包含GLP1/胰高血糖素双重激动剂接头透明质酸缀合物的前药的制作方法
本发明涉及glp-1/胰高血糖素双重激动剂前药，包含所述前药的医药组合物以及它们作为治疗或预防可由glp-1/胰高血糖素双重激动剂治疗的疾病或病症的药物的用途，例如用于治疗代谢综合征的病症(包括糖尿病和肥胖)，以及用于减少过量食物摄入。
发明背景
glp-1激动剂
毒蜥外泌肽(exendin)-4是一种39个氨基酸的肽，其分离自分泌毒液的吉拉毒蜥(gilamonster)(钝尾毒蜥(helodermasuspectum))的唾液分泌物。它与胰高血糖素样肽家族的几个成员具有一些序列相似性，其中具有最高的53％同源性的是胰高血糖素样肽-1[7-36]-酰胺(glp-1)。在离体大鼠胰岛中，毒蜥外泌肽-4充当对glp-1受体的激动剂并带有glp-1样胰岛素促分泌素(sectretagogue)作用。毒蜥外泌肽-4是高效力激动剂且截短的glp-1激动剂-(9-39)-酰胺是在分泌胰岛素的β细胞的胰高血糖素样肽1-(7-36)-酰胺受体处的拮抗剂(参见例如j.biol.chem.268(26):19650-19655)。毒蜥外泌肽-4(“艾塞那肽(exenatide)”)最近在美国和欧盟被批准用于在患有2型糖尿病且服用二甲双胍和/或磺脲类的患者中改善血糖控制，但还没有达到足够的血糖控制。
毒蜥外泌肽-4的氨基酸序列如seqidno:1中所示：
hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappps-nh2
glp-1(7-36)-酰胺的氨基酸序列如seqidno2中所示：
haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr-nh2
胰高血糖素是一种29个氨基酸的肽，其在循环葡萄糖低的时候释放至血流中。胰高血糖素的氨基酸序列在seqidno:3中显示：
hsqgtftsdyskyldsrraqdfvqwlmnt-oh
在低血糖期间，当血糖水平降低至低于正常时，胰高血糖素向肝发送分解糖原并释放葡萄糖的信号，导致血糖水平升高达到正常水平。低血糖是具有由于糖尿病而引起的高血糖症(升高的血糖水平)的经胰岛素治疗的患者中的常见副作用。因此，胰高血糖素在葡萄糖调节中最主要的作用是抵消胰岛素作用以及保持血糖水平。
holst(holst,j.j.physiol.rev.2007,87,1409)和meier(meier,j.j.nat.rev.endocrinol.2012,8,728)描述了glp-1受体激动剂，诸如glp-1、利拉鲁肽(liraglutide)和毒蜥外泌肽-4，具有在患有t2dm的患者中通过降低空腹和餐后血糖(fpg和ppg)来改善血糖控制的3种主要药理学活性：(i)增加葡萄糖依赖性胰岛素分泌(改善第一和第二阶段)，(ii)在高血糖条件下的胰高血糖素抑制活性，(iii)延迟胃排空速率从而导致餐源性葡萄糖吸收迟缓。
glp-1/胰高血糖素(glc)激动剂
pocai等人(obesity.2012；20:1566–1571；diabetes2009,58,2258)和day等人(natchembiol2009；5:749)描述了glp-1和胰高血糖素受体的双重活化，例如，通过使glp-1和胰高血糖素的功能组合于一个分子中导致具有抗糖尿病作用和明显的体重降低效果的治疗成分。
结合并活化胰高血糖素和glp-1受体两者(hjort等人journalofbiologicalchemistry,269,30121-30124,1994；dayjw等人,naturechembiol,5:749-757,2009)并抑制体重增加且降低食物摄入的肽描述于专利申请wo2008/071972、wo2008/101017、wo2009/155258、wo2010/096052、wo2010/096142、wo2011/075393、wo2008/152403、wo2010/070251、wo2010/070252、wo2010/070253、wo2010/070255、wo2011/160630、wo2011/006497、wo2011/152181、wo2011/152182、wo2011/117415、wo2011/117416和wo2006/134340中，通过引用的方式将其内容并入本申请。
此外，不仅活化glp-1和胰高血糖素受体，还活化gip受体(胃抑制性多肽)的三重共激动剂肽描述于wo2012/088116中并由vagault等人描述(biochempharmacol,85,16655-16662,2013；diabetologia,56,1417-1424,2013)。
bloom等人(wo2006/134340)披露了可将结合并活化胰高血糖素和glp-1受体两者的肽构建成来自胰高血糖素和毒蜥外泌肽-4的杂合分子，其中n-末端部分(例如残基1-14或1-24)源自胰高血糖素而c-末端部分(例如残基15-39或25-39)源自毒蜥外泌肽-4。
otzen等人(biochemistry,45,14503-14512,2006)披露了n-和c-末端疏水性片段(patch)涉及胰高血糖素的原纤维化(fibrillation)，这是由于潜在残基的疏水性和/或高的β-片层倾向。
wo2014/056872披露了结合并活化胰高血糖素和glp-1受体两者且衍生自毒蜥外泌肽-4的肽，其中至少在14位的氨基酸带有延长半衰期的侧链。
本发明使用的肽为毒蜥外泌肽-4肽类似物，其包含10位的亮胺酸和13位的谷胺酸且描述于wo2015/086731、wo2015/086732、wo2015/086733中。
另一本发明使用的肽为毒蜥外泌肽-4肽类似物，其包含28位的β-丙胺酸且描述于ep15305899.5中。
再一本发明使用的肽为毒蜥外泌肽-4肽类似物，其包含3位的谷胺酸、28位的β-丙胺酸及29和34位的d-丙胺酸。
本发明使用的肽优选不仅在中性ph可溶，而且在ph4.5可溶。此外，在4.5至5的ph值的化学稳定性是长效前药产品的一个重要标准。所述前药优选在该ph范围配制，从而获得在4℃至少6个月的贮存期(shelflife)。
长效glp-1/胰高血糖素激动剂
理想的情况下，所述肽以这样的方式配制：在向人体施用后，在人中提供持续的血浆水平达至少一周，导致每周一次或更长的注射频率。
使用长效glp-1激动剂的当前疗法是
wo2012/173422描述了每周给药的与免疫球蛋白的fc区域缀合的glp-1/胰高血糖素激动剂，其中所述肽衍生自胃泌酸调节素(oxyntomodulin)。
载体连接的前药
为了增强药物的体内物理化学或药物动力学性质，诸如其半衰期，此类药物可与载体缀合。如果该药物暂时结合至载体和/或接头，此类系统通常被指定为载体连接的前药。根据iupac提供的定义(如在2009年7月22日访问的http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem所给出)，载体连接的前药为含有给定活性物质与暂时载体基团的临时连接的前药，其可产生改善的物理化学或药物动力学性质且通常经水解裂解可容易地在体内除去。
此类载体连接的前药中使用的接头可为暂时性，意味着它们在生理学条件(含水缓冲液ph7.4,37℃)下为非酶性水解性可降解的(可裂解的)，其中半衰期范围为例如一小时至三个月。合适的载体为聚合物且可直接或经由非裂解性间隔基(spacer)缀合至接头。
通过无痕迹前药接头的暂时性聚合物偶联结合了以下优点：由于聚合物连接而延长滞留时间，以及从聚合物缀合物释放后恢复天然肽的原始药理学。
使用聚合物-接头肽缀合物，向患者施用后，天然不变的肽慢慢释放，仅由接头的释放动力学和聚合物载体的药物动力学所控制。理想的情况下，释放动力学将独立于体液中酶(如蛋白酶或酯酶)的存在，以保证一致且均匀的释放模式。
wo2008/148839、wo2009/095479和wo2012/035139是指包含药物接头缀合物的前药，其中所述接头经由可裂解的键连接至生物学活性部分，诸如glp1-激动剂毒蜥外泌肽-4。经过由环状酰亚胺形成的环化-活化，所述生物学活性部分从前药中释放。释放动力学独立于ph值且是用于在4.5至5的ph值储存前药的最小值并在7.4至7.5左右的生理学ph到达其预期的释放速率。描述了glp-1激动剂-前药，其中所述接头基于l-丙胺酸且所述聚合物载体为基于peg-赖胺酸的水凝胶。没有描述双重glp-1/胰高血糖素激动剂-前药。
透明质酸(ha)
dhal等人(journalofbiomedicalnanotechnology,vol9,2013,1–13)报道了作为药物缀合物的合适载体的透明质酸。kong等人(biomaterials31(2010),4121-4128)报道了一种毒蜥外泌肽-4-透明质酸缀合物，其显示在小鼠中持续3天的葡萄糖降低作用。所使用的ha为直链聚合物，其中药物载量范围为约2.4至12.％。
在本发明中，选择交联的透明质酸的水凝胶，因为它们作为局部储库在施用部位比可溶性ha具有更长的滞留时间。
对于使用透明质酸(ha)作为载体聚合物的重要标准是最终药物产品中可达到的药物载量，其由聚合物本身的药物载量和最终溶液/悬浮液的浓度确定。事实上，皮下储库的注射体积实际上被限制到等于/小于1ml，优选等于/小于0.6ml。
ha的聚合物溶液/悬浮液越浓，制剂的粘性越大，其对前体药物制剂的可注射产生负面影响。粘性溶液需要更大直径的注射针头，以限制按压注射器的柱塞上的力。另外，注射的时间更长。
本发明的一个目的是提供用于作为皮下储库给药的glp-1/胰高血糖素激动剂前药，其历经给药之间至少6天的时间段释放呈活性形式的glp-1/胰高血糖素激动剂且可通过26号针注射甚至为了良好的患者顺应性通过更小直径的针头注射。
本发明的一个目的是前药或其药学可接受的盐，其包含式(i)的药物接头缀合物
z-l1–l2-l-y-r20(i)
其中y为具有式(ii)的肽
his-x2-x3-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-leu-asp-glu-gln-x18-ala-x20-x21-phe-ile-glu-trp-leu-ile-x28-gly-gly-pro-x32-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser
(ii)
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自arg和lys的氨基酸残基，
x20代表选自lys、gln和his的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基，
或者其中y为具有式(iii)的肽
his-x2-x3-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-leu-asp-glu-gln-x18-ala-x20-x21-phe-ile-glu-trp-leu-ile-x28-gly-gly-pro-x32-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser
(iii)
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自leu和his的氨基酸残基，
x20代表选自his、arg、lys和gln的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自lys、ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基，
或者
其中y为具有式(iv)的肽
his-x2-x3-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-leu-leu-asp-glu-gln-x18-ala-lys-asp-phe-ile-glu-trp-leu-ile-ala-gly-gly-pro-x32-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser
(iv)
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自arg和leu的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基，
或者
其中y为具有式(iva)的肽
h2n-his-aib-his-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-leu-x15-glu-gln-leu-ala-arg-asp-phe-ile-glu-trp-leu-ile-bal-x29-gly-x31-x32-ser-x34-x35-pro-pro-pro-x39-r20
(iva)
x15代表选自asp和glu(优选asp)的氨基酸残基，
x29代表选自gly、d-ala和pro(优选gly、d-ala)的氨基酸残基，
x31代表选自pro、his和trp(优选pro)的氨基酸残基，
x32代表选自ser、his、pro和arg(优选ser、his、pro)的氨基酸残基，
x34代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x35代表选自ala、pro和lys(优选ala、pro)的氨基酸残基，
x39代表ser或pro-pro-pro，
或者
其中y为具有式(ivb)的肽
h2n-his-aib-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-leu-leu-glu-glu-gln-arg-ala-arg-glu-phe-ile-glu-trp-leu-ile-bal-d-ala-gly-pro-pro-ser-d-ala-ala-pro-pro-pro-ser-r20；
或其盐或溶剂合物；
r20为oh或nh2；
l为式(ia)的接头，
其中虚线指示通过形成酰胺键与y的n-末端的连接；
x为c(r4r4a)；n(r4)；
r1、r1a独立地选自：h；和c1-4烷基；
r2、r2a独立地选自：h；和c1-4烷基；
r4、r4a独立地选自：h；和c1-4烷基；
其中r2、r2a、r4或r4a取代有一个基团l2-l1-z；其中
l2为单一化学键或为c1-20烷基链，其任选被一个或多个独立地选自-o-和c(o)n(r3aa)的基团中断且任选取代有一个或多个独立地选自oh和c(o)n(r3aar3aaa)的基团，其中r3aa和r3aaa独立地选自：h和c1-4烷基；且
l2经由选自的末端基团连接于l1
其中l2连接于以虚线指示的一个位置且l1连接于以另一虚线指示的位置；且
l1为c1-20烷基链，其任选被一个或多个独立地选自-o-和c(o)n(r5aa)的基团中断且任选取代有一个或多个独立地选自oh和c(o)n(r5aar5aaa)的基团，其中r5aa和r5aaa独立地选自：h和c1-4烷基；且
l1经由末端氨基连接于z，所述末端氨基与z的透明质酸的β-1,3-d-葡糖醛酸的羧基形成酰胺键；
z为交联的透明质酸水凝胶，其中
0.05至20％的单体二糖单元通过交联剂交联；且0.2至8.5％的单体二糖单元带有l1-l2-l-y-r20基团。
本发明涉及前药，其提供历经给药之间至少6天的时间段释放呈活性形式的glp-1/胰高血糖素激动剂。
这有助于患者减少注射频率，同时能够保持最优控制glp-1/胰高血糖素激动剂的血清水平和最终的血糖。
本发明的交联透明质酸载体的其它优点为通过26号针头或甚至更小内径针头的良好可注射性。
附图说明
图1a、图1b、图1c示出合成透明质酸水凝胶的多种交联化学。
图2a.在不同时间点采集的ha水凝胶在注射部位的磁共振(mr)图像。
图2b.在不同时间点采集的含有1:1(w/w)ha水凝胶-800kda水溶性ha的聚合物悬浮液在注射部位的磁共振(mr)图像。
图3.每周给药的具有接头的毒蜥外泌肽-4seqidno.26双重激动剂由ha水凝胶的体外释放动力学(实施例18)。半衰期为5天。
图4.ha水凝胶–双重激动剂(seqidno.26)缀合物对db/db小鼠的非空腹血糖的体内效应：针对不同剂量，示出以mmol/l为单位的血糖的差异水平vs动物的治疗时间。
图4b.ha水凝胶–双重激动剂(seqidno.26)缀合物对db/db小鼠的非空腹血糖的体内效应：针对不同水凝胶构建物：可溶性和交联的透明质酸，示出以mmol/l为单位的血糖的差异水平vs动物的治疗时间。
图4c.ha水凝胶–双重激动剂(seqidno.45、46和48)缀合物对db/db小鼠的非空腹血糖的体内效应：示出以mmol/l为单位的血糖的水平vs动物的治疗时间。
图4d.ha水凝胶–双重激动剂(seqidno.49)缀合物对db/db小鼠的非空腹血糖的体内效应：示出以mmol/l为单位的血糖的水平vs动物的治疗时间。
图5.可注射性研究：对具有不同肽载量的ha水凝胶的注射器柱塞的挤压力。
发明详述
本发明的氨基酸序列含有天然存在的氨基酸的常规单字母和三字母代码，以及其它氨基酸的普遍接受三字母代码，诸如aib(α-氨基异丁酸)。
此外，下列代码用于下表中所示的氨基酸。
与接头结合的glp-1/胰高血糖素激动剂被称为“glp-1/胰高血糖素激动剂部分”。
“保护基”是指在合成过程中临时保护分子的化学官能团，从而在随后的化学反应中获得化学选择性的部分。醇的保护基为例如苄基和三苯甲基，胺的保护基为例如第三丁基氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基和苄基，且硫醇的保护基的实施例为2,4,6-三甲氧基苄基、苯基硫基甲基、乙酰氨基甲基、对甲氧基苄基氧基羰基、第三丁基硫基、三苯基甲基、3-硝基-2-吡啶基硫基、4-甲基三苯甲基。
“经保护的官能团”意指由保护基保护的化学官能团。
“酰化剂”意指结构为r-(c＝o)-的部分，其在酰化反应中提供酰基并任选与离去基团连接，诸如酰氯、n-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酚和对硝基苯酚。
“烷基”意指直链或支化碳链。烷基碳的每个氢可被取代基替代。
“芳基”是指衍生自单环芳族环、多环芳族环或稠合芳族环(包括杂环)的任意取代基，例如苯基、噻吩基、吲哚基、萘基、吡啶基，所述取代基可任选被进一步取代。
“酰基”意指结构为r-(c＝o)-的化学官能团，其中r为烷基或芳基。
"c1-4烷基"是指具有1-4个碳原子的烷基链，例如如果存在于分子末端，则所述烷基链为：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、第二丁基、第三丁基，或者例如当两个分子的部分经烷基连接时，所述烷基链为-ch2-、-ch2-ch2-、-ch(ch3)-、-ch2-ch2-ch2-、-ch(c2h5)-、-c(ch3)2-。c1-4烷基碳的每个氢可被取代基替代。
"c1-6烷基"意指具有1-6个碳原子的烷基链，例如如果存在于分子末端，则所述烷基链为：c1-4烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、正己基，或者例如当两个分子部分经烷基连接时，所述烷基链为-ch2-、-ch2-ch2-、-ch(ch3)-、-ch2-ch2-ch2-、-ch(c2h5)-、-c(ch3)2-。c1-6烷基碳的每个氢可被取代基替代。
因此，“c1-18烷基”是指具有1至18个碳原子的烷基链且“c8-18烷基”意指具有8至18个碳原子的烷基链。因此，“c1-50烷基”意指具有1至50个碳原子的烷基链。
"卤素"意指氟、氯、溴或碘。通常优选的是，卤素为氟或氯。
“透明质酸”意指β-1,3-d-葡糖醛酸和β-1,4-n-乙酰基-d-葡糖胺及其相应钠盐组成的二糖的聚合物。这些聚合物是线性的。
“二糖单元”意指由β-1,3-d-葡糖醛酸和β-1,4-n-乙酰基-d-葡糖胺及其相应钠盐组成的二糖，且为ha的单体构造块。
“交联透明质酸”意指“透明质酸”的聚合物，其中ha的不同链可通过交联剂共价连接，形成3维聚合物网状结构。交联程度是指聚合物网状结构中二糖单元与交联剂单元的摩尔比。
“交联的透明质酸”可通过不同方法衍生。ha与交联剂的反应，经修饰的(活化的)ha与交联剂的反应，两种不同的经修饰的ha与交联剂的反应。实施例可描述于oh等人,journalofcontrolledrelease141(2010),2-12中。实施例11描述了未经修饰的ha与二乙烯基砜的交联。用于制备交联的ha的其它方法还描绘于图1a、图1b和图1c中：醛(二醇氧化)和后续的胺还原胺化，羟基介导的烷基化，酰胺形成反应，michael加成交联(硫基–马来酰亚胺)，二醇–环氧化物化学等。
“交联剂”可为线性或支化分子或化学基团，优选为在每个远端具有至少化学官能团的线性分子。
“官能化透明质酸”意指其中ha被基团l1化学修饰的“透明质酸”的聚合物，该基团l1在其远端带有化学官能团。官能化的程度是指聚合物中二糖单元与l1单元的摩尔比。
术语“化学官能团”是指但不限于羧酸及活化衍生物、氨基、马来酰亚胺、巯基和衍生物、磺酸和衍生物、碳酸酯和衍生物、氨基甲酸酯和衍生物、羟基、醛、酮、肼、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磷酸和衍生物、膦酸和衍生物、卤代乙酰基、烷基卤化物、丙烯酰基和其它α-β不饱和michael受体、芳基化剂如芳基氟化物、羟基胺、二硫化物如吡啶基二硫化物、乙烯基砜、乙烯基酮、重氮烷、重氮乙酰基化合物、环氧乙烷和氮丙啶。
如果化学官能团与另一种化学官能团偶联，所得的化学结构被称作“连接(linkage)”。例如，氨基与羧基反应得到酰胺连接。
“反应性官能团”为骨架部分的化学官能团，其与高度支化部分连接。
“官能团”为用于“反应性官能团”、“可降解的互连官能团(degradableinterconnectedfunctionalgroup)”或“缀合物官能团”的总称。
术语“阻隔基团(blockinggroup)”或“封端基团(cappinggroup)”同义使用并且是指与反应性官能团不可逆连接从而使它们不能与例如化学官能团反应的部分。
术语“保护基”或“保护基团”是指与反应性官能团可逆性连接从而使它们在特定条件下不能与例如其它化学官能团反应的部分。
术语“衍生物”是指适当取代有保护基和/或活化基团的化学官能团或是指本领域技术人员已知的相应化学官能团的活化形式。例如，羧基的活化形式包括但不限于活性酯，诸如琥珀酰亚氨基酯、苯并三唑基酯(benzotriazylester)、硝基苯基酯、五氟苯基酯、氮杂苯并三唑基酯、酰基卤化物、混合或对称酸酐、酰基咪唑。
术语“非酶可断裂的接头”是指在无酶活性的生理学条件下水解可断裂的接头。
术语“间隔基”、“间隔基团”、“间隔基分子”和“间隔基部分”可互换使用，并且如果是用于描述存在于本发明水凝胶载体中的一部分，其是指适于连接两个部分的任意部分，诸如c1-50烷基，该片段任选被一个或多个选自以下的基团中断：-nh-、-n(c1-4烷基)-、-o-、-s-、-c(o)-、-c(o)nh-、-c(o)n(c1-4烷基)-、-o-c(o)-、-s(o)-、-s(o)2-。
术语“终端(terminal)”、“末端(terminus)”或“远端(distalend)”是指官能团或接头在分子或部分内的位置，其中所述官能团可为化学官能团，所述连接可为可降解的或永久性连接，其特征在于位于两个部分之间的接头的附近或位于两个部分之间的接头内，或者位于寡聚物链或多聚物链的端部。
短语“结合形式(inboundform)”或“部分”是指为大分子的部分的亚结构。短语“结合形式”用于通过命名或列举本领域公知的试剂、起始物质或假定的起始物质简化对部分的提及，并且通过“结合形式”是指在试剂或起始物质中存在的例如一个或多个氢基(–h)或一个或多个活化基团或保护基不存在于所述部分中。
应当理解的是，包含聚合部分的所有试剂和部分是指已知就分子量、链长或聚合度或官能团的数目而言展现出变化性的大分子实体。因此，针对交联试剂和交联部分所显示的结构仅为代表性实施例。
试剂或部分可为线性或支化的。如果所述试剂或部分具有两个末端基团，则其被称为线性试剂或部分。如果所述试剂或部分具有多于两个的末端基团，则认为其是支化的或多官能试剂或部分。
此类载体连接的前药中使用的接头是暂时性的，意味着它们在生理学条件(含水缓冲液ph7.4,37℃)下为非酶性水解性可降解的(可裂解的)，其中半衰期范围为例如一小时至三个月。
术语“glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药”是指载体连接的glp-1/胰高血糖素激动剂的前药，其中所述载体为水凝胶。术语“水凝胶前药”和“水凝胶连接的前药”是指暂时性连接至水凝胶的生物学活性剂的前药且可同义使用。
“水凝胶”可被定义为能够吸收大量水的三维、亲水性或两亲性聚合网状结构。所述网状结构由均聚物或共聚物构成，并且由于存在共价化学交联或物理(离子性、疏水性相互作用、缠结(entanglement))交联而为不溶性的。所述交联提供网状结构和物理完整性。水凝胶表现出与水的热力学兼容性，这使它们在水性介质中溶胀。所述网状结构的链按存在孔隙的方式连接，并且这些孔隙中的大部分的尺寸在1nm至1000nm之间。
药物的“游离形式”是指所述未经修饰的药理学活性形式的药物，特别是glp-1/胰高血糖素激动剂，诸如从聚合物缀合物中释放之后。
术语"药物"、"生物活性分子"、"生物活性部分"、"生物活性剂"、"活性剂"同义地使用且是指glp-1/胰高血糖素激动剂，呈其结合形式或游离形式。
本申请使用的glp-1/胰高血糖素激动剂的"治疗有效量"是指足以治愈、缓解或部分阻止给定疾病及其并发症临床表现的量。将足以完成该目标的量定义为"治疗有效量"。用于每种目的的有效量依赖于疾病或损害的严重程度以及受试者的体重和一般状态。应当理解的是，可通过以下方式使用常规实验确定合适剂量：构建数值矩阵(matrixofvalue)并测试所述矩阵中的不同点，该方式在训练有素的医师所掌握的常规技术范围之内。
“稳定的”和“稳定性”意指在所指示的储存时间内，所述水凝胶缀合物保持为缀合的，且不会很大程度水解并且展现出可接受的与glp-1/胰高血糖素激动剂有关的杂质分布。含有小于5％游离形式药物的组合物被认为是稳定的。
术语“药学可接受的”意指经管理机构诸如emea(欧洲)和/或fda(美国)和/或任何其它国家管理机构批准，在动物优选人中使用。
"医药组合物"或“组合物”意指一种或多种活性成分和一种或多种惰性成分以及由以下方式直接或间接得到的任意产物：所述成分中的任意两种或多种的组合(combination)、复合(complexation)或聚集(aggregation)；所述成分中的一种或多种的解离(dissociation)；或所述成分中的一种或多种的其它类型的反应或相互作用。因此，本发明的医药组合物涵盖通过本发明化合物与药学可接受的赋形剂(药学可接受的载体)混合制备的任意组合物。
“干燥组合物(drycomposition)”意指以置于容器中的干燥形式提供的glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药组合物。用于干燥的适当方法为例如喷雾干燥和冻干(冷冻干燥)。glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药的此类干燥组合物具有最高10％的残余含水量，优选小于5％和更优选小于2％(根据karlfischer法确定)。优选的干燥方法为冻干。“冻干的组合物”意指先将glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶聚合物前药组合物冷冻，随后借助于减压使其经历水减少(waterreduction)。该术语并不排除在将所述组合物填装在最终容器之前在制备过程中发生的额外干燥步骤。
“冻干”(冷冻干燥)为脱水过程，特征为使组合物冷冻，然后降低环境压力，并且任选加热以使所述组合物中的冷冻水直接从固相升华为气体。通常，通过去升华收集升华的水。
“重构(reconstitution)”意指向干燥组合物中加入液体以使其恢复至液体或悬浮液组合物的形式。应当理解的是，术语“重构”不限于加入水，而是指加入任何液体，包括例如缓冲液或其它水溶液。
“重构溶液”是指用于在给药至有此需要的患者之前用于重构glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药的干燥组合物的液体。
“容器”意指其中包含glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药组合物并可在重构前一直储存的任意容器。
“缓冲物(buffer)”或“缓冲剂(bufferingagent)”是指将ph保持在所期望范围内的化合物。生理学耐受的缓冲物为例如磷酸钠、琥珀酸盐、组胺酸、碳酸氢盐、枸橼酸盐和乙酸盐、丙酮酸盐。也可使用抗酸剂(antacid)诸如mg(oh)2或znco3。可调整缓冲能力以与对ph稳定性最敏感的条件相匹配。
“赋形剂”是指与治疗剂一起给药的化合物，例如缓冲剂、等渗调节剂、防腐剂、稳定剂、抗吸附剂、氧化保护剂或其它助剂。然而，在一些情况下，一种赋形剂可具有双重或三重功能。
"冻干保护剂(lypprotectant)"为当与感兴趣的蛋白结合时显着预防或降低所述蛋白经一般干燥时并且尤其是在冻干和随后的储存过程中的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性冻干保护剂包括糖，诸如蔗糖或海藻糖；氨基酸，诸如精胺酸、甘胺酸、谷胺酸或组胺酸；甲基胺，诸如甜菜碱；易溶性盐(lyotropicsalt)，诸如硫酸镁；多元醇，诸如三元或更高级的糖醇，例如甘油(glycerin)、赤藓醇、丙三醇(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；乙二醇；丙二醇；聚乙二醇；普流罗尼类(pluronics)；羟基烷基淀粉，诸如羟基乙基淀粉(hes)和它们的组合。
“表面活性剂”是指降低液体的表面张力的润湿剂。
“等渗调节剂”是指使疼痛最小化的化合物，所述疼痛是由注射储库的渗透压差导致的细胞损伤引起的。
术语“稳定剂”是指用于稳定聚合物前药的化合物。通过以下方式实现稳定作用：增强蛋白稳定力、使变性状态脱稳定化或赋形剂与所述蛋白直接结合。
“抗吸附剂”是指用于涂覆或竞争性吸附在组合物容器的内表面的主要为离子性或非离子性的表面活性剂或其它蛋白或可溶性聚合物。所选择的赋形剂浓度和类型取决于待避免的作用，但通常在恰高于cmc值的界面形成一单层表面活性剂。
“氧化保护剂”是指抗氧化剂诸如抗坏血酸、四氢甲基嘧啶羧酸(ectoine)、谷胱甘肽、甲硫胺酸、单硫代丙三醇、桑色素(morin)、聚乙烯亚胺(pei)、没食子酸丙酯、维生素e、螯合剂诸如枸橼酸、edta、六磷酸盐、巯基乙酸。
“抗菌剂”是指杀死或抑制微生物生长和/或摧毁病毒的化学物质，该微生物为诸如细菌、真菌、酵母菌、原生动物。
“将容器密封”意指将所述容器按使其密闭、不允许内外气体交换和保持内容物无菌的方式封闭。
术语“试剂”或“前体”是指在得到本发明前药的组装过程(assemblyprocess)中使用的中间体或起始物质。
本发明的一个目的为前药或其药学可接受的盐，其包含式(i)的药物接头缀合物
z-l1–l2-l-y-r20(i)
其中y为具有式(ii)的肽
his-x2-x3-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-leu-asp-glu-gln-x18-ala-x20-x21-phe-ile-glu-trp-leu-ile-x28-gly-gly-pro-x32-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser
(ii)
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自arg和lys的氨基酸残基，
x20代表选自lys、gln和his的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基，
或者其中y为具有式(iii)的肽
his-x2-x3-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-leu-asp-glu-gln-x18-ala-x20-x21-phe-ile-glu-trp-leu-ile-x28-gly-gly-pro-x32-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser
(iii)
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自leu和his的氨基酸残基，
x20代表选自his、arg、lys和gln的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自lys、ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基，
或者
其中y为具有式(iv)的肽
his-x2-x3-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-leu-leu-asp-glu-gln-x18-ala-lys-asp-phe-ile-glu-trp-leu-ile-ala-gly-gly-pro-x32-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser
(iv)
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自arg和leu的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基，
或其盐或溶剂合物；
或其盐或溶剂合物；
r20为oh或nh2；
l为式(ia)的接头，
其中虚线指示通过形成酰胺键与y的n-末端的连接；
x为c(r4r4a)；n(r4)；
r1、r1a独立地选自：h；和c1-4烷基；
r2、r2a独立地选自：h；和c1-4烷基；
r4、r4a独立地选自：h；和c1-4烷基；
其中r2、r2a、r4或r4a取代有一个基团l2-l1-z；其中
l2为单一化学键或为c1-20烷基链，其任选被一个或多个独立地选自-o-和c(o)n(r3aa)的基团中断且任选取代有一个或多个独立地选自oh和c(o)n(r3aar3aaa)的基团，其中r3aa和r3aaa独立地选自：h和c1-4烷基；且
l2经由选自的末端基团连接于l1
其中l2连接于以虚线指示的一个位置且l1连接于以另一虚线指示的位置；且
l1为c1-20烷基链，其任选被一个或多个独立地选自-o-和c(o)n(r5aa)的基团中断且任选取代有一个或多个独立地选自oh和c(o)n(r5aar5aaa)的基团，其中r5aa和r5aaa独立地选自：h和c1-4烷基；且
l1经由末端氨基连接于z，该末端氨基与z的透明质酸的β-1,3-d-葡糖醛酸的羧基形成酰胺键；
z为交联的透明质酸水凝胶，其中
0.05至20％的单体二糖单元通过交联剂交联；且0.2至8.5％的单体二糖单元带有l1-l2-l-y-r20基团。
l、l1、l2、z和y的其它实施方案。
在另一实施方案中
l为式(ib)的接头部分，
其中虚线指示通过形成酰胺键与y的连接；
r1、r1a、r2a独立地选自：h和c1-4烷基；
l2-l1-z如上文所定义。
在另一实施方案中
l为式(ib)的接头部分，其中
r1为ch3；
r1a为h；
r2a为h；且
l2-l1-z如上文所定义。
在另一实施方案中
l为式(ib)的接头部分，其中
r1为h；
r1a为ch3；
r2a为h；且
l2-l1-z如上文所定义。
在另一实施方案中
l为式(ib)的接头部分，其中
r1为ch3；
r1a为ch3；
r2a为h；且
l2-l1-z如上文所定义。
在另一实施方案中
l为式(ic)的接头部分-l，
其中虚线指示通过形成酰胺键与y的连接；r1选自h或c1-4烷基，优选h；
r1a选自h或c1-4烷基，优选h；
r2、r2a独立地选自：h和c1-4烷基；
其中l2-l1-z如上文所定义。
在另一实施方案中
l为式(ic)的接头部分-l，
其中虚线指示通过形成酰胺键与y的连接；
r1和r1a为h；
r2、r2a独立地选自：h和ch3；
其中l2-l1-z如上文所定义。
在另一实施方案中
l为式(ic)的接头部分-l，其中
r1和r1a为h；
r2为h和r2a为ch3；
其中l2-l1-z如上文所定义。
在另一实施方案中
l2为c1-10烷基链，其任选被一个或两个独立选自-o-和c(o)n(r3aa)的基团中断，且其中r3aa独立地选自：h和c1-4烷基；且
l2经由选自的末端基团连接于l1
其中l2连接于以虚线指示的一个位置且l1连接于以另一虚线指示的位置；且在另一实施方案中
l2为c1-6烷基链，其任选被一个选自-o-和c(o)n(r3aa)的基团中断，且其中r3aa独立地选自：h和c1-4烷基；且
l2经由选自的末端基团连接于l1
其中l2连接于以虚线指示的一个位置且l1连接于以另一虚线指示的位置。
在另一实施方案中
l2为-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-c(o)nh-or-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-且经由末端基团连接于l1
其中l2连接于以虚线指示的硫原子且l1连接于以虚线指示的氮原子。
在另一实施方案中
l1为c1-10烷基链，其中一个氨基位于一侧远端，其任选被一个或两个独立选自-o-和c(o)n(r5aa)的基团中断，且其中r5aa独立地选自：h和c1-4烷基。
进一步的实施方案涉及前药，其中
z为交联的透明质酸水凝胶，其中
0.05至15％的单体二糖单元通过交联剂交联。
进一步的实施方案涉及前药，其中
z为交联的透明质酸水凝胶，其中
1至10％的单体二糖单元通过交联剂交联。
进一步的实施方案涉及前药，其中
z为交联的透明质酸水凝胶，其中
0.2至8.5％的单体二糖单元带有l1-l2-l-y-r20基团。
进一步的实施方案涉及前药，其中
z为交联的透明质酸水凝胶，其中
0.2至6％的单体二糖单元带有l1-l2-l-y-r20基团。
进一步的实施方案涉及前药，其中
z为交联的透明质酸水凝胶，其中
0.2至5％的单体二糖单元带有l1-l2-l-y-r20基团。
进一步的实施方案涉及前药，其中
z为交联的透明质酸水凝胶，其中
0.4至4％的单体二糖单元带有l1-l2-l-y-r20基团。
在另一实施方案中，所述glp-1/胰高血糖素激动剂前药具有由式(v)所代表的结构
在另一实施方案中，所述glp-1/胰高血糖素激动剂前药具有由式(vi)所代表的结构(aib-接头)
在另一实施方案中，所述glp-1/胰高血糖素激动剂前药具有由式(vi)所代表的结构
进一步的实施方案涉及具有式(ii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表arg
x20代表选自lys、gln和his的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(ii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表d-ser
x3代表his，
x18代表arg
x20代表lys，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(ii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表d-ser，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表arg，
x20代表lys，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表ala，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(ii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表his，
x18代表arg，
x20代表lys，
x21代表asp，
x28代表ala，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(ii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自arg和lys的氨基酸残基，
x20代表lys，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(ii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自arg和lys的氨基酸，
x20代表选自的氨基酸残基lys、gln和his，
x21代表asp，
x28代表选自ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(ii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自arg和lys的氨基酸，
x20代表选自lys、gln和his的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自ser和ala的氨基酸残基，
x32代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(ii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表arg
x20代表lys，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表ala，
x32代表val。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表leu
x20代表选自his、arg、lys和gln的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自lys、ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表aib，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自his和leu的氨基酸残基；
x20代表选自his、arg、lys和gln的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自lys、ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表aib，
x3代表his，
x18代表leu，
x20代表lys，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表his，
x18代表选自his和leu的氨基酸残基，
x20代表选自his、arg、lys和gln的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自lys、ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表gln，
x18代表leu，
x20代表lys，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表ala，
x32代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自his和leu的氨基酸残基，
x20代表lys，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自lys、ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自his和leu的氨基酸残基，
x20代表选自his、arg、lys和gln的氨基酸残基，
x21代表asp，
x28代表选自lys、ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表aib，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表leu，
x20代表选自lys和gln的氨基酸残基，
x21代表glu，
x28代表ala，
x32代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自his和leu的氨基酸残基，
x20代表选自his、arg、lys和gln的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表ala，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自his和leu的氨基酸残基，
x20代表选自his、arg、lys和gln的氨基酸残基，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自lys、ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(ii)或(iii)的肽部分y的一组前药，其中
x2代表选自aib和d-ser的氨基酸残基，
x3代表his，
x18代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自leu和arg的氨基酸残基，
x20代表lys，
x21代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x28代表选自ser和ala的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iv)的肽部分的一组前药，其中
x2代表d-ser，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自arg和leu的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iv)的肽部分的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表his，
x18代表选自arg和leu特别是leu的氨基酸残基，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iv)的肽部分的一组前药，其中
x2代表d-ser，
x3代表gln，
x18代表arg，
x32代表选自ser和val的氨基酸残基。
进一步的实施方案涉及具有式(iv)的肽部分的一组前药，其中
x2代表选自ser、d-ser和aib的氨基酸残基，
x3代表选自gln和his的氨基酸残基，
x18代表选自arg和leu的氨基酸残基，
x32代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药
h2n-his-aib-his-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-leu-x15-glu-gln-leu-ala-arg-
asp-phe-ile-glu-trp-leu-ile-bal-x29-gly-x31-x32-ser-x34-x35-pro-pro-pro-x39-r20
(iva)
其中
x15代表选自asp和glu(优选asp)的氨基酸残基，
x29代表选自gly、d-ala和pro(优选gly、d-ala)的氨基酸残基，
x31代表选自pro、his和trp(优选pro)的氨基酸残基，
x32代表选自ser、his、pro和arg(优选ser、his、pro)的氨基酸残基，
x34代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x35代表选自ala、pro和lys(优选ala、pro)的氨基酸残基，
x39代表ser或pro-pro-pro，
或其盐或溶剂合物。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表asp，
x29代表选自gly、d-ala和pro的氨基酸残基，
x31代表选自pro、his和trp的氨基酸残基，
x32代表选自ser、his、pro和arg的氨基酸残基，
x34代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x35代表选自ala、pro和lys的氨基酸残基，
x39代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x29代表gly，
x31代表选自pro、his和trp的氨基酸残基，
x32代表选自ser、his、pro和arg的氨基酸残基，
x34代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x35代表选自ala、pro和lys的氨基酸残基，
x39代表ser或pro-pro-pro。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x29代表gly，
x31代表pro，
x32代表选自ser、his和pro的氨基酸残基，
x34代表gly，
x35代表ala，
x39代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表asp，
x29代表d-ala，
x31代表pro，
x32代表pro，
x34代表d-ala，
x35代表选自ala和pro的氨基酸残基，
x39代表ser或pro-pro-pro。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x29代表选自gly、d-ala和pro的氨基酸残基，
x31代表pro，
x32代表选自ser、his、pro和arg的氨基酸残基，
x34代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x35代表选自ala、pro和lys的氨基酸残基，
x39代表ser或pro-pro-pro。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表asp，
x29代表gly，
x31代表his，
x32代表pro，
x34代表gly，
x35代表选自ala和lys的氨基酸残基，
x39代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表asp，
x29代表选自gly和pro的氨基酸残基，
x31代表pro，
x32代表ser，
x34代表gly，
x35代表ala，
x39代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x29代表选自gly、d-ala和pro的氨基酸残基，
x31代表选自pro、his和trp的氨基酸残基，
x32代表pro，
x34代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x35代表选自ala、pro和lys的氨基酸残基，
x39代表ser或pro-pro-pro。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表asp，
x29代表选自gly和pro的氨基酸残基，
x31代表pro，
x32代表his，
x34代表gly，
x35代表ala，
x39代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x29代表选自gly、d-ala和pro的氨基酸残基，
x31代表选自pro、his和trp的氨基酸残基，
x32代表选自ser、his、pro和arg的氨基酸残基，
x34代表gly，
x35代表选自ala、pro和lys的氨基酸残基，
x39代表ser或pro-pro-pro。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表asp，
x29代表d-ala，
x31代表pro，
x32代表选自ser和pro的氨基酸残基，
x34代表d-ala，
x35代表选自ala和pro的氨基酸残基，
x39代表ser或pro-pro-pro。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x29代表选自gly、d-ala和pro的氨基酸残基，
x31代表选自pro、his和trp的氨基酸残基，
x32代表选自ser、his、pro和arg的氨基酸残基，
x34代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x35代表ala，
x39代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表asp，
x29代表gly，
x31代表选自pro和his的氨基酸残基，
x32代表pro，
x34代表gly，
x35代表lys,
x39代表ser。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表asp，
x29代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x31代表pro，
x32代表pro，
x34代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x35代表pro，
x39代表pro-pro-pro。
进一步的实施方案涉及具有式(iva)的肽部分的一组前药，其中
x15代表选自asp和glu的氨基酸残基，
x29代表选自gly、d-ala和pro的氨基酸残基，
x31代表选自pro、his和trp的氨基酸残基，
x32代表选自ser、his、pro和arg的氨基酸残基，
x34代表选自gly和d-ala的氨基酸残基，
x35代表选自ala、pro和lys的氨基酸残基，
x39代表ser。
在一个实施方案中，y是指具有seq.idno60的glp-1/胰高血糖素激动剂。
在一个实施方案中，y是指选自序列seq.idno4至60的glp-1/胰高血糖素激动剂。
在一个实施方案中，y是指选自序列seq.idno4至44的glp-1/胰高血糖素激动剂。
在一个实施方案中，y是指选自序列seq.idno4至22的glp-1/胰高血糖素激动剂。
在一个实施方案中，y是指选自序列seq.idno23至39的glp-1/胰高血糖素激动剂。
在一个实施方案中，y是指选自序列seq.idno40至44的glp-1/胰高血糖素激动剂。
在一个实施方案中，y是指选自序列seq.idno45至59的glp-1/胰高血糖素激动剂。
在一个实施方案中，y是指选自序列seq.idno18、21和26的glp-1/胰高血糖素激动剂。
在一个实施方案中，y是指选自序列seq.idno18、21、26、45、48、49和60的glp-1/胰高血糖素激动剂。
表1
另一实施方案涉及序列号为60的肽及其作为药物的用途。
在包含式(i)化合物的glp-1/胰高血糖素激动剂前药含有一个或多个酸性或碱性基团的情况下，本发明还包括它们相应的药学上或毒理学上可接受的盐，特别是它们的药学上可利用的盐。因此，包含含有酸性基团的式(i)化合物的glp-1/胰高血糖素激动剂前药可根据本发明使用，例如，作为碱金属盐、碱土金属盐或作为铵盐。此类盐的更准确的实施例包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或者与氨或有机胺(诸如，乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸)的盐。包含含有一个或多个碱性基团(即可被质子化的基团)的glp-1/胰高血糖素激动剂前药可存在，并且可根据本发明以它们与无机酸或有机酸的加成盐形式使用。合适的酸的实施例包括氯化氢、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、枸橼酸、己二酸，和本领域技术人员公知的其它酸。如果包含式(i)化合物的glp-1/胰高血糖素激动剂前药在分子中同时含有酸性和碱性基团，除了所提到的盐形式，本发明还包括内盐或内铵盐(两性离子)。包含式(i)的glp-1/胰高血糖素激动剂前药的相应的盐可通过本领域技术人员公知的常规方法获得，例如通过使它们与有机酸或无机酸或者有机碱或无机碱在溶剂或分散剂中接触，或者通过与其它盐进行阴离子交换或阳离子交换。本发明还包括包含式(i)化合物的glp-1/胰高血糖素激动剂前药的所有盐，其由于低的生理兼容性，不直接适用于药物的用途，但它可用作例如用于化学反应的中间体或用于药学可接受的盐的制备。
制备方法
所述肽y可由本领域已知的简便方法制备。
接头l通过实施例中所述以及如wo2009/095479、wo2011/012718和wo2012/035139中所披露的方法制备。
本发明的水凝胶-连接的glp-1/胰高血糖素激动剂前药可通过合成构造块活化的透明质酸水凝胶z-l1*和活化的肽接头缀合物l2*-l-y制备。
活化的基团l1*和l2*可用于使肽缀合至聚合物。
方案1示出不同类型的连接化学，其可用于使具有自降解(self-immolative)接头的肽与聚合物缀合。因此，除了巯基-马来酰亚胺化学之外，可使用其它双正交化学。在方案1中，虚线指示其中l1和l2连接的位置。
在将glp-1/胰高血糖素激动剂-接头缀合物装载至官能化透明质酸水凝胶之后，所有剩余官能团任选用合适的阻隔试剂封端以免受不期望的副反应。
在含官能化马来酰亚氨基团的ha-水凝胶条件下，含巯基的化合物诸如巯基乙醇是合适的阻隔基团。
方案1
本发明的另一方面是包含glp-1/胰高血糖素激动剂-接头缀合物l2*-l–y的官能化中间体。
glp-1/胰高血糖素激动剂-接头缀合物l2*-l-y的一个实施方案包含巯基官能化，得到下式
hs-l2-l-y
其中l2、l和y具有上文所述的含义。
巯基官能化的glp-1/胰高血糖素激动剂-接头缀合物l2*-l-y的一个实施方案是式(viii)的glp-1/胰高血糖素激动剂-接头缀合物
巯基官能化的glp-1/胰高血糖素激动剂-接头缀合物l2*-l-y的一个实施方案是式(ix)的glp-1/胰高血糖素激动剂-接头缀合物
巯基官能化的glp-1/胰高血糖素激动剂-接头缀合物l2*-l-y的一个实施方案是式(x)的glp-1/胰高血糖素激动剂-接头缀合物
医药组合物
本发明的另一方面是一种医药组合物，其包含本发明的前药或其药学可接受的盐以及药学可接受的赋形剂的。所述医药组合物在以下段落中进一步描述。
glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的组合物可以悬浮液组合物或以干燥组合物的形式提供。在一个实施方案中，glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的医药组合物为干燥组合物。合适的干燥方法为例如喷雾干燥和冻干(冷冻干燥)。优选地，glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的医药组合物通过冻干法干燥。
在另一实施方案中glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的医药组合物准备使用悬浮液。
在另一实施方案中glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的医药组合物准备使用悬浮液，其中所述前药在水/缓冲液中膨胀至浓度为0.5至8％(w/v)。
在另一实施方案中glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的医药组合物准备使用悬浮液其中所述前药在水/缓冲液中膨胀至浓度为1至4％(w/v)。
在另一实施方案中glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的医药组合物准备使用悬浮液其中所述前药在水/缓冲液中膨胀至浓度为1.5至3％(w/v)。
优选地，所述glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药在组合物中足量给药以在一次施用中提供至少三天的治疗有效量的glp-1/胰高血糖素激动剂。更优选地，glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药的一次施用在一周内是足量的。
本发明的glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的医药组合物含有一种或多种赋形剂。
在肠胃外组合物中使用的赋形剂可分为如下几类：缓冲剂、等渗调节剂、防腐剂、稳定剂、抗吸附剂、氧化保护剂、增粘剂/粘度增强剂，或其它辅助剂。在一些情况下，这些成分可具有双重或三重功能。本发明的glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的组合物含有一种或多种赋形剂，其选自：
(i)缓冲剂：保持ph在理想范围内的生理学耐受缓冲剂，诸如磷酸钠、碳酸氢钠、琥珀酸钠、组胺酸钠、枸橼酸钠和乙酸钠、硫酸钠、硝酸钠、氯化钠、丙酮酸钠。也可使用抗酸剂诸如mg(oh)2或znco3。可调节缓冲能力以符合对ph稳定性最敏感的条件。
(ii)等渗调节剂：最小化可由细胞损伤导致的疼痛的化合物，所述细胞损伤由于在注射储库的渗透压差异所导致。实施例为甘油和氯化钠。有效浓度可通过使用对于血清为285-315mosmol/kg的假定克分子渗透压重量浓度(osmolality)进行渗透压力测定法来确定。
(iii)防腐剂和/或抗菌剂：多剂量肠胃外制剂需要加入以最小化患者在注射后变为受感染的风险的足量浓度的防腐剂，且已经建立了相应的法规需要量。典型的防腐剂包括间甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苄醇、苯基硝酸汞、硫柳汞、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯铵。
(iv)稳定剂：稳定作用通过加强蛋白质稳定力、变性状态的去稳定化或赋形剂与蛋白质的直接结合来实现。稳定剂可为氨基酸诸如丙胺酸、精胺酸、天冬胺酸、甘胺酸、组胺酸、赖胺酸、脯胺酸，糖类诸如葡萄糖、蔗糖、海藻糖，多元醇诸如甘油、甘露醇、山梨醇，盐类诸如磷酸钾、硫酸钠，螯合剂诸如edta、六磷酸盐，配体诸如二价金属离子(锌离子、钙离子等)，其它盐类或有机分子诸如苯酚衍生物。此外，可使用寡聚体或聚合物诸如环糊精、右旋糖酐、树状聚物、peg或pvp或鱼精蛋白或has。
(v)抗吸附剂：用于与组合物或组合物容器的内表面竞争性包衣或吸附的主要离子型或非离子型表面活性剂或其它蛋白质或可溶聚合物。例如，泊洛沙姆(pluronicf-68)、peg十二烷基醚(brij35)、聚山梨酸酯20和80、右旋糖酐、聚乙二醇、peg-聚组胺酸、bsa和has和明胶。赋形剂的选择浓度和类型取决于应避免的作用，但典型地在恰好高于cmc值在界面处形成单层的表面活性剂。
(vi)冻干保护剂和/或冷冻保护剂：在冷冻干燥或喷雾干燥过程中，赋形剂可抵消由氢键断裂和水除去引起的不稳定作用。对于该目的，可使用糖类和多元醇，但相应的正性作用也已经在表面活性剂、氨基酸、非水溶剂和其它肽中观察到。海藻糖特别有效地降低潮湿引起的聚集且也改善了可能通过将蛋白疏水基团暴露于水引起的热稳定性。也可使用甘露醇和蔗糖作为单独的冻干保护剂/冷冻保护剂或彼此联用，其中高比例的甘露醇:蔗糖已知为增强冷冻干燥饼的物理稳定性。甘露醇也可与海藻糖组合。海藻糖也可与山梨醇或作为单独保护剂使用的山梨醇组合。也可使用淀粉或淀粉衍生物。
(vii)氧化保护剂：抗氧化剂诸如抗坏血酸、四氢甲基嘧啶羧酸、蛋胺酸、谷胱甘肽、单硫代甘油、桑色素、聚乙烯亚胺(pei)、没食子酸丙酯、维生素e，螯合剂诸如枸橼酸、edta、六磷酸盐(酯)、巯基乙酸。
(viii)增粘剂或粘度增强剂：使用颗粒在小瓶和注射器中的延缓沉降以促进颗粒的混合和重新混悬并且使得所述混悬液易于注射(即施加于注射器柱塞的力小)。合适的增粘剂或粘度增强剂为，例如，卡波姆增粘剂如carbopol940、carbopolultrez10，纤维素衍生物如羟基丙基甲基纤维素(羟丙甲纤维素、hpmc)或二乙基氨基乙基纤维素(deae或deae-c)，胶状硅酸镁(veegum)或硅酸钠，羟基磷灰石凝胶，磷酸三钙凝胶，黄原胶，角叉藻聚糖如satia树胶utc30，脂族聚(羟基酸)诸如聚(d,l-或l-乳酸)(pla)和聚(羟乙酸)(pga)以及它们的共聚物(plga)，d,l-丙交酯、乙交酯和己内酯的三聚物，泊洛沙姆，亲水性聚(氧乙烯)嵌段和疏水性聚(氧丙烯)嵌段以制成聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)-聚(氧乙烯)的三嵌段(例如
(ix)铺展剂或分散剂：通过在细胞间隔的细胞外基质中的组分(诸如但不限于透明质酸，其为存在于结缔组织的细胞间隙中的多糖)的水解来修饰结缔组织的渗透性。铺展剂诸如但不限于玻璃酸酶，其暂时降低细胞外基质的粘度且促进注射药物的分散。
(x)其它辅助剂：诸如湿润剂、粘度修饰剂、抗生素、玻璃酸酶。酸和碱诸如盐酸和氢氧化钠为对于在制造过程中ph调节所必需的辅助剂。
在一个实施方案中，glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的组合物含有一种或多于一种增粘剂和/或粘度调节剂。
在另一实施方案中，glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的组合物含有作为增粘剂和/或粘度调节剂的透明质酸。
在另一实施方案中，glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的组合物包含作为增粘剂和/或粘度调节剂的透明质酸，其浓度为5至30wt％。
在另一实施方案中，glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的组合物包含作为增粘剂和/或粘度调节剂的透明质酸，其分子量为200kda至6百万kda。
在另一实施方案中，glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的组合物包含作为增粘剂和/或粘度调节剂的透明质酸，其分子量为500kda至3百万kda.
术语"赋形剂"优选地是指与治疗药物一起给药的稀释剂、佐剂或媒介物。此类药物赋形剂可为无菌液体。当医药组合物口服给药时，水为优选的赋形剂。当医药组合物静脉内给药时，盐水和葡萄糖水溶液为优选的赋形剂。盐水溶液和葡萄糖水溶液及甘油溶液优选地用作可注射溶液的液体赋形剂。
合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述组合物也可含有少量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。这些组合物可采用溶液剂、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、持续释放制剂等形式。此类组合物将含有治疗有效量的治疗药物(优选地为纯化形式)以及合适量的赋形剂以对患者提供适当给药的形式。该制剂适合给药模式。
在一般实施方案中，无论是呈干燥形式还是悬浮液或呈其它形式的本发明的医药组合物可作为单一或多剂量组合物来提供。
在本发明的一个实施方案中，glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的干燥组合物作为单一剂量来提供，这表示提供它的容器中含有一个药物剂量。
因此，在本发明的另一方面，所述组合物作为单一剂量组合物来提供。
在本发明的另一方面，所述组合物包含在容器中。在一个实施方案中，所述容器为双室注射器。特别地在双室注射器的第一室中提供本发明的干燥组合物且在双室注射器的第二室中提供重构溶液。
在对有此需要的患者施用glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的干燥组合物之前，重构所述干燥组合物。可在容器中进行重构，在该容器中glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的干燥组合物可在诸如小瓶、注射器、双室注射器、安瓿和药筒中提供。通过将预定量的重构溶液加入至所述干燥组合物中完成重构。重构溶液为无菌液体，诸如水或缓冲液，其可进一步含有添加剂，诸如防腐剂和/或抗菌剂。如果glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药组合物作为单一剂量提供时，则所述重构溶液可含有一种或多种防腐剂和/或抗菌剂。优选地，所述重构溶液为无菌水。
本发明的另一方面涉及给药重构的glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药组合物的方法。所述glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药组合物可通过包括皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内和腹膜内的注射或输注的方法来给药。
另一方面为制备重构的组合物的方法，所述组合物包含治疗有效量的glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药以及任选一种或多种药学可接受的赋形剂，其中该glp-1/胰高血糖素激动剂与水凝胶暂时连接，所述方法包括以下步骤：
●使本发明组合物与重构溶液接触。
另一方面为重构的组合物，其包含治疗有效量的glp-1/胰高血糖素激动剂水凝胶前药以及任选一种或多种药学可接受的赋形剂，其中所述glp-1/胰高血糖素激动剂与通过上面方法得到的水凝胶暂时连接。
本发明的另一方面为制备glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的干燥组合物的方法。在一个实施方案中，此类混悬液组合物如下制备：
(i)使glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药与一种或多种赋形剂混合，
(ii)转移相当于单一或多剂量的量的组合物于适当的容器中，
(iii)在该容器中干燥组合物，和
(iv)密封该容器。
合适的容器为小瓶、注射器、双室注射器、安瓿和药筒。
另一方面为套组(kitofparts)。当给药装置仅为皮下注射器时，所述套组可包含注射器、针头以及与注射器一起使用的包含干燥的glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药组合物的容器和包含重构溶液的第二容器。在更优选的实施方案中，所述注射装置不是简单的皮下注射器，且由此含有重构的glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的分开的容器适于与注射装置接合以使得在使用时在容器中的液体组合物与注射装置的出口流体连接。给药装置的实施例包括但不限于皮下注射器和笔式注射装置。特别优选的注射装置为笔式注射器，在该情况下所述容器为药筒，优选地为可更换的药筒。
优选的套盒包括针头以及含有本发明组合物且任选进一步含有重构溶液的容器，所述容器适于与针头一起使用。优选地，所述容器为双室注射器。
在另一方面，本发明提供了与笔式注射器装置一起使用的含有如上所述的glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的组合物的药筒。所述药筒可含有单一剂量或者多剂量的glp-1/胰高血糖素激动剂。
在本发明的一个实施方案中，glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药的悬浮液组合物不仅包含glp-1/胰高血糖素激动剂-水凝胶前药以及一种或多种赋形剂，而且还含有游离形式或作为前药的其它生物活性剂。优选地，此类另外的一种或多种生物活性剂为前药，更优选地为水凝胶前药。此类生物活性剂包括但不限于以下各类的化合物：
可注射性
优选地，所述制剂可通过注射器经内径小于0.26mm(26号)的针头给药，甚至更优选经内径小于0.18mm(28号)的针头给药，且最优选经内径小于0.16mm(30号)的针头给药。
应当理解的是，术语“可通过注射给药”、“可注射的”或“可注射性”是指因素的组合，所述因素为诸如向含有本发明的生物可降解的ha水凝胶(在液体中在特定浓度(w/v)和在特定温度溶胀)的注射器的柱塞施加一定的力、与所述注射器的出口相连的给定内径的针头和从注射器中通过针头挤出一定体积的本发明的生物可降解的水凝胶所需的时间。
为了提供注射性，体积为1ml的溶胀于水中且包含于注射器(装有直径为4.7mm的柱塞)中的本发明的glp-1/胰高血糖素激动剂前药可在室温在10秒内通过施加等于/小于20牛顿的力经26号针挤出。
优选的可注射性为体积为1ml的溶胀于水中且包含于注射器(装有直径为4.7mm的柱塞)中的本发明的glp-1/胰高血糖素激动剂前药可在室温在10秒内通过施加等于/小于20牛顿的力经30号针挤出。
令人惊奇地发现，聚合物上的肽载量越高，本发明的ha载体需要用于注射的力越小(图5)。
为了提供注射性，体积为1ml的溶胀于水/缓冲液中至浓度为至少1.5％(w/v)且包含于注射器(装有直径为4.7mm的柱塞)中的本发明的glp-1/胰高血糖素激动剂前药可在室温在10秒内通过施加小于30牛顿的力经30号针挤出。
对于溶胀于水/缓冲液中至浓度为至少2％(w/v)的本发明的glp-1/胰高血糖素激动剂前药，更优选的可注射性可通过施加小于30牛顿的力经30号针实现。
对于溶胀于水/缓冲液中至浓度为至少2％(w/v)的本发明的glp-1/胰高血糖素激动剂前药，最优选的可注射性可通过施加小于20牛顿的力经30号针实现。
该前药的一个重要特征是它停留在施用部位形成稳定的储库。聚合物的降解应当在药物释放之后启动。
组合疗法
本发明的前药，即针对glp-1和胰高血糖素受体的双重激动剂，可以广泛地与其它药理学活性化合物，诸如在roteliste2015中提及的所有药物进行组合，如，和roteliste2012，第1章中提及的所有减体重剂，在roteliste2015,第58章中提及的所有降脂药，在roteliste2015中提及的所有抗高血压药和肾保护药，或在roteliste2015,第36章中提及的所有利尿药进行组合。
所述活性成分组合可特别用于作用的协同性改善。它们或者可通过分开向患者给药所述活性成分而施用，或者可以组合产品(其中多种活性成分存在于一个药物制剂中)的形式施用。当通过活性成分分开给药来施用活性成分时，这可同时或连续地实现。
本文以下提及的大部分活性成分披露于uspdictionaryofusan和internationaldrugnames,uspharmacopeia,rockville2011。
适于此类组合的其它活性物质具体包括例如使一种或多种活性物质对所述适应症之一的治疗效果增强的那些和/或允许一种或多种活性物质的剂量降低的那些。
适于组合的治疗剂包括，例如，抗糖尿病药，诸如：
胰岛素和胰岛素衍生物，例如：甘精胰岛素(glargine)/
glp-1、glp-1类似物和glp-1受体激动剂，例如：利西拉来(lixisenatide)/ave0010/zp10/lyxumia、艾塞那肽(exenatide)/毒蜥外泌肽-4/byetta/bydureon/itca650/ac-2993、利拉鲁肽(liraglutide)/victoza、司美鲁肽(semaglutide)、他泊鲁肽(taspoglutide)、syncria/阿比鲁肽(albiglutide)、度拉鲁肽(dulaglutide)、r毒蜥外泌肽-4、cjc-1134-pc、pb-1023、ttp-054、langlenatide/hm-11260c、cm-3、glp-1eligen、ormd-0901、nn-9924、nn-9926、nn-9927、nodexen、viador-glp-1、cvx-096、zyog-1、zyd-1、gsk-2374697、da-3091、mar-701、mar709、zp-2929、zp-3022、tt-401、bhm-034。mod-6030、cam-2036、da-15864、ari-2651、ari-2255、艾塞那肽-xten和胰高血糖素-xten。
dpp-4抑制剂，例如：阿格列汀(alogliptin)/nesina、trajenta/利格列汀(linagliptin)/bi-1356/ondero/trajenta/tradjenta/trayenta/tradzenta、沙格列汀(saxagliptin)/onglyza、西格列汀(sitagliptin)/januvia/xelevia/tesave/janumet/velmetia、galvus/维格列汀(vildagliptin)、阿拉格列汀(anagliptin)、吉格列汀(gemigliptin)、替格列汀(teneligliptin)、美格列汀(melogliptin)、曲格列汀(trelagliptin)、da-1229、奥格列汀(omarigliptin)/mk-3102、km-223、依格列汀(evogliptin)、ari-2243、pbl-1427、哌诺沙星(pinoxacin)。
sglt2抑制剂，例如：invokana/卡格列净(canaglifozin)、forxiga/达格列净(dapagliflozin)、remoglifozin、舍格列净(sergliflozin)、依帕列净(empagliflozin)、伊格列净(ipragliflozin)、托格列净(tofogliflozin)、鲁格列净(luseogliflozin)、lx-4211、ertuglifozin/pf-04971729、ro-4998452、egt-0001442、kga-3235/dsp-3235、lik066、sbm-tfc-039。
双胍类(例如二甲双胍(metformin)、丁福明(buformin)、苯乙双胍(phenformin))、噻唑烷二酮类(例如吡格列酮(pioglitazone)、利格列酮(rivoglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)、曲格列酮(troglitazone))、双重ppar激动剂(例如阿格列扎(aleglitazar)、莫格列扎(muraglitazar)、替格列扎(tesaglitazar))、磺脲类(例如甲苯磺丁脲(tolbutamide)、格列本脲(glibenclamide)、格列美脲(glimepiride)/亚莫利(amaryl)、格列吡嗪(glipizide))、氯茴苯酸类(meglitinides)(例如那格列奈(nateglinide)、瑞格列奈(repaglinide)、米格列奈(mitiglinide))、α-葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol)、伏格列波糖(voglibose))、胰淀素(amylin)和胰淀素类似物(例如，普兰林肽(pramlintide)、symlin)。
gpr119激动剂(例如gsk-263a、psn-821、mbx-2982、apd-597、zyg-19、ds-8500)，gpr40激动剂(例如呋格列泛(fasiglifam)/tak-875、tug-424、p-1736、jtt-851、gw9508)。
其它合适的组合配对物为：cycloset、11-β-hsd的抑制剂(例如ly2523199、bms770767、rg-4929、bms816336、azd-8329、hsd-016、bi-135585)、葡糖激酶的激活剂(例如ttp-399、amg-151、tak-329、gkm-001)、dgat的抑制剂(如lcq-908)、蛋白质酪胺酸磷酸酯酶1的抑制剂(例如曲度奎明(trodusquemine))、葡萄糖-6-磷酸酶的抑制剂、果糖-1,6-二磷酸酶的抑制剂、糖原磷酸化酶的抑制剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的抑制剂、糖原合成酶激酶的抑制剂、丙酮酸脱氢激酶的抑制剂、α2-拮抗剂、ccr-2拮抗剂、sglt-1抑制剂(例如lx-2761)。
一种或多种降脂药也适于作为组合配对物，诸如：hmg-coa-还原酶抑制剂(例如辛伐他汀(simvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin))、贝特类(例如苯扎贝特(bezafibrate)、非诺贝特(fenofibrate))、烟酸及其衍生物(例如尼克酸(niacin))、ppar-(α、γ或α/γ)激动剂或调节剂(例如阿格列扎(aleglitazar))、ppar-δ激动剂、acat抑制剂(例如阿伐麦布(avasimibe))、胆固醇吸收抑制剂(例如依折麦布(ezetimibe))、胆汁酸结合物质(例如考来烯胺(cholestyramine)、考来维仑(colesevelam))、回肠胆汁酸转运抑制剂、mtp抑制剂或pcsk9的调节剂。
升hdl化合物，诸如：cetp抑制剂(例如托塞曲匹(torcetrapib)、安塞曲匹(anacetrapid)、达塞曲匹(dalcetrapid)、依塞曲匹(evacetrapid)、jtt-302、drl-17822、ta-8995)或abc1调节物。
其它适合的组合配对物是一种或多种用于治疗肥胖症的活性物质，诸如：西布曲明(sibutramine)、替索芬辛(tesofensine)、奥利司他(orlistat)、大麻素-1受体的拮抗剂、mch-1受体拮抗剂、mc4受体激动剂、npy5或npy2拮抗剂(例如维奈哌利(velneperit))、β-3-激动剂、瘦素或瘦素模拟物、5ht2c受体激动剂(例如氯卡色林(lorcaserin))或安非他酮(bupropione)/纳曲酮(naltrexone)、安非他酮(bupropione)/唑尼沙胺(zonisamide)、安非他酮/芬特明(phentermine)或普兰林肽(pramlintide)/美曲普汀(metreleptin)的组合。
其它合适的组合配对物为：
另外的胃肠肽诸如肽yy3-36(pyy3-36)或其类似物、胰多肽(pp)或其类似物。
胰高血糖素受体激动剂或拮抗剂、gip受体激动剂或拮抗剂、葛瑞林(ghrelin)拮抗剂或反激动剂、类爪蟾肽(xenin)及其类似物。
此外，具有用于影响高血压、慢性心力衰竭或动脉粥样硬化的药物的组合是合适的，所述药物诸如：血管紧张素ii受体拮抗剂(例如替米沙坦(telmisartan)、坎地沙坦(candesartan)、缬沙坦(valsartan)、氯沙坦(losartan)、依普罗沙坦(eprosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、他索沙坦(tasosartan)、阿齐沙坦(azilsartan))、ace抑制剂、ece抑制剂、利尿药、β-阻断剂、钙拮抗剂、中枢作用性降压药、α-2-肾上腺素能受体拮抗剂、中性肽链内切酶抑制剂、凝血细胞聚集作用抑制剂等或它们的组合。
用途
在另一方面，本发明涉及与至少一种上面描述的作为组合配对物的活性物质进行组合的本发明的前药或其生理学上可接受的盐，用于制备适于治疗或预防疾病或病症的药物的用途，其通过结合glp-1受体和胰高血糖素受体和通过调节它们的活性能够影响所述疾病或病症。
所述组合物可用于以glp-1/胰高血糖素激动剂和glp-1/胰高血糖素激动剂激动剂治疗或预防已知的疾病或病症的方法，例如，用于治疗和预防高血糖症及用于治疗和预防的任何类型的糖尿病，例如胰岛素依赖型糖尿病、非胰岛素依赖型糖尿病，前驱糖尿病或妊娠糖尿病，用于预防和治疗代谢综合征和/或肥胖和/或进食障碍，胰岛素抵抗综合征，降低血脂水平，降低心脏病风险，减少食欲，减少体重等。
本发明化合物在可用于治疗或预防脂肪肝(hepatosteatosis)，优选非酒精性肝病(nafld)和非酒精性脂肪性肝炎(steatohepatitis)(nash)。
本发明的前药或其生理学上可接受的盐，与一种或多种活性物质的组合使用可同时、单独或顺序地发生。
本发明的前药或其生理学上可接受的盐，与另一种活性物质的组合使用可同时发生或在错开的时间发生，但特别地在短的时间间隔内发生。如果它们同时施用，所述两种活性物质一起给药患者；如果它们在错开的时间使用，所述两种活性物质在少于或等于12小时的时期内给药患者，但特别地在少于或等于6小时的时期内给药患者。
因此，在另一方面，本发明涉及药物，其包含本发明的前药或此类化合物的生理学上可接受的盐以及至少一种上面描述的作为组合配对物的活性物质，以及任选和一种或多种惰性载体和/或稀释剂。
本发明的化合物，或其生理学上可接受的盐或溶剂合物，以及要与其组合的额外的活性物质，均可一起存在于一种制剂中，例如悬浮剂中，或者分开在两个相同或不同的制剂中，例如所谓的套组。
本发明的另一个方面是在需要治疗的哺乳动物患者(优选人类)中治疗、控制、延迟或预防一种或多种病症的方法，所述方法包括向所述患者给药治疗有效量的本发明的前药或本发明的医药组合物或其药学可接受的盐。
实施例
材料和方法
所使用的缩写如下：
aa氨基酸
acoh乙酸
acoet乙酸乙酯
camp环磷腺苷(cyclicadenosinemonophosphate)
bn苄基
boc第三丁基氧基羰基
bop(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻鎓六氟磷酸盐
bsa牛血清白蛋白
tbu第三丁基
dbu1,3-二氮杂二环[5.4.0]十一碳烯
dccn,n-二环己基碳二亚胺
dcm二氯甲烷
dde1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-乙基
ivdde1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)3-甲基-丁基
dicn,n'-二异丙基碳二亚胺
dipean,n-二异丙基乙基胺
dmap二甲基氨基-吡啶
dmemdulbecco改良的eagle培养基
dmf二甲基甲酰胺
dmso二甲基亚砜
dttdl二硫苏糖醇
edc1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
edt乙二硫醇
edta乙二胺四乙酸
eq化学计量当量
etoh乙醇
fbs胎牛血清
fmoc芴基甲基氧基羰基
hatuo-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
hbsshanks平衡盐溶液
hbtu2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲鎓六氟磷酸盐
hepes2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸
hobt1-羟基苯并三唑
hosun-羟基琥珀酰亚胺
hplc高效液相层析
htrf均相时间分辨荧光
ibmx3-异丁基-1-甲基黄嘌呤
lc/ms液相层析/质谱
mal3-马来酰亚氨基丙基
mal-peg6-nhsn-(3-马来酰亚氨基丙基)-21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧杂-二十一碳烷
酸nhs酯
me甲基
meoh甲醇
mmt4-甲氧基三苯甲基
ms质谱/质谱法
mtbe甲基第三丁基醚
mw分子量
nhsn-羟基琥珀酰亚胺
palm棕榈酰基
iproh2-丙醇
pbs磷酸盐缓冲盐水
peg聚乙二醇
pk药物动力学
pybop苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基-鏻鎓六氟磷酸盐
phth邻苯二甲酰亚氨基(phthalimido)
rp-hplc反相高效液相层析
rpm转/分钟
rt室温
sec尺寸排阻层析
tcep三(2-羧基乙基)膦盐酸盐
tes三乙基甲硅烷
tfa三氟乙酸
thf四氢呋喃
tmedan,n,n′n′-四甲基乙二胺
tris三(羟基甲基)氨基甲烷
trt三苯甲基
uplc超高效液相层析
uv紫外
v体积
实施例1
肽化合物的一般合成
材料：
使用不同的rink-酰胺树脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基-fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙酰氨基-正亮氨酰基氨基甲基树脂,merckbiosciences；4-[(2,4-二甲氧基苯基)(fmoc-氨基)甲基]苯氧基乙酰氨基甲基树脂,agilenttechnologies)合成载量范围为0.3-0.4mmol/g的肽酰胺。
fmoc保护的天然氨基酸购自proteintechnologiesinc.,sennchemicals,merckbiosciences,novabiochem,irisbiotech,nagase或bachem。在合成中使用下列标准氨基酸：fmoc-l-ala-oh、fmoc-l-arg(pbf)-oh、fmoc-l-asn(trt)-oh、fmoc-l-asp(otbu)-oh、fmoc-l-cys(trt)-oh、fmoc-l-gln(trt)-oh、fmoc-l-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-l-his(trt)-oh、fmoc-l-ile-oh、fmoc-l-leu-oh、fmoc-l-lys(boc)-oh、fmoc-l-met-oh、fmoc-l-phe-oh、fmoc-l-pro-oh、fmoc-l-ser(tbu)-oh、fmoc-l-thr(tbu)-oh、fmoc-l-trp(boc)-oh、fmoc-l-tyr(tbu)-oh、fmoc-l-val-oh。
此外，下列特殊氨基酸购自与上文相同的供应商：fmoc-l-lys(ivdde)-oh、fmoc-aib-oh、fmoc-d-ser(tbu)-oh、fmoc-d-ala-oh、boc-l-his(boc)-oh(可作为甲苯溶剂合物)和boc-l-his(trt)-oh、fmoc-l-nle-oh、fmoc-l-met(o)-oh、fmoc-l-met(o2)-oh、fmoc-(s)melys(boc)-oh、fmoc-(r)melys(boc)-oh、fmoc-(s)meorn(boc)-oh和boc-l-tyr(tbu)-oh。
在例如preludepeptidesynthesizer(proteintechnologiesinc)或类似的自动合成仪上使用标准fmoc化学和hbtu/dipea活化进行固相肽合成。使用dmf作为溶剂。脱保护：20％哌啶/dmf,2x2.5min。洗涤：7xdmf。偶联2:5:10200mmaa/500mmhbtu/2mdipea于dmf中2x,20min。洗涤：5xdmf。
所有已合成的肽均用由82.5％tfa、5％苯酚、5％水、5％苯甲硫醚、2.5％edt组成的king裂解混合物从树脂上裂解。然后粗肽在乙醚或异丙醚中析出，离心，然后冻干。肽通过分析型hplc分析并通过esi质谱核实。粗肽通过常规制备型hplc纯化操作纯化。
分析型hplc/uplc
方法a：在215nm检测
柱:aerispeptide,3.6μm,xb-c18(250x4.6mm)在60℃
溶剂:h2o+0.1％tfa:acn+0.1％tfa(流速1.5ml/min)
梯度:90:10(0min)至90:10(3min)至10:90(43min)至10:90(48min)至90:10(49min)至90:10(50min)
方法b：在220nm检测
柱:zorbax,5μm,c18(250x4.6mm)在25℃
溶剂:h2o+0.1％tfa:90％acn+10％h2o+0.1％tfa(流速1.0ml/min)
梯度:100:0(0min)至98:2(2min)至30:70(15min)至5:95(20min)至0:100(25min)至0:100(30min)至98:2(32min)至98:2(35min)
方法c1：在210-225nm检测,任选偶联至质量分析仪waterslctpremier,电喷雾正离子模式
柱:watersacquity
溶剂:h2o+1％fa:acn+1％fa(流速0.5ml/min)
梯度:95:5(0min)至95:5(1.80min)至80:20(1.85min)至80:20(3min)至60:40(23min)至25:75(23.1min)至25:75(25min)至95:5(25.1min)至95:5(30min)
方法c2：在210-225nm检测,任选偶联至质量分析仪waterslctpremier,电喷雾正离子模式
柱:watersacquity
溶剂:h2o+1％fa:acn+1％fa(流速0.6ml/min)
梯度:95:5(0min)至95:5(1min)至65:35(2min)至65:35(3min)至45:55(23min)至25:75(23.1min)至25:75(25min)至95:5(25.1min)至95:5(30min)
方法c3：在210-225nm检测,任选偶联至质量分析仪waterslctpremier,电喷雾正离子模式
柱:watersacquity
溶剂:h2o+1％fa:acn+1％fa(流速1ml/min)
梯度:95:5(0min)至95:5(1min)至65:35(2min)至65:35(3min)至45:55(20min)至2:98(20.1min)至2:98(25min)至95:5(25.1min)至95:5(30min)
方法c4:在210-225nm检测,任选偶联至质量分析仪waterslctpremier,电喷雾正离子模式
柱:watersacquity
溶剂:h2o+1％fa:acn+1％fa(流速1ml/min)
梯度:95:5(0min)至95:5(1.80min)至80:20(1.85min)至80:20(3min)至60:40(23min)至2:98(23.1min)至2:98(25min)至95:5(25.1min)至95:5(30min)
方法d：在214nm检测
柱:watersx-bridgec183.5μm2.1x150mm
溶剂:h2o+0.5％tfa:acn(流速0.55ml/min)
梯度:90:10(0min)至40:60(5min)至1:99(15min)
方法e：在210-225nm检测,任选偶联至质量分析仪waterslctpremier,电喷雾正离子模式
柱:watersacquity
溶剂:h2o+1％fa:acn+1％fa(流速0.9ml/min)
梯度:95:5(0min)至95:5(2min)至35:65(3min)至65:35(23.5min)至5:95(24min)至95:5(26min)至95:5(30min)
一般制备型hplc纯化操作：
在
毒蜥外泌肽-4衍生物的溶解度和稳定性测试
在测试肽批次的溶解度和稳定性之前确定其含量。因此，研究两个参数，其纯度(hplc-uv)和该批次的盐载量(离子层析法)。
实施例2
对于溶解度测试，目标浓度为1.0mg/ml纯化合物。因此，基于之前确定的含量，在不同的缓冲体系中从固体样品制备浓度为1.0mg/ml化合物的溶液。在温和搅拌上清液2h后进行hplc-uv，所述上清液通过在4000rpm离心20min获得。
然后通过与用纯水或不同量的乙腈中浓度为2mg/ml的所述肽的储备溶液获得的uv峰面积(全部化合物溶解的光学对照)进行比较确定溶解度。该分析也作为稳定性测试的起点(t0)。
实施例3
对于稳定性测试，针对溶解度获得的上清液的等分试样在25℃或40℃储存7天。在该时间进程后，样品在4000rpm离心20min并且用hplc-uv分析上清液。
为了确定剩余肽的量，比较了在t0和t7的目标化合物的峰面积，遵循以下方程获得“％剩余肽”：
％剩余肽＝[(峰面积肽t7)x100]/峰面积肽t0。
从所有观察到的杂质的峰面积之和减去在t0观察到的峰面积之和的比较计算可溶性降解产物的量(即，确定新形成的肽相关物质的量)。该值以相对于在t0时肽的初始量的百分比给出，遵循以下方程：
％可溶性降解产物＝{[(杂质的峰面积之和t7)-(杂质的峰面积之和t0)]x100}/峰面积t0。
“％剩余肽”和“％可溶性降解产物”的总和与100％的潜在差异反映了在应激条件下没有保持可溶的肽的量，遵循方程：
％析出物＝100-([％剩余肽]+[％可溶性降解产物])。
该析出物包括不可溶降解产物、聚合物和/或原纤维，其已经通过离心从分析中去除。
化学稳定性表示为“％剩余肽”。
阴离子层析
仪器:dionexics-2000,预柱:ionpacag-182x50mm(dionex)/as182x250mm(dionex),洗脱剂:氢氧化钠水溶液,流速:0.38ml/min,梯度:0-6min:22mmkoh,6-12min:22-28mmkoh,12-15min:28-50mmkoh,15-20min:22mmkoh,抑制器(suppressor):asrs3002mm,检测:电导率。
作为hplc/uplc方法，已经使用方法d或e。
实施例4：glp-1和胰高血糖素受体的体外数据
通过使表达人胰高血糖素受体(h胰高血糖素r)或人glp-1受体(hglp-1r)的细胞暴露于不断增加浓度的所列化合物且如实施例27所述测量所形成的camp来确定肽化合物在glp-1受体和胰高血糖素受体的效能。
结果示于表2中：
表2.毒蜥外泌肽-4衍生物在glp-1受体和胰高血糖素受体的ec50值(以pm为单位表示)
接头合成
实施例5
接头试剂5c的合成
根据以下方案合成接头试剂5c：
接头试剂中间体5a的合成：
将间甲氧基三苯甲基氯(3g,9.71mmol)溶于dcm(20ml)中并滴加至乙二胺(6.5ml,97.1mmol)于dcm(20ml)中的溶液中。2小时后，将溶液倾入乙醚(300ml)中并用30/1(v/v)盐水/0.1mnaoh溶液(各50ml)洗涤三次且用盐水(50ml)洗涤一次。有机相经na2so4干燥并减压除去挥发物。未经进一步纯化将mmt-保护的中间体(3.18g,9.56mmol)用于下一步骤。
将mmt-保护的中间体(3.18g,9.56mmol)溶于无水dcm(30ml)中。加入6-(s-三苯甲基巯基)己酸(4.48g,11.47mmol)、pybop(5.67g,11.47mmol)和dipea(5.0ml,28.68mmol)并将混合物在室温(rt)振摇30min。溶液用乙醚洗涤并用30/1(v/v)盐水/0.1mnaoh溶液(各50ml)洗涤三次且用盐水(50ml)洗涤一次。有机相经na2so4干燥并减压除去挥发物。通过快速层析纯化5a。
产率：5.69g(8.09mmol)。
ms:m/z705.4＝[m+h]+(mw计算值＝705.0)。
接头试剂中间体5b合成：
向5a(3.19g,4.53mmol)于无水thf(50ml)中的溶液中加入bh3·thf(1m溶液,8.5ml,8.5mmol)并将溶液在室温搅拌16h。加入另一部分bh3·thf(1m溶液,14ml,14mmol)并在室温搅拌16h。通过加入甲醇(8.5ml)淬灭反应混合物。加入n,n-二甲基-乙二胺(3ml,27.2mmol)并将溶液加热至回流且搅拌3h。将反应混合物冷却下来至室温，然后用乙酸乙酯(300ml)稀释，用饱和na2co3水溶液(2x100ml)与饱和nahco3水溶液(2x100ml)洗涤。有机相经na2so4干燥并减压除去挥发物，得到粗胺中间体(3.22g)。
将胺中间体(3.22g)溶于dcm(5ml)中。将boc2o(2.97g,13.69mmol)溶于dcm(5ml)中并加入dipea(3.95ml,22.65mmol)且将混合物在室温搅拌30min。通过快速层析纯化混合物，得到粗boc-保护和mmt-保护的中间体(3.00g)。
ms:m/z791.4＝[m+h]+,519.3＝[m-mmt+h]+(mw计算值＝791.1)。
将0.4mhcl水溶液(48ml)加至boc-保护和mmt-保护的中间体于乙腈(45ml)中的溶液中。混合物用乙腈(10ml)稀释并在室温搅拌1h。随后，通过加入5mnaoh溶液将反应混合物的ph值调至5.5。减压除去乙腈并用dcm(4x100ml)萃取水溶液。合并的有机相经na2so4干燥并减压除去挥发物。未经进一步纯化将粗品5b用于下一步骤。
产率：2.52g(3.19mmol)。
ms:m/z519.3＝[m+h]+(mw计算值＝519.8g/mol)。
接头试剂5c的合成：
中间体5b(985mg,1.9mmol)和氯甲酸对硝基苯酯(330mg,2.5mmol)溶于无水thf(10ml)中。加入dipea(0.653ml,3.7mmol)并将混合物在室温搅拌2h。通过加入乙酸(1ml)将溶液酸化。通过rp-hplc纯化5c。
产率：776mg,(1.13mmol)。
msm/z706.3＝[m+na]+(mw计算值＝706.3)。
肽接头试剂的合成
a)肽合成
在preludepeptidesynthesizer(proteintechnologiesinc)或类似的自动合成仪上使用标准fmoc化学和hbtu/dipea活化进行固相肽合成。dmf用作溶剂。去保护：20％哌啶/dmf,2x2.5min。洗涤:7xdmf。偶联：2:5:10200mmaa/500mmhbtu/2mdipea在dmf中,2x,20min。洗涤:5xdmf。
b)具有d-ala的n-末端延长
将如步骤a中所述合成的在n-末端具有游离氨基的0.9mmol树脂结合的肽(相当于4g树脂)分成五等份。将各部分悬浮于15mldmf中，随后加入2.5eq.fmoc-d-ala-oh、2.5eq.hatu、2.5eq.hoat和2.5eq.dipea。将混合物在环境温度振摇16h。然后经由过滤移去反应混合物并将树脂用18mldmf、18mldcm、18ml异丙醇、18ml乙醚洗涤3次。真空除去剩余溶剂。
c)fmoc脱保护、接头连接和裂解
将如步骤b中所述合成的在n-末端具有游离氨基的0.37mmol树脂结合的肽(相当于1.6g树脂)分成两等份。将各部分悬浮于12ml20％哌啶于dmf中的溶液中并搅拌5min。除去溶剂并重复该操作两次。
将树脂结合的肽用12mldmf洗涤5次。
然后将树脂悬浮于10mldmf中并加入2.5eq.(2-(((4-硝基苯氧基)羰基)氨基)乙基)(6-(三苯甲基硫基)己基)氨基甲酸第三丁酯5c和2.5eq.dipea。将混合物在环境温度振摇16h。然后经由过滤移去反应混合物并将树脂用15mldmf、15mldcm、15ml异丙醇、15ml乙醚洗涤3次。真空除去剩余溶剂。通过kaiser检测(kaisertest)测试反应的完成。
然后加入tfa/dtt/tis/h2o/苯甲硫醚/bu4nbr(100/3/2/3/1/0.05)的混合物并将混合物振摇3.5h。过滤混合物并用1mltfa洗涤树脂。经合并的滤液加至100ml冷却的乙醚中。通过离心分离析出物并将其用乙100ml醚洗涤2次。
经由使用乙腈/水梯度(两种缓冲液均具有0,1％tfa)的制备型hplc在waters柱(xbridge,beh130,制备型c185μm)上纯化粗产物。立即将经纯化的中间体冻干并储存于ar气氛中或直接用于下一步骤。
实施例6
glp-1/胰高血糖素激动剂接头试剂6d(ala接头)的合成
根据以下方案合成glp-1/胰高血糖素激动剂接头试剂6d：
glp-1/胰高血糖素激动剂接头试剂中间体6a的合成：
将在树脂上具有游离n-末端的全侧链保护的glp-1/胰高血糖素激动剂(2.00g,0.2mmol,装载大约0.1mmol/g)转移至20ml装配有垂熔滤器的注射器中。将8ml无水dmf引入注射器中并振荡(600rpm)注射器15min以使树脂预溶胀。弃去溶剂，将fmoc-d-丙胺酸-oh(187mg,0.6mol)、pybop(312mg,0.6mmol)和dipea(174μl,1.0mmol)于无水dmf(4ml)中的溶液引入注射器中。在室温和600rpm振荡注射器60min。放出溶液，并用dmf洗涤树脂十次。
如上文所述进行fmoc-保护。
glp-1/胰高血糖素激动剂接头试剂中间体6b的合成：
将5c(137mg,0,4mmol)于无水dmf(3ml)中的溶液加至树脂6a(0.2mmol)中，接着加入dipea(80μl,0.46mmol)于无水dmf(4.5ml)中的溶液，然后将反应混合物在22℃振荡(600rpm)15小时。
将树脂用dmf洗涤十次并用dcm洗涤十次且真空干燥。
glp-1/胰高血糖素激动剂接头试剂中间体6c的合成：
将3-硝基-2-吡啶-硫基氯(48mg,0.25mmol)加至含6b(0.05mmol,0.5g)的注射器中。将无水dcm(4ml)引入注射器中并将混合物在室温振荡(600rpm)。2h后弃去溶液并将树脂用dcm洗涤14次且真空干燥。
glp-1/胰高血糖素激动剂接头试剂中间体6d的合成：
在圆底烧瓶中，将邻甲酚(1.5ml)、苯甲硫醚(1.5ml)、dtt(1.125g)、tes(1.125ml)和水(1.5ml)溶于tfa(37.5ml)中。在室温将6c(0.15mmol,1.5g)加至经搅拌的(250-350rpm)溶液中以获得均质悬浮液。持续搅拌45min。经由过滤从树脂珠子中分离出溶液，用tfa洗涤珠子两次(每次2ml)并将洗涤溶液与滤液合并。在氮气气流中从合并的溶液中除去tfa。
通过加入乙醚(30ml)和剧烈振荡使粗品6d从浓缩的溶液(大约10ml)中析出。离心(2min,5000rpm)后，弃去上清液并用乙醚洗涤析出物两次(每次20ml)。
将干燥的析出物溶于tcep(114mg,0.39mmol)于30ml含0.01％tfa(v/v)的1/19(v/v)乙腈/水中的溶液中。将混合物在室温温育15小时。通过如材料与方法部分所述的使用150x30mmwatersxbridgetmbeh300c1810μm柱和40ml/min流速的rp-hplc纯化6d。
柱上装载至多12ml混合物。先后使用5％至30％溶剂b(5min)的线性梯度和30％至35％溶剂b(40min)的线性梯度进行洗脱。收集含产物6d的级分并冻干。纯度：86％(215nm)
产率：85.2mg(19.2μmol,自2.00g树脂起始)。
msm/z1486.7＝[m+3h]3+,(mw计算值＝4460.0g/mol)。
实施例7(asn接头)
接头试剂7f的合成
根据以下方案合成接头试剂7f：
向n-甲基-n-boc-乙二胺(0.5ml,2.79mmol)和nacnbh3(140mg,2.23mmol)于meoh(10ml)和乙酸(0.5ml)中的经冷却的(0℃)溶液中加入2,4,6-三甲氧基苯甲醛(0.547mg,2.79mmol)于etoh(10ml)中的溶液。将混合物在室温搅拌2h，用2mhcl(1ml)酸化并用饱和na2co3水溶液(50ml)中和。蒸发所有挥发物，用dcm萃取所得水性浆液并浓缩有机性级分，得到n-甲基-n-boc-n’-tmob-乙二胺(7a)，其为粗油状物，通过rp-hplc纯化。
产率：593mg(1.52mmol)
ms:m/z377.35＝[m+na]+,(计算值＝377.14)。
将n-fmoc-n-me-asp(otbu)-oh(225mg,0.529mmol)溶于dmf(3ml)中并加入7a(300mg,0.847mmol)、hatu(201mg,0.529mmol)和可力丁(0.48ml,3.70mmol)。将反应混合物在室温搅拌2h，得到7b。对于fmoc脱保护，加入哌啶(0.22ml,2.16mmol)并继续搅拌1h。加入乙酸(1ml)，并通过rp-hlpc纯化7c。
产率：285mg(0.436mmol,其为tfa盐)
ms:m/z562.54＝[m+na]+,(计算值＝562.67)。
将6-三苯甲基巯基己酸(0.847g,2.17mmol)溶于无水dmf(7ml)中。加入hatu(0.825g,2.17mmol)和可力丁(0.8ml,6.1mmol)及7c(0.78g,1.44mmol)。将反应混合物在室温搅拌60min，用acoh(1ml)酸化并通过rp-hplc纯化。用饱和nahco3水溶液中和产物级分并浓缩。用dcm萃取剩余的水相并经蒸发溶剂分离7d。
产率：1.4g(94％)
ms:m/z934.7＝[m+na]+,(计算值＝934.5)。
向7d(1.40mg,1.53mmol)于meoh(12ml)和h2o(2ml)中的溶液中加入lioh(250mg,10.4mmol)并将反应混合物在70℃搅拌14h。用acoh(0.8ml)酸化混合物并通过rp-hplc纯化7e。用饱和nahco3水溶液中和产物级分并浓缩。用dcm萃取水相并经蒸发溶剂分离7e。
产率：780mg(60％)
ms:m/z878.8＝[m+na]+,(计算值＝878.40)。
向7e(170mg,0.198mmol)于无水dcm(4ml)中的溶液中加入dcc(123mg,0.59mmol)和n-羟基-琥珀酰亚胺(114mg,0.99mmol)，并将反应混合物在室温搅拌1h。过滤混合物，并用0.5mlacoh酸化滤液且通过rp-hplc纯化7f。用饱和nahco3水溶液中和产物级分并浓缩。用dcm萃取剩余的水相并经蒸发溶剂分离7f。
产率：154mg(0.161mmol)
ms:m/z953.4＝[m+h]+,(计算值＝953.43)。
可选择地，根据以下操作合成接头试剂7f：
备选反应方案：
向n-甲基-n-boc-乙二胺(2g,11.48mmol)和nacnbh3(819mg,12.63mmol)于meoh(20ml)中的溶液中逐份加入2,4,6-三甲氧基苯甲醛(2.08mg,10.61mmol)。将反应混合物在室温搅拌90min，用3mhcl(4ml)酸化并再搅拌15min。将反应混合物加至饱和nahco3溶液(200ml)中并用ch2cl2萃取(5x)。合并的有机相经na2so4干燥并真空蒸发溶剂。将所得n-甲基-n-boc-n’-tmob-乙二胺(7a)在高真空中完全干燥并未经进一步纯化用于下一反应步骤。
产率：3.76g(11.48mmol,89％纯度,7a:双tmob保护的产物＝8:1)
ms:m/z355.22＝[m+h]+,(计算值＝354.21)。
向7a(2g,5.65mmol)于ch2cl2(24ml)中的溶液中加入comu(4.84g,11.3mmol)、n-fmoc-n-me-asp(obn)-oh(2.08g,4.52mmol)和可力丁(2.65ml,20.34mmol)。将反应混合物在室温搅拌3h，用ch2cl2(250ml)稀释并用0.1mh2so4(100ml)洗涤3次且用盐水(100ml)洗涤3次。用ch2cl2(100ml)再次萃取水相。合并的有机相经na2so4干燥，过滤并浓缩残余物至体积为24ml。使用快速层析纯化7g。
产率:5.31g(148％,6.66mmol)
ms:m/z796.38＝[m+h]+,(计算值＝795.37)。
向7g[5.31g,max.4.51mmol参考n-fmoc-n-me-asp(obn)-oh]于thf(60ml)中的溶液中加入dbu(1.8ml,3％v/v)。将溶液在室温搅拌12min，用ch2cl2(400ml)稀释并用0.1mh2so4(150ml)洗涤3次且用盐水(150ml)洗涤3次。用ch2cl2(100ml)再次萃取水相。合并的有机相经na2so4干燥并过滤。经蒸发溶剂分离7h并未经进一步纯化用于下一反应。
ms:m/z574.31＝[m+h]+,(计算值＝573.30)。
将7h(5.31g,4.51mmol,粗品)溶于乙腈(26ml)中并加入comu(3.87g,9.04mmol)、6-三苯甲基巯基己酸(2.12g,5.42mmol)和可力丁(2.35ml,18.08mmol)。将反应混合物在室温搅拌4h，用ch2cl2(400ml)稀释并用0.1mh2so4(100ml)洗涤3次且用盐水(100ml)洗涤3次。用ch2cl2(100ml)再次萃取水相。合并的有机相经na2so4干燥，过滤并经蒸发溶剂分离7i。使用快速层析纯化产物7i。
产率：2.63g(62％,94％纯度)
ms:m/z856.41＝[m+h]+,(计算值＝855.41)。
向7i(2.63g,2.78mmol)于i-proh(33ml)和h2o(11ml)中溶液中加入lioh(267mg,11.12mmol)并将反应混合物在室温搅拌70min。将混合物用ch2cl2(200ml)稀释并用0.1mh2so4(50ml)洗涤3次且用盐水(50ml)洗涤3次。用ch2cl2(100ml)再次萃取水相。合并的有机相经na2so4干燥，过滤并经蒸发溶剂分离7e。使用快速层析纯化7j。
产率：2.1g(88％)
ms:m/z878.4＝[m+na]+,(计算值＝878.40)。
向7e(170mg,0.198mmol)于无水dcm(4ml)中的溶液中加入dcc(123mg,0.59mmol)，并加入催化量的dmap。5min后加入n-羟基-琥珀酰亚胺(114mg,0.99mmol)并将反应混合物在室温搅拌1h。将反应混合物过滤，真空除去溶剂并将残余物吸收于90％乙腈+0.1％tfa(3.4ml)中。通过rp-hplc纯化粗混合物。用0.5mph7.4磷酸盐缓冲液中和产物级分并浓缩。用dcm萃取剩余水相并经蒸发溶剂分离7f。
产率：154mg(81％)
ms:m/z953.4＝[m+h]+,(计算值＝953.43)。
实施例8
接头试剂8e的合成
根据以下方案合成接头试剂8e：
在氮气气氛进行接头试剂中间体8b的合成。将胺8a(1.69g,4.5mmol,对于制备参见wo-a2009/133137)于30mlthf(无水的,分子筛)中的溶液冷却至0℃。加入氯甲酸第三丁酯(630μl,4.95mmol)于3mlthf(无水的,分子筛)中的溶液和dipea(980μl,5.63mmol)。将混合物在0℃搅拌10min，移开冷却并将混合物在室温再搅拌20min。加入1mlialh4/thf(9ml,9mmol)并将混合物回流1.5h。通过慢慢加入甲醇(11ml)和100ml饱和酒石酸na/k溶液淬灭反应混合物。用乙酸乙酯萃取混合物，有机层经na2so4干燥并减压除去溶剂。未经进一步纯化将粗产物8b(1.97g)用于下一步骤。
ms:m/z390.2＝[m+h]+(mw计算值＝389.6)。
将粗产物8b(1.97g)、n-(溴乙基)-邻苯二甲酰亚胺(1.43g,5.63mmol)和k2co3(1.24g,9.0mmol)于120ml乙腈中的溶液回流6h。加入60ml饱和nahco3溶液并用乙酸乙酯萃取混合物3次。将合并的有机物干燥(na2so4)并减压除去溶剂。通过使用庚烷(含0.02％net3)和上升量的乙酸乙酯(含0.02％net3)作为洗脱剂在硅胶上纯化邻苯二甲酰亚胺8c。产率：0.82g(1.46mmol)
ms:m/z563.3＝[m+h]+(mw计算值＝562.8)。
将邻苯二甲酰亚胺8c(819mg1.46mmol)溶于35ml乙醇中并加入水合肼(176μl,3,64mmol)。将混合物回流3h。滤出析出物。减压除去溶剂并用15ml二氯甲烷处理残余物。滤出析出物并减压除去二氯甲烷。通过rphplc纯化残余物。通过加入nahco3将收集的hplc级分调节至ph7并用二氯甲烷萃取若干次。将合并的有机物干燥(na2so4)并减压除去溶剂，得到胺8d。
产率：579mg(1.34mmol)
ms:m/z433.3＝[m+h]+(mw计算值＝432.7)。
将氯甲酸对硝基苯酯(483mg,2.40mmol)溶于10ml二氯甲烷(无水的,分子筛)中。加入胺8d(1.00g,2.31mmol)于5ml二氯甲烷(无水的,分子筛)和1.8mlsym-可力丁中的溶液并将混合物在室温搅拌40min。减压除去二氯甲烷，用乙酸乙酯酸化残余物并通过rp-hplc纯化，得到氨基甲酸对硝基苯酯8e。
产率：339mg(0.57mmol)
ms:m/z598.3＝[m+h]+(mw计算值＝597.8)。
肽接头–聚合物缀合物的合成
实施例9
根据以下方案合成glp/胰高血糖素激动剂巯基接头1：
向于肽合成容器中在rink树脂上的400mg树脂连接的fmoc-保护的毒蜥外泌肽-4seq.id.26中加入4ml20％哌啶/dmf并将反应混合物搅拌5分钟。重复该过程三次。随后将树脂连接的肽用4mldmf洗涤三次。
向80mg(2,5eqv.)接头1a和60mg(3.0eqv.)pybop中加入5ml无水dmf。向该溶液中加入16μl(3.0eqv.)二异丙基乙基胺(dipea)。将所得溶液加至上文处理的树脂连接的毒蜥外泌肽-4seqid.3126–树脂。将混合物在25℃处理18h。在该时间结束时，过滤树脂并用无水dmf(5mlx5)、二氯甲烷(5mlx5)、异丙醇(5mlx5)和乙醚(5mlx5)洗涤。
将上述树脂连接的肽-接头缀合物用10ml含三氟乙酸(tfa)/三乙基甲硅烷(tes)/二硫苏糖醇(dtt)/苯甲硫醚/水(100/2/3/1/2)的溶液处理。将反应混合物在25℃振荡3h。在反应结束时，滤出溶剂并用二氯甲烷(5x10ml)洗涤树脂。减压浓缩滤液。将残余物倾入50ml冰冷的醚中。白色固体析出。将混合物离心并倾析。用乙醚(2x20ml)洗涤固体。通过反相hplc(30x100mmc18柱,25-40％accn/h2ow/0.1％tfa于20min内)纯化肽-接头。收集适当级分并蒸发至干，得到16mg期望产物，其为白色固体。通过质谱鉴定产物(分子离子峰,m/z1469,z＝3)。
实施例10
根据以下方案合成glp/胰高血糖素巯基接头2：
向于肽合成容器中在rink树脂上的1.8g树脂连接的fmoc-保护的毒蜥外泌肽-4seq.id.26中加入20ml20％哌啶/dmf并将反应混合物搅拌5分钟。重复该过程三次。随后将树脂连接的肽用20mldmf洗涤三次。
向163mg(2,5eqv.)fmoc-d-ala-oh、199mg(2,5eqv.)hatu和71mg(2.5eqv.)hoat中加入15ml无水dmf中。向该溶液中加入92μl(2.5eqv.)二异丙基乙基胺(dipea)。将所得溶液加至上文处理的树脂连接的毒蜥外泌肽-4seqid.26–树脂中。将混合物在25℃处理16h。在该时间结束时，过滤树脂并用无水dmf(20mlx5)、二氯甲烷(20mlx5)、异丙醇(20mlx5)和乙醚(20mlx5)洗涤。
向于肽合成容器中在rink树脂上的上述树脂连接的d-ala-毒蜥外泌肽-4-seqid.26中加入15ml20％哌啶/dmf并将反应混合物搅拌5分钟。重复该过程三次。随后将树脂连接的肽用15mldmf洗涤三次。
向352mg(2,5eqv.)接头2a中加入15ml无水dmf。向该溶液中加入92μl(2.5eqv.)二异丙基乙基胺(dipea)。将所得溶液加至上文处理的树脂连接的d-ala-毒蜥外泌肽-4seqid.26–树脂中。将混合物在25℃处理16h。在该时间结束时，将树脂过滤并用无水dmf(15mlx5)、二氯甲烷(15mlx5)、异丙醇(15mlx5)和乙醚(15mlx5)洗涤。
将上述树脂连接的肽-接头缀合物用40ml含三氟乙酸(tfa)/三乙基甲硅烷(tes)/二硫苏糖醇(dtt)/苯甲硫醚/水(100/2/3/1/2)的溶液处理。将反应混合物在25℃振荡1h。在反应结束时，过滤溶剂。将滤液倾至400ml冰冷的水中。白色固体析出。将混合物离心并倾析。用乙醚(2x200ml)洗涤固体。通过反相hplc(30x100mmc18柱,25-40％accn/h2ow/0.1％tfa于20min内)纯化肽-接头。收集适当的级分并蒸发至干，得到104mg期望产物，其为白色固体。通过质谱鉴定产物(分子离子峰,m/z1465.3,z＝3和m/z1099.2,z＝4)。
透明质酸水凝胶的合成
实施例11.
根据以下方案合成二乙烯基砜交联的透明质酸：
实施例11a
伴随搅拌向0.2m氢氧化钠(168.9g)中加入氯化钠(23.4g)直至溶解。在快速机械搅拌下向溶液中加入透明质酸钠(25.4g,400–500kda)，继续搅拌2h。所得聚合物溶液的浓度为约12％w/w。制备二乙烯基砜(0.41ml,0.48g)于异丙醇(1.6ml)中的溶液并历时约30秒加入(5x0.4ml)。将混合物再搅拌2min并倾入23x28x6.5cm玻璃盘中且用塑料罩密封。在室温静置4h后，将作为单独部分的凝胶转移至1m盐酸(100.1g)于0.9％盐水(3kg)中的溶液中。将其在室温温和振摇。24h后，溶液的ph为2.28。弃去溶液留下凝胶(416.2g)。然后向凝胶中加入0.9％盐水(3kg)并将其在室温温和振摇18h。在0、2、4、6和8h向混合物中加入1m氢氧化钠(9.7ml)。将凝胶在室温再温和振摇24h，此时凝胶的ph为6.65。将凝胶在2-8℃储存120h，然后加入10mm磷酸钠溶液ph7.4(2l)。将凝胶再振摇21h并弃去洗液留下凝胶(1036.2g)，最终聚合物浓度为2.4％.
实施例11b.二乙烯基砜交联的透明质酸的备选合成
向35g透明质酸钠中加入946ml无菌水。将反应混合物在2-8℃保持7天，在此期间形成澄清溶液。先该溶液中加入1m111ml1.0m氢氧化钠水溶液并将所得反应混合物剧烈搅拌5min。将反应混合物在2-8℃保持90min。随后将6.7ml二乙烯基砜于10ml无菌水中的悬浮液加至聚合物溶液中并将所得反应混合物剧烈搅拌5分钟。随后，将反应混合物在2-8℃储存150分钟，接着在25℃储存90分钟。将由此形成的聚合物凝胶用0.9％无菌盐水洗涤四天。用1.)mnaoh或1.0mhcl将悬浮液的ph调节至7.0。凝胶悬浮液的最终浓度为0.58％。
实施例12
1-(第三丁氧基羰基)氨基3-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基丙烷的合成。
在250ml圆底烧瓶中加入3.0g1-(第三丁氧基羰基)氨基3-氨基丙烷)和100ml无水氯仿。将反应混合物在25℃搅拌直至形成澄清溶液。伴随搅拌向该溶液中加入3-马来酰亚氨基丙酸n-琥珀酰亚氨基酯(5.05g)直至溶解，接着加入3.42ml二异丙基乙基胺。将所得反应混合物在25℃搅拌18h。将溶液用1m盐酸(50ml)、10％盐水(50ml)、饱和碳酸氢钠(50ml)、半饱和盐水(50ml)洗涤。分离有机相并经无水硫酸钠干燥。经由过滤除去硫酸钠后，减压浓缩溶液并通过使用乙酸乙酯:己烷梯度作为流动相的硅胶柱层析纯化残余物。减压除去溶剂，接着真空干燥，得到期望产物，其为灰白色固体(4.03g)。
实施例13.
1-(第三丁基氧基羰基)氨基8-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基-3,6-二氧杂辛烷的合成
在100ml圆底烧瓶中加入1-(第三丁基氧基羰基)氨基8-氨基-3,6-二氧杂辛烷(1.007g)和25ml无水乙腈(25ml)。将反应混合物在氮气下搅拌直至溶解。向该溶液中加入3-马来酰亚氨基丙酸n-琥珀酰亚氨基酯(1.302g)并经反应混合物在氮气下在25℃搅拌6h。在该时间结束时，减压除去溶剂。通过使用含2–6％甲醇的二氯甲烷的硅胶柱层析纯化残余物。减压除去溶剂并真空干燥残余物后，得到1.08g期望产物，其为灰白色固体。
实施例14.
3-(3-马来酰亚氨基-丙基)氨基丙烷官能化的透明质酸的合成。
向15g二乙烯基砜交联的悬浮液(实施例1)中加入45ml去离子(di)水并将所得悬浮液在25℃搅拌10分钟。向悬浮液中加入45ml乙醇后，将其再搅拌60min。接着加入60ml乙醇并搅拌10分钟。向该悬浮液中加入溶于5ml乙醇中的0.24g4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉鎓氯化物(dmt-mm)。将所得反应混合物在25℃搅拌60分钟。向溶于2ml无水二氯甲烷中的70mg1-(第三丁氧基羰基)氨基3-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基丙烷(实施例2)中加入2ml三氟乙酸。将所得反应混合物在室温搅拌2h。减压浓缩该溶液。将所得残余物用3ml甲醇处理并蒸发至干。再一次重复该过程后，将残余物溶于乙醇(5ml)中并用10％n-甲基吗啉/乙醇将ph调节至6-6.5。将所得溶液加至上述透明质酸悬浮液中。用乙醇(5ml)淋洗小瓶并向其中加入浆液。在25℃搅拌18h后，向反应混合物中加入饱和盐水(2ml)。将悬浮液用乙醇(3x30ml,2x15ml)处理，使聚合物凝胶析出。将反应混合物在4000rpm离心并倾析上清液。将残余物在di水(20ml)中水化约20min并从乙醇(4x10ml)中析出。葡糖酰胺测定方法表明取代的程度为19mole％。
实施例15.
3-(3-马来酰亚氨基-丙基)氨基丙烷官能化的透明质酸的合成。
向20g二乙烯基砜交联的悬浮液(实施例1)中加入60ml去离子(di)水并将所得悬浮液在25℃搅拌10分钟。向悬浮液中加入60ml乙醇后，将其再搅拌60min。接着加入60ml乙醇并搅拌10分钟。向该悬浮液中加入溶于10ml乙醇中的0.325gdmt-mm。将所得反应混合物在25℃搅拌60分钟。向溶于2.5ml无水二氯甲烷中的0.38g1-(第三丁氧基羰基)氨基3-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基丙烷(实施例2)中加入2.5ml三氟乙酸。将所得反应混合物在室温搅拌2h。减压浓缩该溶液。用3ml甲醇处理所得残余物并蒸发至干。再一次重复该过程，将残余物溶于乙醇(5ml)中并用10％n-甲基吗啉/乙醇调节ph至6-6.5。将所得溶液加至上述透明质酸悬浮液中。用乙醇(5ml)淋洗小瓶中并向其中加入浆液。在25℃搅拌18h后，向反应混合物中加入饱和盐水(2ml)。将悬浮液用乙醇(3x30ml,2x15ml)处理使聚合物凝胶析出。将反应混合物在4000rpm离心并将上清液倾析。将残余物在di水(20ml)中水化约20min并从乙醇(4x10ml)中析出。葡糖酰胺测定方法表明取代的程度为24mole％。
实施例16a
用于合成3-(3-马来酰亚氨基-丙基)氨基丙烷官能化的ha水凝胶的一般方法
向适量二乙烯基砜交联的ha悬浮液(实施例11b)中加入无菌盐水，以获得浓度为约1％w/v的凝胶。将所得悬浮液在25℃搅拌15–30分钟。将水混溶性有机溶剂(优选乙醇)加至悬浮液中并将所得悬浮液再搅拌30-60min。向该悬浮液中加入适量4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉鎓氯化物(dmt-mm)的乙醇溶液。将含dmt-mm溶液的容器用乙醇淋洗两次并将洗液加至上述悬浮液中。将所得反应混合物在25℃搅拌90分钟。将适量1-(第三丁氧基羰基)氨基3-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基丙烷溶于二氯甲烷中。向该溶液中加入三氟乙酸，得到1:1(v/v)溶液。在室温搅拌60–90分钟后，将反应混合物减压蒸发至干。将残余物溶于乙醇中并加至上述悬浮液中。将含马来酰亚胺衍生物的容器用乙醇淋洗两次并将洗液加至悬浮液中。使用有机碱或无机碱(例如10％n-甲基吗啉/乙醇)将悬浮液的ph调节至ph6.4-6.6。在25℃搅拌16-20h后，将悬浮液用乙醇处理至体积为60-65％v/v。通过在120g离心接着倾析上清液或者向系统施加轻微超压的n2气体并经垂熔玻璃或滤膜过滤从反应混合物中除去溶剂。随后在ph3.8用20mm琥珀酸盐盐水(0.9％)处理残余物约15-20min并通过加入乙醇至体积为60-65％v/v使其析出。遵循上述操作从反应混合物中除去溶剂。再一次重复该操作。
实施例16b
取代程度为20mole％的3-(3-马来酰亚氨基-丙基)氨基丙烷官能化的ha水凝胶的合成。
向5.65gha水凝胶悬浮液(实施例11b)中加入7.5ml无菌盐水并将所得悬浮液温和搅拌15分钟。向该悬浮液中加入3ml乙醇并将所得反应混合物温和搅拌60min。向该悬浮液中加入溶于3ml乙醇中的94mgdmt-mm。用乙醇(2x1ml)洗涤含dmt-mm的小瓶并将洗液加至悬浮液中。将反应混合物在环境温度温和搅拌90分钟。向21.7mg1-(第三丁氧基羰基)氨基3-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基丙烷中加入0.25ml二氯甲烷并将反应混合物温和混合直至形成澄清溶液。向该溶液中加入0.25ml三氟乙酸并在环境温度温和混合75min。随后，将溶液蒸发至干。将残余物溶于3ml乙醇中并将所得溶液加至上述水凝胶悬浮液中。用乙醇(2x1ml)洗涤含马来酰亚胺试剂的小瓶并将洗液加至反应混合物中。然后使用10％v/vn-甲基吗啉/乙醇将反应混合物的ph调节至6.41并将所得反应混合物在环境温度温和振荡18小时。在该时间结束时，通过用1.0mhcl处理将反应混合物的ph调节至ph3.89。通过加入乙醇(4x3.5ml)使凝胶析出。将悬浮液在120g在20℃离心2min并使用移液管小心地除去上清液。通过温和振荡/混合将残余物于12ml20.0mmsbs缓冲液(ph3.8)中再次水化15分钟。使悬浮液经受额外的乙醇处理(4x5ml,1x4ml)。每次乙醇处理后，将悬浮液在120g在20℃离心2min，接着小心除去上清液。最后，将小瓶倒置，使其排空15分钟并倾析上清液得到0.8876g湿凝胶。
实施例16c
3-(3-马来酰亚氨基-丙基)氨基丙烷官能化的透明质酸的合成。
向10g二乙烯基砜交联的悬浮液(实施例11a)中加入40ml去离子(di)水并将所得悬浮液在25℃搅拌10分钟。向悬浮液中加入30ml乙醇后，将其再搅拌60分钟。接着加入60ml乙醇并搅拌10分钟。向该悬浮液中加入溶于7.5ml乙醇中的0.162gdmt-mm。将所得反应混合物在25℃搅拌60分钟。向溶于0.5ml无水二氯甲烷中的29mg1-(第三丁氧基羰基)氨基3-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基丙烷(实施例2)中加入0.5ml三氟乙酸。将所得反应混合物在室温搅拌2h。减压浓缩该溶液。用2ml甲醇处理所得残余物并蒸发至干。再一次重复该过程后，将残余物溶于乙醇(7.5ml)和9.5μln-甲基吗啉中。将该溶液加至上述透明质酸悬浮液中并使用n-甲基吗啉将ph调节至7.1。用乙醇(5ml)淋洗小瓶并加至浆液中。在25℃搅拌21h后，加入饱和盐水(2ml)并通过加入乙醇(4x15ml)使凝胶析出。使浆液沉降15min并倾析上清液。将水凝胶于20mmpbsph5(35ml)中水化并通过加入乙醇(5x15ml)使其析出。重复该过程，将样品在2500rpm离心1.5min，并倾析上清液。葡糖酰胺测定方法表明取代的程度为24mole％。
实施例17
8-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基-3,6-二氧杂辛烷官能化的透明质酸的合成。
在250ml圆底烧瓶中加入0.5g冻干的ha(实施例11a)和50ml0.9％盐水溶液。将反应混合物在25℃温和搅拌1小时。向该悬浮液中加入40ml乙醇并将悬浮液搅拌5min。
在10ml小瓶中加入0.35gdmt-mm和5ml乙醇。将溶液加至ha悬浮液中。用5ml乙醇淋洗小瓶并加至悬浮液中。将所得反应混合物在25℃搅拌1h。随后，将溶于0.5ml无水二氯甲烷中的86mg1-(第三丁基氧基羰基)氨基8-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基-3,6-二氧杂辛烷用0.5ml三氟乙酸处理。将溶液在室温搅拌1h。减压浓缩该溶液，溶于2ml乙醇中并减压蒸发至干。重复乙醇处理两次。将残余物溶于5ml乙醇/水(1:1)中并使用n-甲基吗啉(60μl)调节溶液的ph至6.5。将所得溶液加至上述悬浮液中。在25℃搅拌4h，用0.1mhcl将悬浮液的ph调节至3.75并通过加入乙醇(7x25ml)使凝胶析出。使浆液沉降30min并通过倾析除去80％上清液。将剩余悬浮液在1500rpm离心5min。除去溶剂后，将残余物用0.9％盐水处理并从乙醇(7x15ml)中析出。通过冻干将残余物干燥。通过葡糖酰胺测定确定，发现取代的程度为7.3mol％。
实施例18
含2-吡啶基二巯基的透明质酸的合成。
以滴加的方式向快速搅拌的溶于24ml去离子水中的200mg透明质酸钠(分子量＝500kda)中加入16ml乙腈。完成加入乙腈后，先后向反应混合物中加入17.6mg氯二甲氧基三嗪于2ml水/乙腈(1:1)中的溶液和20μln-甲基吗啉。将反应混合物在25℃搅拌1h。随后，加入溶于1ml去离子水中的26.8mg2-((3-硝基吡啶-2-基)硫基)乙胺盐酸盐。将反应混合物搅拌18h。通过加入1mhcl将反应混合物的ph调节至6.0。向所得反应混合物中加入15ml预先洗涤的
实施例19.
可溶性马来酰亚胺官能化的ha的合成
在100ml烧瓶中加入200mg透明质酸钠盐(分子量＝500kda)和24mldi水。将其搅拌直至获得澄清溶液。向快速搅拌的ha溶液中加入16ml乙醇。与n-甲基吗啉(20μl,0.2mmol)一起加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(55mg,0.2mmol)于水/乙醇中的溶液并将反应混合物陈化1小时。加入1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮·三氟乙酸盐(60mg,0.2mmol)的水溶液。将反应混合物放置过夜。将ph调节至微酸性并向反应混合物中加入预先洗涤的
实施例20
透明质酸水凝胶中马来酰亚胺含量的估计。
通过比色分析法进行掺入ha水凝胶中的马来酰亚氨基团的估计。如下制备5-硫基2-硝基苯甲酸：在ph7.5在pbs缓冲液中用三-(2-羰基乙基)膦盐酸盐(tcep)还原5,5’-二硫基双-(2-硝基苯甲酸)。使用20mol％过量的5,5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)以防止与tcep的副反应。将预定量的马来酰亚胺官能化的水凝胶悬浮于ph3.5的20mm琥珀酸盐缓冲盐水(sbs)中。向水凝胶悬浮液中加入上述5-硫基2-硝基苯甲酸溶液并将反应混合物涡旋混合(2x10秒)且随后在25℃温和搅拌45min。随后将悬浮液在25℃离心10min并取出上清液的等分试样。在412nm测量上清液的吸收度。使用校准曲线估计溶液中5-硫基2-硝基苯甲酸的浓度。水凝胶中的马来酰亚胺浓度等于所反应的巯基的摩尔数，其从所加的5-硫基2-硝基苯甲酸的量与上清液中存在的量的差异来计算。
实施例21.
近红外染料(irdye800cw)缀合的ha水凝胶的合成。
实施例21a.3-硝基-2-(2’-氨基-乙基二硫烷基)吡啶盐酸盐(nea)缀合的二乙烯基砜交联的透明质酸的合成。
将含5.1g(23mg/g水)二乙烯基砜交联的透明质酸水凝胶(实施例5)和20ml无菌水的悬浮液在25℃温和搅拌15min。向该悬浮液中加入乙醇(20ml)并将所得反应混合物在25℃搅拌1小时。向该悬浮液中加入溶于5ml乙醇中的0.081gdmt-mm。用2.5ml乙醇淋洗含有dmt-mm溶液的小瓶并将洗液加至悬浮液中。将反应混合物在25℃搅拌1小时，接着加入0.017gnea。将反应混合物在25℃搅拌22h后，向凝胶中加入2ml盐水。通过离心除去溶剂并通过多次乙醇处理(4x10ml,1x5ml)洗涤残余物。将悬浮液在2500rpm离心5min，接着在5000rpm离心5min(离心的温度保持在5℃)。倾析上清液并使残余物在无菌水(20ml)中平衡20min。随后，使其经受两次乙醇处理(4x10ml)。使浆液沉降30min并倾析上清液。再一次重复乙醇处理过程并将湿凝胶储存在2℃直至下一步骤。
实施例21b.nir染料缀合的ha水凝胶的合成。
在无菌条件下，将0.224gnea修饰的透明质酸(实施例15a)和13ml无菌水置于50ml无菌反应小瓶中并将混合物在25℃温和振荡15min。向该悬浮液中加入20ml乙醇并将悬浮液在25℃搅拌1小时。随后，向悬浮液中加入14mgtcep并将反应混合物在25℃搅拌16小时。在反应结束时，向反应混合物中加入2ml盐水。随后，使凝胶经受5个循环的乙醇处理(5ml)和离心(5000rpm,5min.,5℃)。除去上清液后，用10ml0.9％无菌盐水处理残余物，接着如上所述进行5轮乙醇(5ml)处理和离心。将残余物悬浮于10ml无菌0.9％盐水中。使用无菌脱氢滤器向该悬浮液中加入溶于无菌0.9％盐水(3ml)中的1.8mg马来酰亚胺官能化的irdye800cw。用5ml乙醇和乙醇/盐水1:1(2x5ml)淋洗滤器并将洗液加至反应混合物中。将反应容器在25℃暗处温和振摇2小时并在2℃保持66h。随后，向反应混合物中加入溶于3ml乙醇中的11.5mgn-甲基马来酰亚胺并将悬浮液在25℃再温和振荡3小时。反应结束时，将悬浮液离心(5000rpm,5℃,2x15min)并除去20ml上清液。剩余悬浮液从乙醇(5x5ml)中析出并进一步离心(5000rpm,5℃,5min)，然后倾析上清液。先后向残余物中加入10ml0.9％无菌盐水和5ml乙醇。将悬浮液离心(5000rpm,5min,5℃)并倾析悬浮液。重复乙醇处理和离心过程四次。用10ml无菌0.9％盐水处理残余物并通过用铝箔包裹小瓶在暗处在2℃储存。
接头硫基肽与马来酰亚胺官能化的ha水凝胶的缀合
实施例22
带有以巯基结尾的示踪-接头的肽与马来酰亚胺官能化的ha水凝胶的一般操作。
在具有中度多孔性玻璃料或滤器的无菌和脱氢反应器中加入适量马来酰亚胺修饰的ha水凝胶(实施例3)。随后，向反应混合物中加入适量无菌过滤的20mmolsb缓冲液(含15％v/v聚乙二醇和0.01％w/vtween20,ph3.8)，从而使得所得悬浮液的浓度为约1％w/w。伴随温和振荡使悬浮液混合30–90分钟。在该时间结束时，向反应器中加入适量溶于无水过滤的20mmolsb缓冲液(含15％v/v聚乙二醇和0.01％w/vtween20,ph3.8)中的带有以巯基结尾的示踪-接头的肽并使所得反应混合物在环境温度温和振荡1.5–24小时。在反应结束时，通过使用轻微过大压力的氮气过滤或通过将悬浮液离心除去上清液。用无菌过滤的20mmsbs缓冲液(含15％v/v聚乙二醇和0.01％w/vtween20,ph3.0)处理残余物制备悬浮液0.7w/v％，振荡3分钟，离心并通过倾析除去上清液。重复该过程五次。用溶于无菌过滤的20mmsbs缓冲液(含15％v/v聚乙二醇和0.01％w/vtween20,ph3.0)中的10mm1-羟基-2-巯基乙烷的溶液处理残余物制备约1wt％悬浮液并伴随温和振荡/混合而温和搅拌30分钟。先后通过如上所述的离心和倾析除去溶剂。重复1-羟基-2-巯基乙烷处理的过程四次。将残余物悬浮于无菌过滤的20mmsbs缓冲液(含15％v/v聚乙二醇和0.01％w/vtween20,ph3.0)中制备浓度为约0.5wt％的悬浮液，然后混合3分钟，接着通过离心和倾析除去。将所得残余物悬浮于20mmsbs缓冲液(含15％v/v聚乙二醇和0.01％w/vtween20,ph6.5)中制备0.7wt％悬浮液并搅拌20分钟且过滤。再一次重复该过程后，将残余物悬浮于20mmsbs缓冲液(含15％v/v聚乙二醇和0.01％w/vtween20,ph4.5)中制备0.5wt.％悬浮液，搅拌15分钟，然后过滤。重复该过程一次。将残余物悬浮于无菌水(ph4.5)中，搅拌5分钟，然后过滤。重复该过程五次。使用无菌膜滤器无菌过滤残余物并冻干。
表3概述了通过各种反应条件获得的双重激动剂肽的各种ha水凝胶缀合物的合成以及无痕接头的性质的结果。
表3b:遵循实施例14至22所述的操作制备以下缀合物
含接头7的巯基官能化的毒蜥外泌肽-4seqidno.26与马来酰亚胺官能化的透明质酸的缀合。
向53mg3-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基丙烷修饰的dvs-ha水凝胶(实施例15)中加入7ml含0.01wt％
实施例23
含接头的巯基官能化的毒蜥外泌肽-4seqid26与马来酰亚胺官能化的透明质酸的缀合。
使用脱氧的缓冲液且在氮气气氛下进行反应和后处理。向36mg3-(3-马来酰亚氨基丙基)氨基丙烷修饰的dvs-ha水凝胶(实施例15)中加入6ml20mmsbs(含0.01wt％
实施例24.
用于估计水凝胶-肽缀合物中肽载量的操作。
将预定量ha水凝胶-肽缀合物悬浮于ches缓冲液(ph9.5)中并使悬浮液在70℃温和搅拌。将悬浮液离心并通过hplc方法分析等分试样的肽含量。该hplc方法包括使用qc-18kinetics柱(内径＝4.6mm和长度＝100mm,粒径2.6μm,phenomenex)，使用agilent1100lc。流动相a的组成为90％水/10％乙腈/0.1％三氟乙酸(tfa)且流动相b的组成为10％乙腈/90％水/0.09％tfa。梯度在8分钟内由流动相25％b至55％b。流速保持在1ml/min。纯肽用作定量从水凝胶中释放的肽的标准物。
实施例25
ha水凝胶的体内滞留时间的确定。
通过磁共振(mr)成像研究皮下区域中水凝胶体内滞留时间。水凝胶内水质子对比度的强度用于评估水凝胶体内滞留时间。为此，使用cann.cg-foxn1nu/crl小鼠作为实验动物。遵循所有经批准的动物护理方案使用31g针头注射该水凝胶。在一段时间内定时采集注射部位的mr图像。在一组中，注射该水凝胶，而在另一组中，使用含1:1(w/w)混合物水凝胶和800,000da可溶性ha的悬浮液。在纯水凝胶的情况下，凝胶历时3周是明显的，伴随强度的缓慢损失(图2)。另一方面，对于含可溶性ha的混合物，在第1天强烈的mr信号在第4天显着降低(2)。这表明，为了改善聚合物载体的滞留时间，需要将其交联以获得非常高的分子量。
图2a.作为时间的函数的ha水凝胶在注射部位的图像的mr。
图2b.作为时间的函数的含1:1(w/w)ha水凝胶-800kda可溶性ha的聚合物悬浮液在注射部位的图像的mr。
实施例26
体外释放动力学
将glp-1/胰高血糖素激动剂接头水凝胶8(0.5mgglp-1/胰高血糖素激动剂)的等分试样转移至装配有垂熔滤器的注射器中并用ph7.4磷酸缓冲液(60mm,3mmedta,0.01％tween-20)洗涤5次。将水凝胶悬浮于相同缓冲液中并在37℃温育。在规定的时间点(各自在1-7天温育时间后)交换上清液并通过rp-hplc在215nm定量所释放的glp-1/胰高血糖素激动剂。将对应于所释放的glp-1/胰高血糖素激动剂的uv-信号积分并针对温育时间作图。
应用曲线拟合软件估计对应的释放半衰期。
图3.具有接头的毒蜥外泌肽-4seqid26双重激动剂从ha水凝胶(实施例23)中的体外释放动力学。半衰期为约5天。
实施例27
对glp-1受体、胰高血糖素受体和gip受体效力的体外细胞测定
通过功能测定确定肽对所述受体的激动作用，所述功能测定测量稳定表达人gip、glp-1或胰高血糖素受体的hek-293细胞系的camp应答。
使用来自cisbiocorp.的基于htrf(均相时间分辨荧光(homogeneoustimeresolvedfluorescence))的套组(目录号62am4pec)确定细胞的camp含量。对于制备，细胞被分至t175培养瓶并在培养基(dmem/10％fbs)中生长过夜至接近汇合。然后去除培养基且用不含钙和镁的pbs洗涤细胞，随后用accutase(sigma-aldrich目录号a6964)进行蛋白酶处理。洗涤脱离的细胞并重悬于测定缓冲液(1xhbss；20mmhepes，0.1％bsa，2mmibmx)并确定细胞密度。其然后被稀释至400000个细胞/ml且25μl-等分试样被分配至96孔板的孔中。对于测量，将25μl于测定缓冲液中的测试化合物添加至孔中，接着在室温温育30分钟。在添加稀释于裂解缓冲液(套组组分)的htrf试剂后，将测定板温育1小时，接着在665/620nm测量荧光比率。通过确定引起最大应答的50％活化的浓度(ec50)来定量激动剂的体外效力。
实施例28
雌性糖尿病dbdb-小鼠中的葡萄糖降低
使用在研究开始时24-27周龄的雌性糖尿病dbdb-小鼠(bks.cg-m+/+lepr(db)/j)。使达到10-13周龄的小鼠适应喂养和居住条件至少1周，然后用于第一个研究中，并在至少2周的清除期(washoutperiod)后最终再用于本研究。研究开始前19天，确定个体的hba1c值以用于将动物分级，然后将动物分配至4组(每组n＝8)，以提供尽可能相等的平均hba1c值。在整个研究期间动物可随意获取食物和水。在研究的第一天，利用媒介物(无菌琥珀酸盐缓冲液)或稀释于媒介物中的剂量为50、100和200nmol/kg的实施例23的glp-1/胰高血糖素激动剂seq.id26的ha-缀合物进行单独皮下处理(08:00–09:00am)，在该处理前和处理后4小时确定来自尾尖切口的血糖。此后在接下来的16天均在类似的白天时间(08:00–09:00am)进行每日血糖测量，除了第11天和第12天(周末)之外。此外，每天监测食物摄取和水消耗。通过双因素anova对重复的测量值分析葡萄糖数据，接着进行dunnett事后检验，显着性水平为p<0.05。先后使用显着性水平为p<0.05的单因素anova和dunnett事后检验完成葡萄糖auc分析。
图4示出一次注射不同剂量的具有seq.id26的ha-glp-1/胰高血糖素激动剂缀合物后，相对于时间的血糖浓度(相对于基线)。
实施例28b雌性糖尿病dbdb-小鼠中的葡萄糖降低效应
雌性、肥胖性糖尿病db/db-小鼠(bks.cg-m+/+lepr(db)/j和健康、瘦的对照(bks.cg-m+/+lepr(db)/j)达到10-11周龄并适应喂养和饲养条件。在12-13周龄，确定个体的hba1c值以用于将动物分级，然后将动物分配至不同的组(每组n＝8)。目的是提供尽可能相等的平均hba1c值。在13-14周龄，2组db/db小鼠接受皮下注射(s.c.)100nmol/kg体重的单剂量的可溶性或交联ha与seq.id26的缀合物。与此同时以及在第7天的第二时间，第三组db/db小鼠和健康瘦的对照小鼠接受皮下注射比例为1:1的琥珀酸盐缓冲液和可溶性ha。在所有组中，注射5ml/kg体重的总体积。在临处理前(08:00–09:00am)和处理后四小时以及此后每天08:00–09:00am，测定晨饲(morning-fed)血糖浓度。从尾尖切口收集血液并经手持式血糖仪(accucheck)确定浓度。在整个研究期间动物可随意获取食物和水。
图4b示出一次注射具有seq.id26的交联和可溶性ha-glp-1/胰高血糖素激动剂缀合物后，相对于时间的血糖浓度(相对于基线)。
实施例28c
雌性糖尿病db/db-小鼠中的葡萄糖降低效应
到达后，使雌性、肥胖性糖尿病db/db-小鼠(bks.cg-m+/+lepr(db)/j)适应喂养和饲养条件并在开始研究时为12周龄。在预给药阶段的第10天确定个体的hba1c值用于将动物分级，然后将动物分配至不同的组(每组n＝8)。目的是提供尽可能相等的平均hba1c值。在给药阶段的第1天，db/db小鼠接受皮下注射单剂量12.75mg/kg体重的任一具有seqid45、46、48和49的缀合物。媒介物组的db/db动物接受皮下pbs注射。在所有组中，注射10ml/kg体重的总体积。在给药阶段的第1天在临处理前(08:00–09:00am)和处理后四小时以及此后每天08:00–09:00am，测定晨饲血糖浓度。从尾尖切口收集血液并经手持式血糖仪(accucheck)确定浓度。在整个研究期间动物可随意获取食物和水。
图4c示出一次注射不同剂量的具有seq.id45(三角)、46(方形)、48(圆圈)的ha-glp-1/胰高血糖素激动剂缀合物后，相对于时间的血糖浓度(相对于基线)。
图4d示出一次注射不同剂量的具有seq.id49(圆圈)的ha-glp-1/胰高血糖素激动剂缀合物后，相对于时间的血糖浓度(相对于基线)。
实施例29
可注射性研究
通过将适量肽缀合物分散至20mm琥珀酸盐缓冲盐水(sbs)(ph4.5)中制备3.75％(mg/ml)ha-肽缀合物的悬浮液。在另一小瓶中，通过将冻干的ha溶于20mmsbs(ph4.5)中制备天然ha聚合物的2％(mg/ml)溶液。使两种样品均在2-8℃水化24至48小时。使小瓶升至室温。在室温平衡后，在3ml注射器中取1ml肽-ha水凝胶缀合物悬浮液和ha。向该悬浮液中加入0.25ml可溶性ha溶液。所得悬浮液在两只3ml注射器间经受20次来回混合。将大约220μl该悬浮液加至1ml注射器中。该注射器与30g,1/2英寸针头连接。确保针头未填装受试物质。将含该悬浮液的注射器装载至instron仪器的注射器固定装置中并使instron的十字头与注射器的柱塞对齐。调整十字头的速度以达到目标注射速率。开始进行测试。对于每种样品，进行三次测量且所呈现的结果为这些测量值的平均数。针对不同肽-ha水凝胶缀合物的注射力的结果示于表4。
表4.ha修饰对平均注射力的作用*
*n＝3/组；注射速率＝12μl/s
图5示出通过按压液体经过与1ml注射器连接的2.5cm长30g针头的平均挤压力。清楚地表明，ha水凝胶上越高的肽载量导致越低的挤压力并由此增强可注射性。
实施例29b
ha缀合的seq.idno.45，aib-接头的可注射性研究
向1mlluer-lock注射器(bd注射器，内径4mm)中填充约500μl(460μl注射器额度)试样溶液，以及配备29gx12.7mm针头。在获自lloyedinstruments的lfplus测力计上进行测量。推动注射器推杆，直至在29g针的针头上出现小液滴。将注射器置于注射器支架上，并且移动测力计使其接触推杆。
测量设置如下：吸收力50n，注射速度5.8mm/s(在这种情况下相当于100μl/s)。
开始测量并且当推杆接触注射器的底部(即注射器是空的)，自动吸收，或者在测量过程中大于50n的力。
表5显示了对不同缀合浓度和不同混合比的可溶性ha(sha)的最大注射力
表5
纯20mg/ml600kdasha溶液的注射力为13.3n并且2600kdasha:18.8n。
序列表
<110>赛诺菲(sanofi)
<120>包含glp1/胰高血糖素双重激动剂接头透明质酸缀合物的前药
<130>de2015/071wopct-60235pwo
<150>ep15305858.1
<151>2015-06-05
<160>60
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glnleualaargasppheileglutrpleuilexaaproglypropro
202530
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<220>
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202530
serglyalaproproproser
35
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<223>毒蜥外泌肽-4类似物
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202530
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202530
serglylysproproproser
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<223>毒蜥外泌肽-4类似物
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glnleualaargasppheileglutrpleuilexaaglyglypropro
202530
serglyalaproproproser
35
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<213>人工序列
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<223>毒蜥外泌肽-4类似物
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202530
serglyalaproproproser
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<223>毒蜥外泌肽-4类似物
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<400>59
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glnleualaargasppheileglutrpleuilexaaxaaglypropro
202530
serxaaalaproproproser
35
<210>60
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<220>
<223>毒蜥外泌肽-4类似物
<220>
<221>mod_res
<222>(2)..(2)
<223>aib
<220>
<221>mod_res
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<223>bala
<220>
<221>mod_res
<222>(29)..(29)
<223>d-ala
<220>
<221>mod_res
<222>(34)..(34)
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<220>
<221>mod_res
<222>(39)..(39)
<223>酰胺化的c-末端
<400>60
hisxaaglnglythrphethrseraspleuserlysleuleugluglu
151015
glnargalaargglupheileglutrpleuilexaaxaaglypropro
202530
serxaaalaproproproser
35
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