本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种干细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
随着社会进步和人们生活、饮食方式的转变，糖尿病发病率逐年增高。中国近期一项流行病学研究结果表明，中国的糖尿病患病率已达9.7％，高于世界平均水平6.4％。糖尿病足是导致糖尿病患者残疾，甚至死亡的严重慢性并发症之一。随着我国人口老龄化的发展，糖尿病足发病率逐年增高，处理不当有可能会截肢或死亡，而85％截肢起因于溃疡。糖尿病足溃疡的发生使糖尿病患者生活质量降低，住院时间延长，给社会和家庭带来了巨大的经济负担，因此需对糖尿病足溃疡的防治进行综合评价，及早预防和治疗。
临床上用于治疗糖尿病足的方法有药物治疗、血管重建和介入手术，然而，糖尿病患者多年老体弱，常患有心脑血管等疾病，不能耐受手术搭桥等刺激，且血管病变多累及小动脉，部分患者缺乏远段动脉流出道，不具备行血管搭桥和介入治疗的条件。因此，迫切需要寻求一种能促进糖尿病足溃疡修复的制剂或方法。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种干细胞制剂及其制备方法和应用，用于修复糖尿病足溃疡，降低截肢率，改善患者的生活质量。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种干细胞制剂，包括：脂肪间充质干细胞、富含血小板血浆和表皮生长因子。
优选的，所述脂肪间充质干细胞的细胞密度为1×105～10×105个/ml。
优选的，所述富含血小板血浆的体积百分比浓度为5％。
优选的，所述表皮生长因子的工作浓度为5ng/ml。
优选的，所述脂肪间充质干细胞为第三代至第五代脂肪间充质干细胞。
优选的，所述干细胞制剂的剂型为注射制剂。
优选的，所述干细胞制剂的注射剂量为3～8ml/次。
本发明还提供了上述干细胞制剂的制备方法，将脂肪间充质干细胞、富含血小板血浆和表皮生长因子混合，得到所述干细胞制剂。
本发明还提供了上述干细胞制剂或上述制备方法得到的干细胞制剂在制备修复糖尿病足溃疡的药物中的应用。
本发明所提供的一种干细胞制剂，包括：脂肪间充质干细胞、富含血小板血浆和表皮生长因子，各组分配伍合理、协同增效，共同促进了糖尿病足的伤口愈合；本发明采用脂肪间充质干细胞作为种子细胞，采集简单、容易获得，而且免疫原性低，无伦理问题，对于糖尿病患者具有重要意义；本发明所提供的制备方法，步骤操作简单，工艺优化，可实现规模化生产。
具体实施方式
本发明提供了一种干细胞制剂极其制备方法和应用，有助于降低截肢率，改善患者的生活质量。本发明所提供的干细胞制剂包括：脂肪间充质干细胞、富含血小板血浆、表皮生长因子和溶媒。
进一步的，所述脂肪间充质干细胞的细胞密度为1×105～10×105个/ml。
进一步的，所述富含血小板血浆的体积百分比浓度为5％。
进一步的，所述表皮生长因子的工作浓度为5ng/ml。
进一步的，所述脂肪间充质干细胞为第三代至第五代脂肪干细胞。
本发明对脂肪间充质干细胞、富含血小板血浆和表皮生长因子的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的即可，如市售来源的脂肪间充质干细胞、富含血小板血浆和表皮生长因子，也可采用本领域技术人员熟知的常规制备方法进行制备。
更进一步的，所述干细胞制剂中还包括：溶媒；所述溶媒优选为干细胞生长因子。
本发明对所述溶媒的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的干细胞生长因子即可，如市售来源。在本发明的一些实施例中，溶媒为本公司赛斯兰黛系列的干细胞生长因子，主要成分为人体干细胞生长因子、去离子水、丁二醇、己二醇、丙二醇、复合氨基酸、葡聚糖、芦荟提取液、聚谷氨酸和维生素e等。
进一步的，所述干细胞制剂的剂型为注射制剂；
所述干细胞制剂的注射剂量优选为3～8ml/次，更优选为5ml/次。
本发明还提供了上述干细胞制剂的制备方法，将脂肪间充质干细胞、富含血小板血浆、表皮生长因子和溶媒混合均匀，得到所述干细胞制剂。
本发明还提供了上述干细胞制剂或上述制备方法在制备修复糖尿病足溃疡的药物中的应用。
下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
以下实施例中所使用的富含血小板血浆(prp)制备套装购自浙江保尔曼生物科技有限公司，溶媒来源于广州赛莱拉化妆品科技有限公司，654-2是从茄科植物唐古特山莨菪anisodustanguticus(maxim)pascher的根和种子种分离的一种颠茄生物碱，654-2注射液购自国药集团容生制药有限公司。
实施例1
1、配方
第三代脂肪间充质干细胞1×105个/ml；
富含血小板血浆(prp)5vol％；
表皮生长因子(egf)5ng/ml；
溶媒补足。
2、制备
(1)收集取p3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，再1500rpm离心5min，弃上清，用4℃pbs洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞密度至107个/ml。
(2)用prp制备套装制备prp。
(3)在50ml规格的离心管中，按配方比例先后加入prp、egf、溶媒和步骤(1)中制备的p3代脂肪间充质干细胞，充分搅拌混匀。
实施例2
1、配方
第四代脂肪间充质干细胞5×105个/ml；
富含血小板血浆(prp)5vol％；
表皮生长因子(egf)5ng/ml；
溶媒补足。
2、制备
(1)收集取p3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，再1500rpm离心5min，弃上清，用4℃pbs洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞密度至107个/ml。
(2)用prp制备套装制备prp。
(3)在50ml规格的离心管中，按配方比例先后加入prp、egf、溶媒和步骤(1)中制备的p3代脂肪间充质干细胞，充分搅拌混匀。
实施例3
1、配方
第五代脂肪间充质干细胞1×106个/ml；
富含血小板血浆(prp)5vol％；
表皮生长因子(egf)5ng/ml；
溶媒补足。
2、制备
(1)收集取p3代脂肪间充质干细胞，吸去培养基，加入消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液，再1500rpm离心5min，弃上清，用4℃pbs洗涤细胞3次后重悬混匀，调整细胞密度至107个/ml。
(2)用prp制备套装制备prp。
(3)在50ml规格的离心管中，按配方比例先后加入prp、egf、溶媒和步骤(1)中制备的p3代脂肪间充质干细胞，充分搅拌混匀。
实施例4
对实施例1至实施例3中得到的干细胞制剂进行微生物检测和内毒素检测检测。其中，微生物检测(细菌、真菌)根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1100进行检测；内毒素检测根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1143进行检测。
检测结果发现实施例1-3制得的生物制剂在细菌、真菌和内毒素的检测中，均呈阴性，说明了该干细胞制剂的质量合格，可用于创口的修复。
实施例5
随机选取80例病程为7-20年的糖尿病患者，其中，男37例，女43例，均由各种原因导致糖尿病足。将患者随机分为4组，其中一组为对照组，其余3组为实验组。对照组采用由庆大霉素8-16万u、胰岛素4-8u、654-2注射液10mg和生理盐水组成的混合液进行涡流式冲洗创面，之后用无菌棉球擦干，盖以无菌纱布，每日一次，持续4周。其余3组实验组在应用一般治疗方案的同时，分别静脉注射实施例3-5的干细胞制剂，每7天注射一次，每次5ml，持续4周。
表1为患者的预后情况，对照组和3组实验组均呈现不同程度的好转，其中实验组的痊愈人数和显效人数均高于对照组，说明本发明所提供的干细胞制剂能有效促进糖尿病足患者溃疡创面的愈合。
以下为评估指标：
痊愈：4周内新生肉芽组织全部长全，创面完全愈合；
显效：4周内创面缩小75％，新生肉芽组织大部分长出，无炎性渗出液；
好转：4周内创面缩小，新生肉芽组织部分长出，炎性渗出液较少；
无效：4周内无创面缩小，无新生肉芽组织，炎性渗出液较多。
表1
p<0.05。