一种矮地茶醇提物的制备方法及其应用与流程

本发明属于中医中药技术领域，尤其涉及一种矮地茶醇提物的制备方法及其应用。

背景技术：

肥胖(obesity，ob)是一种以体内脂肪细胞(adipocyte,ad)的数目和体积增加导致体脂占体重百分比异常增高并伴有局部脂肪组织过多沉积为特点的慢性代谢性疾病。近年来，随着社会经济水平的提高，肥胖正以惊人的速度在全世界的成人和青少年儿童中蔓延，特别是肥胖发生的低龄化趋势尤为突出。肥胖不仅降低患者的生活质量，而且是糖尿病、冠心病、动脉粥样硬化、高血压、高脂血症以及肿瘤等多种疾病的共同危险因素。肥胖对人体健康的影响已成为全球性的公共卫生问题，因此探索崭新而有效的治疗手段具有重要的临床意义和社会价值。现代医学研究认为，肥胖的发生是饮食、遗传和环境等多种因素综合作用的结果，其关键环节在于脂肪细胞的过度分化。脂肪细胞来源于中胚层的骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,bmscs)。bmscs是一种具有多向分化潜能的干细胞，其向脂肪细胞分化是高度有序的过程，受到多种转录因子和复杂信号通路的调控。一旦脂肪细胞生成的生理过程被打乱，脂肪细胞过度分化，将会引起肥胖及与之相关的糖、脂代谢紊乱和多种内分泌紊乱，进而诱发糖尿病、动脉粥样硬化、高脂血症等疾病的发生发展。因此，从脂肪细胞分化及调控的视角，寻找有效防治肥胖的药物并揭示其作用机理、探索肥胖防治的新靶标是营养代谢性疾病研究领域极其重要的研究方向。肥胖自古有之，中医文献对肥胖的记载始于《黄帝内经》。《灵枢·卫气失常》将肥胖分为“脂人”、“膏人”、“肉人”三种类型，记载“人有脂、有膏、有肉。……腘肉坚，皮满者，肥。腘肉不坚，皮缓者，膏。皮肉不相离者，肉。……膏者，多气而皮纵缓，故能纵腹垂腴。肉者，身体容大。脂者，其身收小。”《黄帝内经》认为肥胖发生的主要原因与饮食不节、禀赋异常、过度安逸和情志失调有关。《素问·通评虚实论》指出：“肥贵人，则膏粱之疾也。”《素问·奇病论》中有“喜食甘美而多肥”的记载。中医认为肥胖的病机总属阳气虚衰、痰湿偏盛。《石室秘录》概言之：“肥人多痰，乃气虚也，虚则气不能运化，故痰生之”。脾虚则运化转输无力，水谷精微失于疏布，化为膏脂痰湿，留滞体内而致肥胖；肾阳虚衰血液鼓动无力，水液失于蒸腾气化，导致血行迟缓，痰湿内停而成肥胖。因此，中医学治疗肥胖多采用祛痰化浊、活血祛瘀之法。

苗药矮地茶，始载于宋《图经本草》，为紫金牛科植物紫金牛的干燥全草，产于长江流域以南的各个省区，为南方地区的民间草药。矮地茶的野生资源十分丰富，其良好的药用价值越来越受到人们的关注。2015版《中国药典》中记载矮地茶药用资源的主要质控成分是岩白菜素。目前制备矮地茶药材提取物的研究大多采用高效液相色谱法(hplc)，但该方法在药材分析方面存在着样品用量大，分析耗时长等不足。相比较hplc，近年来兴起的超高效液相色谱法(uhplc)法具有分析速度快，分离效果好，灵敏度高、节省分析样品等优点。然而目前尚未见到使用uhplc法制备矮地茶醇提物及对其进行质控分析的研究报道。因此我们在研究中尝试采用uhplc法制备了矮地茶醇提物并分析其中岩白菜素的含量。结果发现按照uhplc法制备的矮地茶醇提物中岩白菜素的含量为9.88mg/g，符合药典中规定的作为质控的岩白菜素的含量标准。

在矮地茶药用资源的功效方面，《中国药典》中记载矮地茶具有化痰止咳，清利湿热，活血化瘀之功效，目前关于矮地茶的临床应用和药理作用研究也多集中在止咳平喘、抗炎抗病毒、湿热黄疸、经闭瘀阻、风湿痹痛、跌打损伤等作用方面。然而关于矮地茶是否具有肥胖防治作用的研究未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种矮地茶醇提物的制备方法及其应用。

本发明的目的之一在于提供一种矮地茶醇提物的新的制备方法，该目的的实现包括以下步骤：

步骤一，矮地茶醇提物的制备：矮地茶药材低温干燥粉碎后，精密称定0.1g，加入0.1ml甲醇，涡旋震荡60min后，于功率200w、频率40khz条件下超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液保存备用；

步骤二，岩白菜素对照品的制备：精密称定岩白菜素对照品适量，加入甲醇配制成每ml含50μg岩白菜素(即50μg/ml)的储存溶液，备用；

步骤三，含量测定：采用超高效液相色谱法(uhplc)进行含量测定，c18色谱柱(1.7μm，2.1×100mm)以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以c18(5μm，2.1mm×12.5mm)为保护柱，乙腈-甲酸水为流动相梯度洗脱；流速0.3ml/min；柱温30±5℃。吸取对照品溶液和矮地茶醇提物溶液各2μl，进样注入液相色谱仪进行测定；检测波长：280nm。

本发明的另一目的在于利用所述矮地茶醇提物干预诱导成脂分化的st-2和c3h10细胞，评价矮地茶醇提物对脂肪细胞形成和分化的影响及其效果，所述脂肪细胞形成及分化模型为：以小鼠骨髓间充质干细胞系st-2和c3h10为对象；使用含成脂分化诱导试剂(包含5μg/ml胰岛素、50μm吲哚美辛、0.5μm地塞米松、0.25mm3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)的α-mem培养基分别干预st-2和c3h10细胞诱导其向脂肪细胞分化，而后分别使用2.5mg/ml和5mg/ml的矮地茶醇提物干预诱导成脂分化的st-2和c3h10细胞，于诱导分化第3天提取细胞总rna，qpcr检测成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表达，第5天行油红o染色检测细胞内脂滴形成情况，评价矮地茶醇提物对脂肪细胞形成及分化的影响。

本发明的另一目的在于利用所述矮地茶醇提物干预高脂饲料喂养的肥胖模型小鼠，评价矮地茶醇提物对模型小鼠体重的影响。所述肥胖模型小鼠的制备过程为：选用4周龄的c57bl/6小鼠作为对象，小鼠适应性喂养1周后，给予高脂饲料喂养。矮地茶醇提物干预模型小鼠的实验流程为：实验分为4组，(1)正常饲料组：给予正常饲料喂养；(2)高脂饲料组，给予高脂饲料喂养；(3)矮地茶低剂量组：高脂饲料喂养，给予含1g/kg体重原药材的矮地茶醇提物干预；(4)矮地茶高剂量组：高脂饲料喂养，给予含2g/kg体重原药材的矮地茶醇提物干预。每组8只c57bl/6小鼠，干预周期为3个月，每个月检测各组小鼠体重，评价矮地茶醇提物对模型小鼠体重的作用效果。

本发明的优点及积极效果为：建立了矮地茶醇提物的uhplc提取方法，并对药典规定的矮地茶的质控成分岩白菜素的含量进行了测定分析，结果如图1所示。经色谱分析测得，制备的矮地茶醇提物中岩白菜素的含量为9.88mg/g，与药典中hplc方法比较，符合质量标准。矮地茶对诱导成脂分化的st-2和c3h10细胞中脂滴形成的影响，结果如图2(a)和2(b)所示，与对照组(vehicle组)比较，成脂诱导分化组(aim组)的脂滴明显增多；与成脂诱导分化组(aim)组相比，2.5mg/ml和5mg/ml矮地茶组，脂滴数目均明显减少，其中以5mg/ml矮地茶组作用最为显著。矮地茶对诱导成脂分化的st-2和c3h10细胞中成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2mrna表达的影响，结果如图3(a)和3(b)所示，与对照组(vehicle组)比较，成脂诱导分化组(aim)组pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表达水平明显增加；与成脂诱导分化组(aim)组比较，2.5mg/ml和5mg/ml矮地茶组pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表达水平明显降低，其中以5mg/ml矮地茶组抑制效果最为显著。低剂量(1g/kg)和高剂量(2g/kg)矮地茶干预治疗均可有效降低高脂饲料喂养的c57bl/6小鼠体重，其中2g/kg矮地茶干预治疗效果更为显著。

附图说明

图1是本发明实施例提供的矮地茶醇提物的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的uhplc法制备的矮地茶醇提物的色谱分析示意图；

图中：(a)矮地茶样品色谱图；(b)岩白菜素对照品色谱图。

图3是本发明实施例提供的矮地茶抑制诱导成脂分化的st-2和c3h10细胞中的脂滴形成示意图；

图中：a：st-2油红o染色结果；b：c3h10油红o染色结果。

图4是本发明实施例提供的矮地茶醇提物抑制成脂表征基因的mrna表达示意图；

图中：*，p＜0.05，与对照组(vehicle组)比较差异有统计学意义；#，p＜0.05，与成脂诱导分化组(aim)组比较差异有统计学意义。

图5是本发明实施例提供的矮地茶醇提物对高脂饲料喂养小鼠体重影响的示意图；

图中：*，p＜0.05，与同月龄正常饲料组比较差异有统计学意义；#，p＜0.05，与同月龄高脂饲料组比较差异有统计学意义。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的矮地茶醇提物的制备方法包括以下步骤：

s101：矮地茶醇提物的制备：矮地茶药材低温干燥粉碎后，精密称定0.1g，加入0.1ml甲醇，涡旋震荡60min后，于功率200w、频率40khz条件下超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液保存备用；

s102：岩白菜素对照品的制备：精密称定岩白菜素对照品适量，加入甲醇配制成每ml含50μg岩白菜素(即50μg/ml)的储存溶液，备用；

s103：含量测定：采用超高效液相色谱法(uhplc)进行含量测定，c18色谱柱(1.7μm,2.1×100mm)以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以c18(5μm,2.1mm×12.5mm)为保护柱，乙腈-甲酸水为流动相梯度洗脱；流速0.3ml/min；柱温30±5℃。吸取对照品溶液和矮地茶醇提物溶液各2μl，进样注入液相色谱仪进行测定；检测波长：280nm。

本发明实施例提供的矮地茶醇提物对脂肪细胞形成及分化的影响及效果评价

以小鼠骨髓间充质干细胞系st-2和c3h10为研究对象，开展以下实验。使用含成脂分化诱导试剂(包含5μg/ml胰岛素，50μm吲哚美辛，0.5μm地塞米松，0.25mm3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)的培养基干预st-2、c3h10细胞诱导细胞向脂肪细胞分化。分别使用2.5mg/ml和5mg/ml的矮地茶醇提物干预诱导成脂分化的st-2和c3h10细胞，于诱导分化的第3天提取细胞总rna，qpcr检测成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2mrna的表达，第5天行油红o染色检测细胞内脂滴形成情况，评价矮地茶醇提物对脂肪细胞形成及分化的影响。

本发明实施例提供的矮地茶醇提物对肥胖小鼠体重的影响及效果评价

选用4周龄的c57bl/6小鼠作为研究对象开展体内实验研究，实验周期为3个月。小鼠及饲料购自北京华富康生物科技股份有限公司。小鼠适应性喂养1周后，将实验动物分组，每组8只，分组如下：(1)正常饲料组：给予正常饲料喂养；(2)高脂饲料组，给予高脂饲料喂养；(3)矮地茶低剂量组：高脂饲料喂养，给予含1g/kg体重原药材的矮地茶醇提物干预；(4)矮地茶高剂量组：高脂饲料喂养，给予含2g/kg体重原药材的矮地茶醇提物干预。干预周期为3个月，每个月检测各组小鼠体重，评价矮地茶醇提物对肥胖小鼠体重的影响及效果。

下面结合附图对本发明的应用效果作详细的描述。

(1)建立了矮地茶醇提物的uhplc提取方法，并对药典规定的矮地茶的质控成分岩白菜素的含量进行了测定分析，结果如图2(a)、图2(b)所示。经色谱分析测得，按照上述方法制备的矮地茶醇提物中岩白菜素的含量为9.88mg/g，与药典中hplc方法比较，符合质量标准。采用uhplc法制备的矮地茶醇提物为评价矮地茶药材质量及药物的功能研究提供了技术支撑。

(2)矮地茶醇提物对脂肪细胞分化的影响

1)矮地茶对诱导成脂分化的st-2和c3h10细胞中脂滴形成的影响

结果如图3(a)和3(b)所示，与对照组(vehicle组)比较，成脂诱导分化组(aim)脂滴明显增多；与成脂诱导分化组(aim)相比，2.5mg/ml和5mg/ml矮地茶组，脂滴数目均明显减少，其中以5mg/ml矮地茶组作用最为显著。

2)矮地茶对诱导成脂分化的st-2和c3h10细胞中成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2mrna表达的影响

结果如图4(a)和4(b)所示，与对照组(vehicle组)比较，成脂诱导分化组(aim)pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表达水平明显增加；与成脂诱导分化组(aim)比较，2.5mg/ml和5mg/ml矮地茶组pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表达水平明显降低，其中以5mg/ml矮地茶组抑制效果最为显著。

(3)结果如图5所示，低剂量(1g/kg)和高剂量(2g/kg)矮地茶干预治疗均可有效降低高脂饲料喂养的c57bl/6小鼠体重，其中高剂量矮地茶干预治疗效果更为显著。

本发明基于中医理论认为肥胖的发生是由于水湿、痰癖、脂质等浊阴之邪增加所致，结合矮地茶的化痰止咳，清热利湿，活血化瘀之功效，考虑矮地茶可以开发为肥胖防治药物的潜力并有针对性地开展了矮地茶对脂肪细胞分化及肥胖防治作用的相关研究。结果发现：矮地茶醇提物能明显减少诱导成脂分化的小鼠骨髓间充质干细胞系st-2和c3h10t1/2细胞中的脂滴数目和成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表达水平，其中以5mg/ml矮地茶组抑制效果最为显著；此外矮地茶干预治疗均可有效降低高脂饲料喂养的c57bl/6小鼠体重，其中2g/kg的矮地茶干预治疗效果更为显著。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。