一种治疗疟疾的联合用药物的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及花青素联合喹啉及其相关杂环类化合物，用于制备抗疟疾药物中的应用。

背景技术：

疟疾是致命性最强的寄生虫感染类疾病，全球每年约2.5亿人感染疟疾，主要集中在非洲、东南亚和东地中海地区。疟疾是由四种原生寄生虫(疟原虫属)引起的，即镰状疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫，但四者在地理分布、微观形态、临床表现和耐药选择性等方面各不相同。媒介控制和化学治疗是目前预防和治疗疟疾的主要手段，前者可通过中断疟原虫生命周期及隔离宿主与蚊虫的接触来实现，后者包括杀灭无性寄生虫以及对宿主采用支持疗法以增强其免疫力。随着抗疟药耐药性的逐年增加，目前能有效治疗疟疾的安全药物较少，故研发更具特点的新型抗疟药迫在眉睫。

喹啉环结构骨架广泛存在于天然产物及合成药物中，这类化合物包括氯喹、奎宁、阿莫地喹、哌喹、伯氨喹和甲氟喹等及其结构类似物(4-氨基喹啉、4-苯胺基喹啉、8-氨基喹啉、喹诺酮、异喹啉和四氢喹啉、环修饰物等)。喹啉类抗疟药大多作用于寄生虫生命周期中红内期，也有部分作用于肝内期。研究发现，这类药物能够抑制血红素的聚合，并阻止血红素聚合物从食物泡转移到细胞质(为疟原虫色素形成所必需)的处置过程，由此导致对寄生虫具有剧毒作用的游离血红素在寄生虫体内累积，进而杀灭之。

临床表明，恶性疟原虫几乎对所有抗疟药都能产生抗药性，其中包括氯喹、奎宁等，伯安喹的抗药虫株较少见，但who报道近年来已有增多倾向。一些专门用于抗氯喹疟疾的新药，如哌喹、甲氟喹等在实验诱导下，均可引起抗药虫株产生。

花青素(anthocyanin)，又称花色素、花色苷，属于生物类黄酮物质，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素。花青素存在于各种绿色植物的花、果实等各种组织的细胞液中，广泛分布于27个科，72个属的植物中。目前为止，已知的花青素可分为22大类，最常用的为以下六类:天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素。研究证实，花青素具有抗氧化、抗炎作用，抑菌作用，抗衰老、抗癌作用以及对肝脏，对心脑血管和视力的保护作用等生理活性。花青素在体内、外都能清除多种氧自由基，包括超氧阴离子、羟自由基。花青素为多粗酷提取物，独特的苯环分子结构决定了其特殊的药理学活性,花青素具有抑制磷酸化并阻断nf-κb、jnk和erk等信号传导的生物学活性。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种用于治疗疟疾药物中的联合用药物,所述联合用药物含有第一活性成分花青素和第二活性成分喹啉类化合物。

本发明联合用药物可以不同形式存在，例如游离酸、游离碱、酯和其它前药、盐和互变异构体，例如，本申请包括所述联合用药物的所有变体形式。

本发明的目的是提供一种含有第一活性成分花青素和第二活性成分喹啉类化合物的联合用药物在制备抗疟疾药物中的应用。

本发明的另一目的是提供以含有第一活性成分花青素和第二活性成分喹啉类化合物作为活性成分，用于制备治疗或预防疟疾的药物组合物。

上述的药物组合物，其组成含有治疗有效量的第一活性成分花青素和第二活性成分喹啉及其相关杂环类化合物，所述的第一活性成分和第二活性成分在联合用药物当中可以是单独使用，也可以与其他药物配合使用。其中所述药物组合物的单剂量含第一活性成分和第二活性成分在药物组合物中的有效含量为1-95％。本发明的联合用药物中的活性成分的实际剂量水平可以进行改变从而获得能够对于具体患者、组合物以及给药模式而言有效达到需要的治疗响应的一定量的活性化合物。选定的剂量水平取决于具体化合物的活性、给药途径、待治疗疾病的严重程度以及待治疗患者的情况和前病史。然而，本领域的技术人员可以从较低的剂量开始给药，该剂量低于达到理想治疗效果所需要的剂量，然后逐渐增加剂量直到获得理想疗效。

上述的联合用药物除了包含治疗有效量的第一活性成分和第二活性成分之外，还包含药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等；填充剂如淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇等；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、聚乙二醇等，另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

上述联合用药物是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒剂、口服液和注射剂。

本发明联合用药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，然后将其制成所需的剂型。

本发明联合用药物可以用于治疗疟疾,术语“治疗”包括改善疟疾的一或多种症状的治疗，或者延缓此类疾病进程的治疗，例如预防或延缓疟原虫的感染，减少疟原虫增殖数量等；它也包括治愈此类疾病的治疗，使得患者进入正常功能状态和/或将患者维持在正常功能状态或者延长复发时间。

因此花青素联合喹啉及其相关杂环类化合物可开发为预防或治疗疟疾的药物，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是氯化花青素和磷酸氯喹联合用药体外抗疟活性测定

图1中1组为花青素(浓度分别为0.5,1,2μg/ml)，2组为氯喹组(浓度分别为0.01,0.1,1μg/ml)，3组为联合用药组(其中氯化花青素浓度为1.03μg/ml，氯喹0.1μg/ml)，*p<0.05**p<0.01。

图2是氯化花青素和磷酸氯喹联合用药体内抗疟活性测定

图2中a为模型组，b为氯化花青素组，c氯喹组，d为联合用药组。

图3是氯化花青素和磷酸氯喹联合用药对小鼠生存率的影响

图3中a为模型组，b为氯化花青素组，c氯喹组，d为联合用药组。

具体实施方式

本发明公开了一种花青素联合喹啉及其相关杂环类化合物或其盐和药学上可以接受的载体，用于制备抗疟疾药物中的应用，下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1氯化花青素和磷酸氯喹联合用药体外相互作用实验

实验材料：氯化花青素(购自上海力鼎生物)；氯喹(购自中国食品药品检定研究所)；rpmi1640培养基(购自gibco公司)；庆大霉素(购自sigma公司)；细胞裂解液(购自sigma公司)；10000xsybrgreeni试剂(购自invitrogen公司)

实验步骤：抗疟活性可以通过测量疟原虫dsdna含量来确定(corey,v.c.,etal.,abroadanalysisofresistancedevelopmentinthemalariaparasite.natcommun,2016.7:p.11901.)。在含20μl连续稀释测试样本和氯喹的96孔板的每个孔中加入感染了3d7虫株说明书2/3页4cn106727493a4p.falciparum的红细胞混悬液(100μl，在rpmi1640培养基中加入5g/lalbumax(gibco)和50mg/l庆大霉素，使疟原虫血症达到0.5％，红细胞压积达到2％)，然后置于37℃，5％co2培养箱培养48小时。细胞用裂解液(tris2.4g/l,edta1.86g/l,saponin0.08g/l,tritonx-1000.8ml/l)进行裂解，dsdna含量用10000xsybrgreeni试剂测定，测定程序参照文献(plouffe,d.,etal.,insilicoactivityprofilingrevealsthemechanismofactionofantimalarialsdiscoveredinahigh-throughputscreen.procnatlacadsciusa,2008.105(26):p.9059-64.)。即将100μl培育的混合物和按文献说明配制好100μlsybrgreeni试剂混合，在室温下避光培育30-60min.然后转移至黑色酶标板中。将酶标板放入enspire荧光酶标仪(perkinelmer)中，在485nm和535nm的吸光值下读取酵标板中每孔的荧光信号值。从剂量-效应曲线中计算出ic50，氯化花青素、磷酸氯喹对3d7的ic50值如下：

实施例2氯化花青素和磷酸氯喹联合用药体内抗疟活性测定

实验动物：昆明小鼠(购于中山大学实验动物中心)，体重18-22g，鼠龄4-5周。

实验步骤及分组：

模型建立：从液氮罐中取出疟原虫anka冻存管1支(0.5ml)，42℃恒温水中水浴5s，再放入37℃恒温水箱中溶冻；完全解冻后,将疟原虫转移到离心管中,加入1ml的5％糖盐溶液，充分混匀。准备5只昆明鼠,分别腹腔注射0.5ml备好的疟原虫,继续适宜条件饲养。7d后,观察到小鼠出现活动量明显减少,呼吸稍急促,浑身颤栗,毛发竖立且不光滑,耳朵尾巴等处皮肤较正常时苍白,准备手术剪和玻片,对小鼠尾静脉取血涂片。涂好的玻片室温干燥后,再用纯甲醇固定,瞭干,用giemsa染液染色。

对小鼠进行输血感染，抽取小鼠心脏血液，用5％葡萄糖盐水将血液稀释成每0.2ml内含1×10⁷个受感染红细胞的悬液，腹腔接种小鼠。接种伯氏疟原虫3h后，随机分成4组后给药，另设正常组，每组8只。组别为：1、b(模型组)(灌胃给予生理盐水)，2、c(氯喹组)(灌胃给予15mg/kg)，3、d(花青素组)(灌胃给予25mg/kg)，4、e(联合用药组)(灌胃给予40mg/kg)。d0接种感染，d0～d3给药4次(首次给药为接种后3-4h)，每天给药1次，d4～d32每周取尾静脉血作薄血膜，姬氏染色后镜检，计算减虫率，并计算小鼠存活率。

实验结果：单用氯喹，观察32d的平均治愈率为59.6％，氯化花青素为63.8％，采用氯化花青素与磷酸氯喹联用为70.4％，说明氯化花青素与磷酸氯喹联用能更有效抑制疟原虫在小鼠体内生长，且减缓疟原虫的复燃。此外，单用氯喹，观察32d小鼠的平均存活率为54.8％，氯化花青素为61.7％，采用氯化花青素与磷酸氯喹联用为74.8％，说明氯化花青素与磷酸氯喹联用能延长小鼠的存活时间。

实施例3氯化花青素和磷酸氯喹联合用药小鼠急性毒性实验

实验动物：昆明小鼠(购于中山大学实验动物中心)，体重18-22g，鼠龄4-5周。

实验步骤及分组：参照《化学药物急性毒性试验技术指导原则》，根据最高剂量及最低剂量的公比系数(q＝0.77)设计中间剂量，剂量分别为2000mg/kg，1540mg/kg，1185.8mg/kg，913.6mg/kg，703.1mg/kg，541.4mg/kg，416.8mg/kg，320mg/kg，分别为给药组a,b,c,d,e,f,g,h，另设溶媒对照组(i组)。将昆明小鼠按性别及体质量分层随机分为9组，每组10只，雌雄各半，按上述剂量灌胃给药。立即观察并记录给药后6h内小鼠毒性反应和死亡情况，然后每天观察小鼠1次，包括外观、行为、对刺激的反应、分泌物及排泄物等，连续观察14d。记录动物毒性出现时间及恢复时间、死亡情况以及死亡分布时间，对死亡动物进行尸检，肉眼观察主要脏器的改变。在药后第1、4、7、14天分别称量存活小鼠体质量。统计各组小鼠死亡数，用bliss法计算半数致死量(ld50)。在药后第14天对所有实验小鼠进行解剖，肉眼观察主要脏器的改变；当器官出现体积、颜色、质地等改变时，进行组织病理学检查。

实验结果：用bliss法计算得出半数致死量(ld50)为907.1mg/kg。小鼠毒性随剂量增加而逐渐加重，320mg/kg剂量组仅见2只雌性小鼠自发活动减少；2000mg/kg剂量组小鼠可见抽搐，死亡等症状。且随着剂量的增加，症状持续时间逐渐延长。320mg/kg剂量组小鼠药后24h即恢复正常状态，2000mg/kg剂量组存活小鼠在药后168h恢复正常状态，表明随着联合剂量的增加，小鼠的毒性反应加剧且持续时间延长。

病理学检查：所有在给药观察期死亡及观察期结束时处死的小鼠，大体解剖肉眼观察其体表完整、被毛柔顺、无外伤及破溃等；皮下无出血点及色素沉着等；腹腔、胸腔无积液；各组织器官的体积、颜色及质地等均无明显病变及异常。

体质量变化：各组小鼠体质量增长变化趋势相似，但给药组小鼠体质量低于溶媒对照组，表明氯化花青素和磷酸氯喹联用对小鼠体质量增长有明显抑制作用，剂量越高，抑制作用越明显。各剂量组雄性小鼠体质量在药后第1、第4天均明显低于溶媒对照组(p<0.01)。

综上所述，通过实施例1-3的实验结果表明，花青素联合喹啉及其相关杂环类化合物对小鼠无副作用，安全性高。联合用药物的体内外抗疟活性测定实验表明其具有协同增效的作用，能延长疟疾小鼠的存活时间，临床应用前景良好。