本发明涉及一种新型抗血栓聚合物纳米药物的制备及其应用。
背景技术：
严重危害人类健康的，特别是老年人健康的眼、心脑、血管等疾病与血栓形成密切相关，进入二十一世纪后，血栓已经成为全球第一大死亡原因，而血栓形成是由一组遗传和环境因素相互作用、相互影响的多因素变化过程。临床常见的血栓患者，最主要的特点有家族遗传性、反复发作性、症状严重性、血栓形成部位异常性以及发病时间年轻化等。
血栓的形成一般是多种疾病的病因或并发症，如失明、肺血栓栓塞症、动脉粥样硬化、冠心病、脑血管疾病、手术或外伤后的深静脉栓塞等。其中眼底静脉血管血栓多发病于老年人，主要是由于眼底血管弹性减弱，血液粘稠，形成血栓堵塞眼底血管，造成眼部供血不足，严重的会导致患者失明。随着临床上对血栓栓塞性疾病诊断水平的提高，抗血栓药物的合理应用变得愈加重要。
血栓可分为动脉血栓和静脉血栓，前者通常由血管壁受损，血小板聚集始动；后者主要因血循环停滞、凝血酶过多、纤维蛋白形成所致。临床常见的各种防治血栓的药物主要有以下三种：(1)抗血小板药，它是一类能够抑制血小板黏附、聚集和释放功能的药物，主要通过抑制血小板的聚集发挥防治血栓形成和发展的作用。根据其作用机制的不同，抗血小板药物主要分成影响花生四烯酸代谢药、血栓素A2(TXA2)合成酶抑制药和TXA2受体拮抗药、前列腺素类药物、环核苷酸磷酸二酯酶抑制药、干扰ADP介导的抗血小板药以及血小板糖肽(GP)IIb/IIIa受体拮抗剂六大类。(2)抗凝血药，主要有以下3类：①普通肝素(UFH)和低分子量肝素(LMWH)，低分子量肝素是由普通肝素衍生而来，普通肝素的分子量在5000～30000D之间，经化学或酶促解聚后而成为低分子量肝素，其分子量在4000～6500D之间。肝素口服无效，静脉注射后在血浆中均匀分布，迅速发挥最大抗凝效果，可用于防治血栓形成和栓塞，也可用于弥散性血管内凝血(DIC)的治疗；低分子量肝素在临床上主要用于预防深静脉血栓、肺动脉血栓、治疗不稳定心绞痛和心肌梗死，还用于血液体外循环和血液透析等。②华法林(warfarin)，双香豆素类中效抗凝剂。③直接凝血酶抑制剂，如水蛭素(hirudin)。(3)纤维蛋白溶解药，主要作用机制是直接或间接激活纤维蛋白溶酶原，使其转变为纤维蛋白溶酶(纤溶酶)，纤溶酶可以溶解血栓中的纤维蛋白，从而溶解血栓。传统的溶栓药物有链激酶、尿激酶、蚓激酶和蝮蛇激酶等，这些药物疗效显著且价廉易得，已经广泛地应用于临床。前两类用于防治动静脉血栓的形成，后一类用于溶解血栓。
血栓形成的防治是临床上重要的研究课题，多学科交叉研究推动了血栓性疾病的预防和治疗的发展。但现有的抗血栓药物在安全性等方面还存在着这样或那样的问题，比如说以下四种典型的抗血栓药物的副作用：①抗血小板药阿司匹林，不良反应主要有出血、胃肠道刺激及腹泻、皮疹等，尤其是需要大剂量使用时，副作用更加明显而不可避免。②尿激酶等传统的溶栓药物，比较容易引起出血并发症，造成皮肤、精神、血液、心血管、泌尿等系统的不良反应。尤其是抗凝类抗血栓药物，出血副作用更加突出，③华法林，最主要的口服抗凝药，但是其不良反应易受多种因素影响，药物、饮食、环境、遗传以及疾病状态等因素都会干扰华法林的药效，其使用剂量和出血不良反应都和遗传因素有很大关系，因此个体差异比较大。④肝素，典型的抗凝血药物，通过抗凝血因子II和Xa发挥作用，抑制血栓的形成，但非常容易引起出血副作用，所以一般只用作抗血栓治疗的辅助药物。因而研究新型高效、副作用少的抗血栓药具有重要意义。
与上述各种抗血栓药物相比较，研究发现了很多疏水抗血栓物质，它们都来源广泛，价格低廉，高效低毒，有极大的研究价值，受到越来越多的重视。
姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分，在中性至酸性水溶液中溶解度极低。大量研究证明，姜黄素除了具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、清除自由基、抗微生物以及对消化系统等多方面的药理作用之外，还有降血脂、抗动脉粥样硬化及抗血栓等心血管系统方面的药理作用。研究表明，姜黄素可完全阻滞C-反应蛋白(CRP)介导的人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)膜表面TM和内皮细胞活化蛋白C受体(EPCR)密度下调，抑制血栓形成(Nan B，Yang H，Yan S，et al.Creactive protein decreases expression of thrombomodulin and endothelial protein C receptor in human endothelial cells[J].Surgery，2005，138(2)：212-222.)。姜黄素还可抑制TNF-a导致HCAECs膜表面TM和EPCRMRNA的表达下调从而防止炎症介导的血栓形成(Nan B，Lin P，Lumsden AB，et al.Effects of TNF-alpha and curcumin on the expression of thrombomodulin and endothelial protein C receptor in human endothelial cells[J].Thromb Res，2005，115(5)：417-426.)。石晶的实验观察到，姜黄素对由ADP诱导的大鼠血小板聚集有明显的抑制作用，整体给药后可见血小板聚集率下降，体外试验姜黄素抑制血小板聚集的半数有效浓度为62.56mol/L；整体给药后姜黄素有明显的抑制血栓形成的作用，抑制率达60.31％(石晶，吴树荣.姜黄素对大鼠血小板聚集和血栓形成的影响[J].军医进修学院学报，1996，17(1)：31-33.)。此外，研究发现姜黄素还能用于眼科治疗方面，研究证明姜黄素有以下主要几个方面的治疗作用：增值性玻璃体视网膜病、春季卡他性结膜炎、白内障以及角膜血管新生等。姜黄素的抗纤维化、抗增殖和抑制新生血管生成等作用必将使其成为防治眼科疾病的优良天然药物。姜黄素来源广泛，价格低廉，高效低毒，具有极大的药用研究价值。
尽管姜黄素具有优异的药理活性，但由于姜黄素本身结构上具有多个活泼基团(如β-二酮结构)，导致其体内外稳定性均不佳，生物利用度很低。姜黄素在pH 5～6下稳定性较好，pH升高使其降解速度增加，而pH≤5时，虽然姜黄素比较稳定，但溶解度很低；姜黄素光敏性较强，室内光线对其影响较小，但室外光照条件下会迅速降解，需避光保存；有些表面活性剂(如SDS)能提高姜黄素的稳定性，而亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠等抗氧剂则大大加快了姜黄素的降解速度，导致开发稳定的姜黄素制剂存在较大难度。因此，有必要对姜黄素进行结构修饰以便提高其稳定性和溶解度。
熊果酸(ursolic acid，UA)又名乌苏酸、乌索酸，是一种存在于多种天然植物中的三萜类化合物，具有眼病治疗、抗血栓、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗菌、抗糖尿病、降低血糖、抗癌、抑制新生血管生成等多种生物学效应。有研究筛选了安全浓度范围内的熊果酸滴眼液，并考察了抑制缝线诱导的大鼠角膜新生血管的作用。研究发现，熊果酸通过下调VEGF及MMP-2的表达，减轻缝线导致的炎症反应，从而达到抑制角膜新生血管的目的。抗血小板聚集有助于阻滞动脉粥样硬化和血栓形成，研究发现，齐墩果酸和熊果酸体外抑制肾上腺素诱导的血小板聚集的IC50分别为45.3和82.6μmol/L，而阿司匹林的IC50为57.0μmol/L(Jin JL，Lee YY，Heo JE，et al.Anti-platelet pentacyclic triterpenoids from leaves of Campsis grandiflora[J].Arch Pharm Res，2004，27(4)：376-380.)。NO不仅能抑制血小板聚集，还具有保护血管内膜、抑制血管平滑肌细胞增生和扩张血管的作用，研究发现，熊果酸能显著提高人脐静脉内皮细胞表达eNOS、增加NO合成，也能显著抑制内皮细胞还原型辅酶II氧化酶亚单位Nox4表达、使活性氧生成减少而保护NO免遭活性氧灭活(Steinkamp-Fenske K，Bollinger V，Voller N，et al.Ursolic acid from the Chinese herb danshen(Salvia miltiorrhiza L.)upregulates eNOS and downregulates Nox4 expression in human endothelial cells[J].Atherosclerosis，2007，195(1)：e104-e111.)。此外，熊果酸资源广，毒性反应少，越来越受到大家的关注。但是熊果酸难溶于水，导致其制剂制备困难和生物利用低等问题，因此提高难溶性熊果酸的溶解度，进而提高其生物利用度成为一个难点。
除此之外，还有很多疏水抗血栓物质，如：①酚类中的黄芩素，可抑制胶原诱导的大鼠血小板聚集作用，抑制凝血酶诱导的纤维蛋白原转化为纤维蛋白；对花生四烯酸诱导的血小板聚集也有抑制作用，并防止由内毒素诱导的DIC及大鼠血小板和纤维蛋白原的减少，发挥抗凝血和抗血栓形成的作用。②槲皮素，可通过改善红血球的可变性，抑制胶原激活的血小板酪氨酸蛋白磷酸化，进而减少血小板聚集以及胶原激活的血栓形成。③甘草酸及甘草次酸，作为凝血酶的抑制剂，有抗凝血活性，还有降血脂与抗动脉粥样硬化的作用。④齐墩果酸，能诱导丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)磷酸化、激活cAMP应答元件结合蛋白、上调环氧化酶-2表达、时间和浓度依赖性地诱导前列腺素I2合成和释放，但不诱导血栓素A2合成和释放；同时还能促进一氧化氮(NO)合成和释放，从而发挥抑制血小板聚集的作用。但是这些物质脂溶性较强，制剂制备难度大，注射给药困难，再加上口服给药导致生物利用度低，很大程度上限制其开发和临床应用。
肝素属于粘多糖类药物，是一种性能优异的抗凝、抗血栓药物。然而，肝素在临床应用时，人们发现它有比较严重的出血副作用，出血发生率高达35％，这样在某种程度上限制了肝素的应用。70年代中期和80年代初期，有人发现从标准肝素(SH)中分离出的分子量较小的肝素片段(低分子量肝素LMWH)，具有与SH同样的抗Xa因子(FXa)作用，而活化部分凝血活酶时间(APTT)缩短，可产生与SH相同的抗血栓作用，出血可能性有所降低。与SH相比，LMWH具有生物利用度高，血浆半衰期长等优点，临床已经证明LMWH是一种安全有效的抗血栓药，但是临床上仍需时刻注意用药剂量，以减少出血等风险。目前应用于临床的LMWH有多种，主要用于深部静脉血栓(DVT)的预防，特别是普通手术后的预防。例如依诺肝素，Samama等为了确定依诺肝素预防术后血栓形成的最佳剂量，先后对892例手术病人进行了连续随机研究，分别皮下用依诺肝素60、40、20mg，每天1次，SH用5000u，每天3次，结果表明各组血栓出现率均无显著差异，认为依诺肝素在剂量为20mg/d时，既安全又有效(Samama AA，et al.Br J Surg，1988，75：128.)。但是各厂家生产的LMWH预防术后DVT对照组比较有显著差别，所以用药剂量应该因药而异。此外，研究还表明，LMWH有抑制血管新生的作用，其主要机制有3个：①抑制血管生长因子介导的血管内皮细胞的恶性增殖；②影响纤维蛋白的基质生成，改变纤维蛋白的凝集结构，降低纤溶酶原激活物的敏感度；③LMWH表面的丰富的负电性，可以与血管形成有关的蛋白质进行结合，比如VEGF、iNOS，进而降低其活性(闫钧，郑起.肝素在肿瘤治疗中的应用[J].国外医学外科学分册，2004，31：3～6.)。更重要的是，肝素及其衍生物是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成酸性粘多糖硫酸酯，具有良好的水溶性，因其结构上含有大量的羟基和羧基，易于进行结构修饰。
终上所述，本发明通过将疏水抗血栓物质(如熊果酸、姜黄素等)与亲水抗血栓物质(如肝素或其衍生物)化学连接制得一种活性更好的新型抗血栓聚合物纳米药物，其优势在于：①通过与亲水抗血栓物质肝素或其衍生物化学连接，显著提高了疏水抗血栓物质的水溶性和稳定性，从而克服其剂型设计的局限。同时，借助聚合物纳米药物突出的剂型优势，其亲水外壳有助于避免被网状内皮系统吞噬，延长其在血液系统中循环时间，并保持稳定，从而延长纳米药物的作用时间，使更多的药物有效递送至血管堵塞部位并发挥疗效，最终提高抗血栓活性，此外，还可减少药物的给药剂量，从而降低毒副作用，保证同等的甚至更好的治疗效果。②采用疏水抗血栓物质化学修饰亲水抗血栓物质肝素或其衍生物，可优化其生物特性(如增强抗血栓活性)，更重要的是，可显著降低其出血风险，在发挥更好的疗效的同时，具有更好的用药安全性。③两种生物活性的物质化学连接制成的新药物分子，还可协同两种不同作用机制，实现生物活性的互补，从而发挥更强的治疗作用。例如：抗凝血的低分子量肝素和抗血小板的熊果酸，基于两种药物不同的抗血栓机制，制得的新药物分子可同时发挥抗凝血和抗血小板两种机制的抗血栓活性。因此，本发明的设计在治疗方面具有突出优势。④纳米药物粒径小且吸附能力强，使得药物与吸收部位的接触时间延长，可增加药物在吸收部位的浓度，延长了药物的半衰期，从而增强其抗血栓疗效。⑤纳米药物还可以克服机体屏障对药物作用的限制，如血脑屏障及血眼屏障等，使药物高效递送至病灶部位，亦可明显提高疗效。⑥该纳米药物不仅可以单独用作聚合物药物，也可物理包覆其他药学活性或者药理活性分子制得聚合物药物组合物，提高药学活性或药理活性分子的抗血栓活性。⑦该纳米药物口服给药时，还可以包载其他口服抗血栓药物，可以使其在进入血液循环之前，减少对胃肠粘膜的损伤，降低副作用。⑧该纳米药物亦可制成眼部给药制剂，通过眼部给药，直接作用于眼部深静脉血栓，迅速发挥疗效。
技术实现要素：
本发明的目的针对上述应用问题，提供一种新型抗血栓聚合物纳米药物，该聚合物纳米药物一方面改善了疏水抗血栓物质的溶解性和稳定性，另一方面能够显著降低亲水抗血栓物质肝素或其衍生物的出血风险，同时，该设计还可延长药物作用时间、突破机体屏障对药物作用的限制，发挥协同抗血栓活性，同时降低毒副作用。本发明使亲水抗血栓物质和疏水抗血栓物质的应用具有更广阔的产业化前景。
本发明的另一个目的是提供上述新型抗血栓聚合物纳米药物的制备方法。
本发明还有一个目的是提供上述新型抗血栓聚合物纳米药物在抗血栓中的应用。
为了达到上述发明目的，本发明提供了一种新型抗血栓聚合物纳米药物，利用亲水抗血栓物质肝素或其衍生物主链上大量的羧基，通过化学连接的方法，引入疏水抗血栓物质，形成聚合物纳米药物。该聚合物纳米药物的亲水性外壳可以避免被网状内皮系统吞噬，延长其在血液系统的循环时间，并保持稳定，从而延长药物作用时间，增加药物在病灶部位的浓度；其还可以克服机体屏障对药物作用的限制，使更多的药物有效递送至血管堵塞部位，发挥疗效，从而提高抗血栓活性，同时，可以减少药物的给药剂量，降低毒副作用，保证同等的甚至更好的治疗效果。
所述的新型抗血栓聚合物纳米药物，其中选用的亲水抗血栓物质是未分级肝素、脱硫酸化肝素、低分子量肝素。
所述的新型抗血栓聚合物纳米药物，其中选用的疏水抗血栓物质是甘草酸、甘草次酸、熊果酸、齐墩果酸、黄芩素、槲皮素、姜黄素。
所述的新型抗血栓聚合物纳米药物的制备方法，根据疏水抗血栓物质的结构不同，包括下列两个方法：
a.疏水抗血栓物质的结构通式为R1-COOH
将疏水抗血栓物质溶于适当有机溶剂，采用两端同时含有氨基的连接臂，加入羧基活化剂，疏水抗血栓物质与连接臂一端的氨基发生酰胺化反应得到游离一端氨基的疏水抗血栓活性物质中间体1；或将疏水抗血栓物质溶于适当有机溶剂，采用两端同时含有氨基的连接臂以及对羟基苯甲醛，加入羧基活化剂，疏水抗血栓物质的羧基与连接臂一端的氨基发生酰胺化反应，然后连接臂另外一端的氨基与对羟基苯甲醛的醛基发生希夫碱反应，最后得到游离一端羟基的疏水抗血栓活性物质中间体2；将亲水抗血栓物质溶于反应溶剂中，通过疏水抗血栓活性物质中间体1的氨基进一步和亲水抗血栓物质主链上的羧基的酰胺化反应，或者通过疏水抗血栓活性物质中间体2的羟基进一步和亲水抗血栓物质主链上的羧基的酯化反应，即得新型抗血栓聚合物纳米药物。
b.疏水抗血栓物质的结构通式为R2-OH
将亲水抗血栓物质和疏水抗血栓物质分别溶于反应溶剂中，加入羧基活化剂，通过酯化反应，将疏水抗血栓物质接枝到亲水抗血栓物质的主链上，即得新型抗血栓聚合物纳米药物。
所述的制备方法a和b，其中适当有机溶剂选自四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、或四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺、或四氢呋喃与二甲基亚砜的混合物。
所述的制备方法a，其中两端同时含有氨基的连接臂选自对苯二胺、间苯二胺、邻苯二胺、胱胺、或碳原子数为2～12的亚烷基二胺。
所述的制备方法a和b，其中反应溶剂选自甲酰胺、或甲酰胺与四氢呋喃、或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。
所述的新型抗血栓聚合物纳米药物，可单独用作聚合物药物，也可物理包覆其他疏水药学活性或者药理活性分子制得聚合物药物组合物。所述疏水药学活性或者药理活性分子选自阿司匹林及其他水杨酸衍生物类抗血小板药、氯吡格雷类抗血小板药、华法林类抗凝药中的任一抗血栓活性物质或其衍生物。
所制备的新型抗血栓聚合物药物或抗血栓聚合物药物组合物加上相应的药用辅料可制备成相应的用于注射、口服或眼部给药的制剂。
该抗血栓聚合物纳米药物组合物的制备方法操作步骤如下：抗血栓聚合物纳米药物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到抗血栓聚合物纳米药物溶液；将治疗有效量的难溶或微溶于水的其他抗血栓药物用药学上可接受的溶剂溶解，与所述的抗血栓聚合物纳米药物溶液混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或乳化溶剂挥发法除去有机溶剂小分子得到粒径为10～1000nm的抗血栓聚合物纳米药物组合物，得到的抗血栓聚合物纳米药物组合物可直接应用，也可通过冷冻干燥或喷雾干燥制成固体制剂。
具体方案如下：
在亲水抗血栓物质肝素或其衍生物骨架上引入疏水抗血栓物质，显著提高了疏水抗血栓物质的水溶性和稳定性。同时，借助聚合物纳米药物突出的剂型优势，其亲水外壳有助于避免被网状内皮系统吞噬，延长其在血液系统中循环时间，并保持稳定，从而延长纳米药物的作用时间，使更多的药物有效递送至血管堵塞部位并发挥疗效，最终提高抗血栓活性，此外，还可减少药物的给药剂量，降低毒副作用，保证同等的甚至更好的治疗效果。同时，该抗血栓聚合物纳米药物还可物理包裹其他难溶性抗血栓药物制成抗血栓聚合物纳米药物组合物。粒径在10～1000nm可控，均匀度好，再分散性好，载药量高。该抗血栓聚合物纳米药物及其药物组合物加上相应的药用辅料可制备成相应的用于注射、口服或眼部给药的制剂。
所述的具备抗血栓活性的新型抗血栓聚合物纳米药物及抗血栓聚合物纳米药物组合物的具体制备方法如下：
一、新型抗血栓聚合物纳米药物的制备
a.疏水抗血栓物质的结构通式为R1-COOH，具体制备步骤如下：
(1)将疏水抗血栓物质溶于适当有机溶剂，先加入羧基活化剂，再加入过量的两端同时含有氨基的连接臂，控制反应条件至反应完全，用饱和氯化钠溶液沉淀，沉淀物洗涤纯化，抽滤得沉淀物，真空干燥，得到游离一端氨基的疏水抗血栓活性物质中间体1；或将疏水抗血栓物质溶于适当有机溶剂，加入适当的羧基活化剂，再加入过量的两端同时含有氨基的连接臂以及对羟基苯甲醛，控制反应条件至反应完全，用无水乙醚沉淀，沉淀物洗涤纯化，真空干燥，得到游离一端羟基的疏水抗血栓活性物质中间体2；
步骤(1)中所述的适当有机溶剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、或者四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺、或四氢呋喃与二甲基亚砜的混合物；所述的两端同时含有氨基的连接臂选自对苯二胺、间苯二胺、邻苯二胺、胱胺、或碳原子数为2～12的亚烷基二胺；所述的适当的羧基活化剂是指二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)、或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)、或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBT)；所述的加入过量连接臂是指疏水抗血栓物质与两端同时含有氨基的连接臂的适当摩尔比为1∶1～1∶50；所述的中间体1的控制反应条件为，反应温度0～45℃；连接臂缓慢滴加完之后，再反应2～16h；所述的中间体2的控制反应条件为，反应温度0～45℃，两端同时含有氨基的连接臂缓慢滴加完之后，再反应2～16h，沉淀物与对羟基苯甲醛分别用无水乙醇溶解，先冰浴反应0.5～4h，再油浴温度45℃～120℃下反应4～8h。
(2)将亲水抗血栓物质肝素或其衍生物溶于反应溶剂中，在惰性气体保护下，加入适当羧基活化剂，再加入游离一端氨基的疏水抗血栓活性物质中间体1或游离一端羟基的疏水抗血栓活性物质中间体2，控制反应完全，用适当溶剂沉淀，过滤得沉淀物，复溶，超声，透析(MWCO＝3500)，冷冻干燥，即得新型抗血栓聚合物纳米药物；根据疏水抗血栓物质对光的耐受性，选择是否避光反应。
步骤(2)中所述的适当反应溶剂为甲酰胺、或甲酰胺与四氢呋喃、或甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂；所述的适当的羧基活化剂是指N，N’-羰基二咪唑(CDI)、或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)、或者4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)；所述的控制反应为先加入羧基活化剂，冰浴反应0.2～3h后，再加入游离一端氨基的疏水抗血栓活性物质中间体1或游离一端羟基的疏水抗血栓活性物质中间体2，室温反应6～72h；所述的适当沉淀溶剂为冰丙酮、冰乙醚、冰乙醇或冰乙酸乙酯。
b.疏水抗血栓物质的结构通式为R2-OH，具体制备步骤如下：
将亲水抗血栓物质肝素或其衍生物和疏水抗血栓物质分别溶于适当反应溶剂中，加入羧基活化剂，控制反应至完全，用适当溶剂沉淀，过滤得沉淀物，复溶，超声，透析(MWCO＝3500)，冷冻干燥，即得新型抗血栓聚合物纳米药物；根据疏水抗血栓物质对光的耐受性，选择是否避光反应。
方法b中所述的适当反应溶剂为四氢呋喃、甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、或者甲酰胺与四氢呋喃、或者甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺、或者四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂；所述的适当的羧基活化剂是指N，N’-羰基二咪唑(CDI)、或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)、或者4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)；所述的控制反应为先加羧基活化剂，冰浴反应0.2～3h后，缓慢滴加疏水抗血栓物质，滴加完后再室温反应6～72h；所述的适当沉淀溶剂为冰丙酮、冰丙酮、冰乙醚、冰乙醇或冰乙酸乙酯。
二、新型抗血栓聚合物纳米药物组合物的制备
新型抗血栓聚合物纳米药物与水按照重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到新型抗血栓聚合物纳米药物溶液；将治疗有效量的难溶或微溶于水的其他抗血栓药物用药学上可接受的溶剂溶解，与所述的新型抗血栓聚合物纳米药物溶液混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或乳化溶剂挥发法除去有机溶剂小分子得到粒径为10～1000nm的抗血栓聚合物纳米药物组合物。
本发明相对于现有技术具有如下效益：
(1)本发明根据疏水抗血栓物质结构的特征，利用简单的酰胺反应、希夫碱反应和酯化反应，将疏水抗血栓物质接枝到亲水抗血栓物质肝素或其衍生物主链上，制备过程简单，操作容易，减少成本，提高效率，容易实现工业化。
(2)本发明将疏水抗血栓物质接枝到亲水抗血栓物质肝素或其衍生物主链上，显著提高了疏水抗血栓物质的水溶性和稳定性。同时，借助聚合物纳米药物突出的剂型优势，其亲水外壳有助于避免被网状内皮系统吞噬，延长其在血液系统中循环时间，并保持稳定，从而延长纳米药物的作用时间，使更多的药物有效递送至血管堵塞部位并发挥疗效，最终提高抗血栓活性，此外，还可减少药物的给药剂量，降低毒副作用，保证同等的甚至更好的治疗效果。用疏水抗血栓物质化学修饰亲水抗血栓物质肝素或其衍生物，可优化其生物特性(如增强抗血栓活性)，更重要的是，可显著降低其出血风险，在发挥更好的疗效的同时，具有更好的用药安全性。
(3)本发明提供的新型抗血栓聚合物纳米药物，不仅具有亲水抗血栓物质肝素及其衍生物的良好的生物学特性，还能更好地发挥疏水抗血栓物质的抗血栓功效。
(4)本发明提供的新型抗血栓聚合物纳米药物，其中疏水抗血栓物质与亲水抗血栓物质肝素或其衍生物两者都具有抗血栓的作用，故形成具有双重活性的聚合物纳米药物，可以减小给药剂量以及给药次数，提高患者的耐受性。
(5)本发明提供的新型抗血栓聚合物纳米药物具有良好的生物相容性和生物可降解性，还具有临界胶束浓度低、稳定性好、毒副作用低的优势，且对其他疏水抗血栓药物具有良好的增溶作用。
(6)本发明提供的新型抗血栓聚合物纳米药物可单独用作聚合物纳米药物，也可物理包覆其他药学活性或者药理活性分子制得聚合物药物组合物，提高药学活性或药理活性分子的抗血栓活性，具有更广泛的应用空间。
(7)本发明提供的新型抗血栓聚合物纳米药物可用于胃肠道途径或非胃肠道途径给药，具有高度安全性，粒径可控制在10～1000nm。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1：齐墩果酸-脱硫酸化肝素聚合物纳米药物的合成
称取齐墩果酸(OA)适量置于茄形瓶中，加入四氢呋喃与N，N-二甲基甲酰胺的混合物溶解完全，OA的摩尔浓度为0.1mmol/mL，冰浴，在惰性气体保护的条件下，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBT)，OA、EDCI、HOBT的摩尔比依次为1∶1.4∶1.4。冰浴反应60min，再缓慢滴加到对苯二胺中，OA与对苯二胺的摩尔比为1∶2，控制滴速在每滴间隔10秒，反应温度36℃，再反应12h，饱和食盐水沉淀，过滤，依次进行酸洗，水洗，真空干燥，得粉末OA-NH2。称取适量脱硫酸化肝素用甲酰胺与四氢呋喃的混合物溶解，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)。惰性气体保护的条件下，将EDC和NHS加入脱硫酸化肝素溶液中，冰浴活化45min后，将OA-NH2的DMF溶液(与脱硫酸化肝素摩尔比为2∶1)加入到脱硫酸化肝素的溶液中。室温反应36h，加入过量体积的冰乙醇沉淀产物，抽滤，得产物。产物用蒸馏水复溶，探头超声45min，在蒸馏水中透析3d(MWCO＝3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得齐墩果酸-脱硫酸化肝素聚合物纳米药物。
实施例2：姜黄素-低分子量肝素聚合物纳米药物的合成
称取适量姜黄素和低分子量肝素(姜黄素和低分子量肝素摩尔比为2∶1)，分别用甲酰胺溶解完全，在低分子量肝素溶液中分别依次加入DMAP、EDC和NHS(LMWH、DMAP、EDC、NHS的摩尔比为1∶0.2∶3∶3)，冰浴反应30min，避光条件下，再将姜黄素溶液缓慢滴加到LMWH反应溶液中，控制滴速为每滴间隔5秒，室温反应24h。加入过量体积的冰丙酮沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，探头超声40min，在蒸馏水中透析2d(MWCO＝3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得姜黄素-低分子量肝素聚合物纳米药物。
实施例3：熊果酸-低分子量肝素聚合物纳米药物的合成
称取熊果酸(UA)适量置于茄形瓶中，加入四氢呋喃溶解完全，UA的摩尔浓度为0.05mmol/mL，冰浴，在惰性气体保护的条件下，依次加入二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，UA、DCC、NHS的摩尔比依次为1∶1.2∶1.2。冰浴反应30min，移至室温反应24h。真空抽滤除去沉淀物二环己基脲(DCU)，得滤液。滤液用3倍量的正己烷沉淀12h，过滤，真空干燥，得琥珀酰亚胺基UA。称取适量琥珀酰亚胺基UA用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，缓慢滴加到邻苯二胺中，UA与邻苯二胺的摩尔比为1∶1，控制滴速在每滴间隔3秒，反应温度25℃，再反应6h，饱和食盐水沉淀，过滤，依次进行酸洗，水洗，真空干燥，得白色粉末UA-NH2。称取适量低分子量肝素(LMWH)用甲酰胺溶解，加入EDC和NHS。惰性气体保护的条件下，将EDC和NHS加入LMWH溶液中，冰浴活化30min后，将UA-NH2的DMF溶液(与LMWH摩尔比为1∶1)加入到LMWH的溶液中。室温反应24h，加入过量体积的冰丙酮沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO＝3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得熊果酸-低分子量肝素聚合物纳米药物。
实施例4：槲皮素-低分子量肝素聚合物纳米药物的合成
称取适量槲皮素和低分子量肝素(槲皮素和低分子量肝素摩尔比为3∶1)，分别用N，N-二甲基甲酰胺溶解完全，在低分子量肝素溶液中分别依次加入EDC和NHS(LMWH、EDC、NHS的摩尔比为1∶10∶10)，冰浴反应60min，再将槲皮素溶液缓慢滴加到LMWH反应溶液中，控制滴速为每滴间隔2秒，室温反应36h。加入过量体积的冰乙酸乙酯沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，探头超声60min，在蒸馏水中透析3d(MWCO＝3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得槲皮素-低分子量肝素聚合物纳米药物。
实施例5：黄芩素-肝素聚合物纳米药物的合成
称取适量黄芩素和肝素(黄芩素和肝素摩尔比为4∶1)，分别用甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合物溶解完全，在肝素溶液中加入CDI(肝素、CDI的摩尔比为1∶1)，冰浴反应45min，再将黄芩素溶液缓慢滴加到肝素反应溶液中，控制滴速为每滴间隔10秒，室温反应48h。加入过量体积的冰乙醇沉淀产物，抽滤，得产物。产物用蒸馏水复溶，探头超声30min，在蒸馏水中透析36h(MWCO＝3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得黄芩素-肝素聚合物纳米药物。
实施例6：甘草酸-肝素聚合物纳米药物的合成
称取甘草酸(GA)适量置于茄形瓶中，加入四氢呋喃与二甲基亚砜的混合物溶解完全，GA的摩尔浓度为0.05mmol/mL，冰浴，在惰性气体保护的条件下，依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，GA、EDC、NHS的摩尔比依次为1∶1.1∶1.1。冰浴反应25min，再缓慢滴加到胱胺中，GA与胱胺的摩尔比为1∶5，控制滴速在每滴间隔15秒，反应温度20℃，再反应8h，饱和食盐水沉淀，过滤，依次进行酸洗，水洗，真空干燥，得粉末GA-NH2。称取适量肝素用甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合物溶解，依次加入DMAP、EDC、NHS。惰性气体保护的条件下，将DMAP、EDC、NHS加入肝素溶液中，冰浴活化20min后，将GA-NH2的DMF溶液(与肝素摩尔比为3∶1)加入到肝素的溶液中。室温反应48h，加入过量体积的冰乙醚沉淀产物，抽滤，得产物。产物用蒸馏水复溶，探头超声60min，在蒸馏水中透析1d(MWCO＝3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得甘草酸-肝素聚合物纳米药物。
实施例7：甘草次酸-低分子量肝素聚合物纳米药物的合成
称取甘草次酸适量置于茄形瓶中，加入四氢呋喃与二甲基亚砜的混合物溶解完全，甘草次酸的摩尔浓度为0.05mmol/mL，冰浴，在惰性气体保护的条件下，依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，甘草次酸、EDC、NHS的摩尔比依次为1∶1.1∶1.1。冰浴反应25min，再缓慢滴加到间苯二胺中，甘草次酸与间苯二胺的摩尔比为1∶5，控制滴速在每滴间隔15秒，反应温度20℃，再反应8h，饱和食盐水沉淀，过滤，依次进行酸洗，水洗，真空干燥，得游离一端氨基的甘草次酸中间体。称取适量低分子量肝素用甲酰胺与N，N-二甲基甲酰胺的混合物溶解，加入CDI。惰性气体保护的条件下，将CDI加入低分子量肝素溶液中，冰浴活化20min后，将游离一端氨基的甘草次酸中间体的DMF溶液(与低分子量肝素摩尔比为3∶1)加入到低分子量肝素的溶液中。室温反应48h，加入过量体积的冰乙醚沉淀产物，抽滤，得产物。产物用蒸馏水复溶，探头超声60min，在蒸馏水中透析1d(MWCO＝3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得甘草次酸-低分子量肝素聚合物纳米药物。
实施例8：熊果酸-肝素聚合物纳米药物的合成
称取熊果酸(UA)适量置于茄形瓶中，加入四氢呋喃溶解完全，UA的摩尔浓度为0.05mmol/mL，冰浴，在惰性气体保护的条件下，依次加入二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，UA、DCC、NHS的摩尔比依次为1∶1.2∶1.2。冰浴反应30min，移至室温反应24h。真空抽滤除去沉淀物二环己基脲(DCU)，得滤液。滤液用3倍量的正己烷沉淀12h，过滤，真空干燥，得琥珀酰亚胺基UA。称取适量琥珀酰亚胺基UA用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，缓慢滴加到乙二胺中，UA与乙二胺的摩尔比为1∶1，控制滴速在每滴间隔3秒，反应温度25℃，再反应6h，饱和食盐水沉淀，过滤，依次进行酸洗，水洗，真空干燥，得白色粉末UA-NH2。称取UA-NH2和对羟基苯甲醛分别用无水乙醇溶解，先冰浴反应2h，再油浴90℃反应6h，无水乙醚沉淀，抽滤、真空干燥，得淡黄色粉末UA-OH。称取适量肝素用甲酰胺溶解，加入CDI。惰性气体保护的条件下，将CDI加入肝素溶液中，冰浴活化30min后，将UA-OH的DMF溶液(与肝素摩尔比为1∶1)加入到肝素的溶液中。室温反应24h，加入过量体积的冰丙酮沉淀产物，抽滤，得产物。产物用超纯水复溶，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO＝3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得熊果酸-肝素聚合物纳米药物。
实施例9：新型抗血栓聚合物纳米药物溶液的制备和表征
1.新型抗血栓聚合物纳米药物溶液的制备：根据疏水抗血栓物质的性质，考虑是否需要避光的条件下，取新型抗血栓聚合物纳米药物18mg溶解在3ml双蒸水中，于室温搅拌30min，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤，即得。
2.粒径：将1制备得到的新型抗血栓聚合物纳米药物溶液，取1ml用水稀释到3ml，用粒径测定仪(Malvem Instruments，Malvern，UK)进行测定，结果见表1。由表可知，制备得到的新型抗血栓聚合物纳米药物溶液，颗粒粒径达到纳米级，且粒径分布小。
3.临界胶束浓度(CMC)：采用最为灵敏的荧光探针法测定CMC。以芘为荧光探针，芘是一种疏水性芳香化合物，对环境极性极敏感。当两亲性分子的浓度低于CMC时，溶液不会形成胶束，芘溶解在极性的水中；随着两亲性分子的浓度高于CMC，胶束形成。芘相向胶束内核的疏水部分分配，从而进入非极性环境，继而在其荧光光谱中可以观察到一系列变化，如荧光强度增加，放射光谱中振动精细结构发生变化，激发光谱(0，0)波段红移。因此，通过以芘的发射光谱中的I1/I3比(在固定的激发波长下扫描，I1、I3分别代表发射光谱中第一和第三强峰的荧光强度比)或激发光谱中的I338/I333比(激发光谱中波长分别为338nm和333nm的荧光强度比)对两亲性分子的浓度作图即可获得两亲性分子的表观CMC，结果见表1。
表1新型抗血栓聚合物纳米药物溶液的表征
实施例10：新型抗血栓聚合物纳米药物的溶解度考察
新型抗血栓聚合物纳米药物的溶解度考察方法：分别称取疏水抗血栓物质1mg溶解在10mL水中，以及新型抗血栓聚合物纳米药物1g溶解在1mL水中，室温下每隔5min振荡30s，观察30min内是否能完全溶解。结果见表2。由表2可知，将疏水抗血栓物质接到亲水抗血栓物质肝素或其衍生物主链上后，能显著改善疏水抗血栓物质的溶解性。
表2新型抗血栓聚合物纳米药物的溶解度
注：几乎不溶：-；可以溶解：++；溶解度较好：+++；易溶：++++
实施例11：新型抗血栓聚合物纳米药物华法林组合物的制备和表征
1.制备工艺
(1)透析法
将抗血栓聚合物纳米药物18mg，溶解在3mL蒸馏水中，搅拌30min。华法林5mg溶解在乙醇中。将两者混合，探头超声45min，双蒸水透析12h，离心(3000rpm)20min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(2)乳化溶剂挥发法
将抗血栓聚合物纳米药物18mg，溶解在3mL蒸馏水中，搅拌30min。华法林5mg溶解在二氯甲烷中。将两者混合，探头超声45min，室温敞口搅拌12h，使二氯甲烷挥发，离心(3000rpm)20min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2.新型抗血栓聚合物纳米药物华法林组合物中华法林的含量测定
用HPLC方法进行含量测定。采用Diamonsil C18(4.6mm×250mm，5μm)为分离柱，流动相为乙腈∶水∶冰醋酸＝70∶30∶1(v/v)，流速为1.0mL/min，柱温为室温，检测波长308nm，进样量为20μL，以公式(1)带入各峰面积值计算样品的载药量。结果见表3。
表3新型抗血栓聚合物纳米药物华法林组合物的载药量
实施例12：姜黄素类聚合物纳米药物的稳定性考察
用磷酸二氢钠、磷酸氢二钠作为缓冲体系，用40％甲醇溶液(姜黄素不溶于水，溶于一定浓度的甲醇溶液)配成浓度为0.2mol/L，pH值为7.4的缓冲溶液作为稳定性考察介质。配制姜黄素含量为60μg/mL的下列不同样品溶液：姜黄素溶液、姜黄素-低分子量肝素溶液、姜黄素-脱硫酸化肝素溶液、姜黄素-肝素溶液，置于25℃恒温水浴中，定时取样400μL，溶于3.6mL的甲酰胺中，420nm测定吸光度值。以各溶液在0时间点的吸光度值作为基准吸光度值A0，相对吸光度值比Ai/A0(％)为各时间点下的吸光度值Ai与基准透光率A0的百分比，Ai/A0(％)也能代表各时间点姜黄素的剩余百分比，结果见表4。由表4可以看出，聚合物纳米药物中的姜黄素的稳定性显著高于游离姜黄素的稳定性。
表4姜黄素类聚合物纳米药物的稳定性(Ai/A0(％))
实施例13：新型抗血栓聚合物纳米药物抗凝活性的检测
采用活化部分凝血活酶时间(APTT)法检测聚合物纳米药物的抗凝血活性。兔耳缘静脉取血，置于含有1/10体积0.109M枸橼酸钠抗凝液(1份抗凝液+9份全血)的塑料管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，收集上层液(血浆)。将样品溶液0.1mL(41.67ug/mL)加入0.4mL枸橼酸钠血浆中，再加入37℃预温的APTT试剂0.1mL，37℃孵育5min。同时以空白血浆作为对照。然后，加入37℃预温的0.025mol/L CaCl2溶液0.1mL，启动秒表，记录血浆凝固时间，每个样品3个复管测定，取平均值。结果见表5。由表5可以看出，经疏水抗血栓物质修饰后，亲水抗血栓物质肝素或其衍生物的抗凝活性降低，从而降低了其从注射部位到到达血栓部位之前大量使用引起的出血风险。
表5新型抗血栓聚合物纳米药物的抗凝活性(Mean±SD)
实施例14：新型抗血栓聚合物纳米药物抗血栓活性的测定
采用血小板聚集率法测定。吸取300μL乏血小板血浆(PPP)置于血小板聚集仪测试区调零，再吸取270μL富血小板血浆(PRP)置于预热槽中，分别加入20μL受试样品，再加入10μL凝血酶诱导剂，37℃预热5min后置于测试区，测定5min内血小板的最大聚集率。其中，阴性对照为生理盐水。通过公式(2)计算血小板聚集抑制率，结果见表6。由表6可以看出，本发明制备得到的新型抗血栓聚合物纳米药物的抗血栓活性显著提高。
注：X代表生理盐水组血小板最大聚集率；Y代表各组分血小板最大聚集率
表6新型抗血栓聚合物纳米药物的抗血栓活性