlp和np的摄取无显著性差异，前者稍强。此结果说明处于炎症刺激下的内皮细胞对所有纳米制剂的摄取均有提高，但是对于包被了中性粒细胞膜的纳米制剂靶向炎症部位内皮细胞的能力较强，该仿生纳米粒具有类似于中性粒细胞的生物学特性。

实施例5游离cfz，np-cfz和nlp-cfz纳米粒诱导流动状态下的4t1细胞凋亡定量结果

将4t1细胞按照1×10⁶个/ml的密度加入brookfield锥板粘度计的样品池中，加入游离cfz，np-cfz和nlp-cfz纳米粒三种制剂(卡非佐米浓度400ng·ml^-1)，在188s^-1的剪切速率下孵育2h之后将细胞离心弃上清。用预冷的pbs洗涤3遍并用pbs重悬细胞进行计数。一组立即参照annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒，取0.5-1×10⁵个细胞重悬于200μl结合液，加入5μlannexinv-fitc和10μlpi染色液，室温避光放置15min，随即进行流式细胞仪检测，观察细胞凋亡情况。另外一组以1×10⁵个/孔的密度接种于6孔板内，孵育24小时后，进行消化，处理同第一组；

结果显示：对椎板粘度计中流动2小时之后立刻进行流式定量检测，观察到对照组流动2小时之后细胞的活力，凋亡细胞数目很少，说明机械力对细胞无损伤。流动2小时之后各个给药组出现不同程度的晚期凋亡，早期凋亡很少。继续低浓度给药孵育24小时，监测到加入游离的cfz之后晚期凋亡数目骤升，达到30.2％左右，早期凋亡为11.9％左右。普通纳米粒cfz-np组晚期凋亡仅为18.9％左右，早期凋亡明显增加至20.2％，但cfz-nlp组晚期凋亡和早期凋亡均显著增加，分别为25.3％和39.9％左右。推测其原因，很可能是在流动状态下中性粒细胞膜介导了纳米粒摄取的增加，介导细胞大量凋亡。

实施例6采用近红外成像检测np和nlp纳米粒在小鼠肺转移模型上的组织分布。

将2×10⁶个luc-4t1细胞通过尾静脉注射入12只18-22g的balb/c鼠体内，待第14天时，进行生物发光成像检测，选取肺转移瘤情况和程度相近的裸鼠(8只)分为2组(n＝4)。分别尾静脉注射包载近红外探针dir的nlp，np纳米粒，第24小时进行近红外成像和生物发光检测，并解剖各个主要脏器((心、肝、脾、肺、肾)进行两种模式下的检测，观察靶向性；

结果显示：尾静脉注射luc-4t1细胞肺转移造模成功率90％以上，选取相同转移情况的裸鼠进行成像，消除了其他因素的干扰，例如epr效应等。np组的裸鼠整体近红外荧光强度低于nlp组，从解剖得到的肺部肿瘤图像上看，两种成像模式并无太多相关性，说明np对转移瘤特异性较低。而nlp组信号在两种成像模式下相关性较好，几乎转移部位的肿瘤都具有较强的近红外荧光信号。说明包被了中性粒细胞膜之后，转移部位靶向性大大提高。

实施例7制剂在尾静脉注射luc-4t1细胞的小鼠肺转移模型的药效结果

取体重20±2g的健康裸鼠12只，随机分为3组，尾静脉注射相同量(2×10⁶个)的luc-4t1细胞，半小时后尾静脉注射等量药物的游离cfz，np-cfz和nlp-cfz纳米粒(5mg/kg)，分别于第7天和第14天给予相同量的三种制剂，于第八天开始每天注射底物进行生物发光活体成像检测和记录。在第16天获解剖取裸鼠各个主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)后进行生物发光活体成像检测；

结果显示：生物发光荧光强度与体内瘤体的大小呈很好的正相关性，结果发现，即使在肿瘤细胞注射进体内30分钟后立刻给药，游离的cfz对癌细胞的转移并无显著的作用，第8天多数裸鼠肺部已经形成了较大的转移病灶。按照两周给药3次的方案进行治疗，最终肺部转移瘤进展并未得到控制。而cfz-np组的裸鼠在第8天出现了较强程度的转移，但在后续治疗中肿瘤体积出现了缩小，很可能是由于早期缺乏循环肿瘤细胞的靶向性，导致转移成功，但是后期由于epr效应，纳米制剂能够在肿瘤部位蓄积，从而发挥疗效。cfz-nlp组疗效最为显著，最开始第8天到结束第16天肿瘤体积明显缩小，相比于其他两种制剂，说明该中性粒细胞膜包被的纳米递送系统药效最为明显。