芦荟素在提高骨髓间充质干细胞成骨能力中的应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域。更具体地，涉及芦荟素在提高骨髓间充质干细胞成骨能力中的应用。

背景技术：

骨质疏松症是以低骨量和骨组织微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病，导致骨脆性增加和骨折风险增加。骨质疏松的主要原因是骨形成和骨吸收平衡被破坏。通常，临床防治骨质疏松有两种方法。抗骨吸收药物，如双膦酸盐类药物被广泛用于骨质疏松症的治疗，主要因为其具有减缓骨吸收的功能；另一种方法是使用类固醇药物，包括人甲状旁腺激素(hpth1-34)，用来刺激骨形成。然而，长期使用这些药物有一定的局限性和副作用。

间充质干细胞是具有多向分化潜能的基质细胞，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经元和成肌细胞分化的能力。骨髓间充质干细胞(bmsc)是组织再生的理想候选细胞，参与骨形成和骨吸收的调节。系列研究表明，骨质疏松症患者的bmsc与正常人相比具有较低的成骨分化能力。据报道，老年性骨质疏松bmsc的成骨分化能力下降，与整合素α2的下调有关。过表达整合素α2通过激活erk1/2信号通路促进hbmscs成骨分化。因此，提高bmsc成骨能力被认为是治疗骨质疏松性疾病的一种可行的方法。

芦荟素(aloin)，化学名10-吡喃葡萄糖基-1，8-二羟基-3-(羟甲基)-9(10h)-蒽酮，活性成分以芦荟苷为主的混合物，是一种从双子叶植物芦荟中提取的蒽醌类化合物。研究表明，芦荟素能够有效抗肿瘤、抗炎、抗溃疡性结肠炎和抗氧化过程。然而，芦荟素对bmsc成骨分化的影响还不清楚。

runx2是调节成骨细胞分化和骨形成的关键基因之一。它在bmsc向成骨细胞分化过程中起重要作用。以往研究表明，erk1/2-runx2信号通路在调控mscs向成骨细胞分化中起着重要的作用。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术中防治骨质疏松性疾病存在的缺陷和不足，提供芦荟素在提高骨髓间充质干细胞成骨能力中的应用，所述芦荟素通过芦荟素通过激活erk1/2-runx2信号通路促进bmscs向成骨细胞分化，为研发防治骨质疏松新药提供了数据支持，具有较大的应用前景。

本发明的目的是提供芦荟素在促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的应用。

本发明的另一目的是提供一种促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的目的是探讨芦荟素对bmsc向成骨细胞分化的影响及其机制。经不同浓度芦荟素处理后，利用celltiter96aqueousonesolutioncellproliferationassay试剂盒检测细胞存活率；采用碱性磷酸酶活性和矿化实验评估芦荟素对bmsc向成骨细胞分化的影响；实时荧光定量pcr检测成骨相关基因(runx2、alp、ocn和opn)表达和western印迹法和免疫荧光法检测erk1/2-runx2信号通路变化。

结果显示，不同浓度的芦荟素对bmsc的存活率无明显影响。在成骨诱导条件下，芦荟素可增加细胞的碱性磷酸酶活性活性，促进bmsc的矿化，上调成骨相关基因(runx2、alp、ocn和opn)的表达。此外，经erk1/2抑制剂pd98059处理后，runx2表达明显下调，同时bmsc成骨分化受到显著抑制；结果表明，芦荟素通过激活erk1/2-runx2信号通路促进bmscs向成骨细胞分化，为研发防治骨质疏松新药提供数据支持。

因此，本发明首先保护芦荟素在促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的应用；即保护芦荟素在提高髓间充质干细胞成骨能力中的应用。

同时，本发明提供一种促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方法，所述方法为在成骨诱导条件下，用芦荟素处理骨髓间充质干细胞；所述成骨诱导条件为利用商业化成骨诱导培养基培养细胞。

另外，芦荟素在制备促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的制剂中的应用亦在本发明保护范围内。

一种促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的制剂，所述制剂含有芦荟素。

芦荟素可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，提高bmsc成骨能力，可作为防治骨质疏松性疾病的一种可行的方法。

因此，芦荟素在制备防治骨质疏松性疾病药物中的应用也本发明保护范围内。

一种防治骨质疏松性疾病药物，所述药物含有芦荟素；其原理是通过芦荟素促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，提高bmsc成骨能力。

本发明研究发现芦荟素是通过激活erk1/2-runx2信号通路促进bmscs向成骨细胞分化。

因此，芦荟素在激活erk1/2-runx2信号通路中的应用和/或在制备激活erk1/2-runx2信号通路的制剂中的应用。

一种erk1/2-runx2信号通路激活剂，所述激活剂含有芦荟素。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明研究发现，不同浓度的芦荟素对骨髓间充质干细胞的存活率无明显影响。在成骨诱导条件下，芦荟素可增加细胞的碱性磷酸酶活性，促进bmsc的矿化，上调成骨相关基因的表达。此外，经erk1/2抑制剂pd98059处理后，runx2表达明显下调，同时bmsc成骨分化受到显著抑制。结果表明，芦荟素通过激活erk1/2-runx2信号通路促进bmscs向成骨细胞分化；本发明的研究结果为研发防治骨质疏松新药提供数据支持，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明所使用的分离提纯的p3代人和大鼠骨髓间充质干细胞表形鉴定及成骨分化能力鉴定图；

图2为本发明采用mts方法评价不同浓度芦荟素处理不同时间对人和大鼠骨髓间充质干细胞细胞活力影响的柱状统计分析图；

图3为本发明利用不同浓度芦荟素处理人和大鼠骨髓间充质干细胞后，采用茜素红染色、alp活力检测试剂盒、实时荧光定量pcr分别对间充质干细胞成骨分化能力、alp活力及成骨相关基因(runx2、alp、ocn和opn)mrna表达水平测定分析图；

图4为本发明利用不同浓度芦荟素处理人和大鼠骨髓间充质干细胞后，采用westernblot检测调控成骨分化信号通路(erk1/2-runx2)相关蛋白(perk1/2、erk1/2、runx2)表达水平变化分析图；

图5为本发明在成骨诱导条件下，添加芦荟素和/或erk1/2抑制剂pd98059后，人和大鼠骨髓间充质干细胞成骨相关基因(runx2、alp、ocn和opn)mrna表达水平、runx2蛋白在核内表达水平以及钙沉积形成变化分析图；

图6为本发明芦荟素通过激活erk1/2-runx2信号通路促进bmscs向成骨细胞分化的机制图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1原代分离、培养、鉴定人和大鼠骨髓间充质干细胞

1、经广东医科大学附属医院医学伦理委员会批准，在患者知情同意情况下，在行髋关节置换术患者股骨近端部位无菌采取骨髓10ml，利用ficoll-histopaque(d＝1.077g/ml)分离单核细胞，采用低糖dmem培养基(含10％胎牛血清和1％psn)重悬细胞，在37℃、5％co2细胞培养箱中传代培养；取健康4周龄大鼠股骨和胫骨，利用注射器吸取无菌生理盐水反复冲洗骨髓腔，对冲洗出的骨髓进行间充质干细胞分离，分离及传代培养方法同人骨髓间充质干细胞。

2、间充质干细胞表型鉴定：取p3代间充质干细胞，采用流式细胞术，利用大鼠cd29、cd31、cd45、cd90特异性抗体对大鼠骨髓间充质干细胞进行表型鉴定，利用bd公司人间充质干细胞鉴定试剂盒(含cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr、cd73、cd90和cd105共8种抗体)对人骨髓间充质干细胞进行表型鉴定。结果显示超过95％的大鼠骨髓间充质干细胞对cd29和cd90呈阳性，对cd31和cd45呈阴性；人骨髓间充质干细胞对cd73、cd90和cd105表现强阳性，超过99.9％的细胞对cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr表现阴性。结果表明分离的大鼠和人骨髓间充质干细胞具有显著间充质干细胞表型特征，纯度较高(见图1a)。

3、间充质干细胞多向分化能力鉴定：取p3代间充质干细胞，利用诱导培养基对间充质干细胞分别进行成骨和成脂诱导分化14天后，进行茜素红或油红o染色，根据染色程度评估间充质干细胞多向分化能力。结果显示，经成骨诱导后，大鼠和人间充质干细胞均有明显钙沉积现象，而经成脂分化诱导后，细胞内有明显脂滴形成(见图1b)。结果证明分离的大鼠和人骨髓间充质干细胞有较强的多向分化能力，可以用来进行下一步实验。

实施例2不同浓度芦荟素处理对间充质干细胞活力的影响

在96孔细胞培养板中接种间充质干细胞(每孔2000个细胞)，待细胞完全贴壁后，分别用0、10、20、50μm芦荟素处理细胞24、48、72h。采用celltiter96aqueousonesolutioncellproliferationassay试剂盒鉴定细胞活力，利用分光光度计检测570nm波长范围的吸光度值。实验重复3次，利用graphpad软件进行统计分析。结果显示，与对照组相比，10、20、50μm芦荟素对细胞活力无显著影响，暗示低浓度的芦荟素对人和大鼠骨髓间充质干细胞无明显毒性作用(见图2)。

实施例3芦荟素促进人和大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

1、为评估芦荟素对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响作用，在成骨诱导条件下(利用商业化成骨诱导培养基培养细胞)，添加不同浓度芦荟素(0、10、50μm)培养14d，进行茜素红染色。结果显示，经芦荟素处理的细胞较对照组产生更多的矿化结节(见图3a)。为进一步鉴定芦荟素对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，在成骨诱导培养条件下，添加不同浓度芦荟素(0、10、50μm)培养3d，收集细胞，采用预冷的pbs漂洗细胞3次，用10mmtris–hcl(ph7.4)缓冲液(含0.1％tritonx-100)透化细胞，1,000g、4℃条件下离心10min，利用alp检测试剂盒检测细胞alp活性，分光光度计检测520nm波长范围的吸光度值。实验重复3次，利用graphpad软件进行统计分析。结果显示，与对照组相比，芦荟素呈浓度依赖性上调细胞内alp活性(见图3b)。

2、在成骨诱导培养条件下，添加不同浓度芦荟素(0、10、50μm)培养7d，收集细胞，利用trizol分离提纯细胞总rna，取1μg总rna利用primescriptrtenzyme试剂盒进行反转录，采用自行设计的引物进行实时荧光定量pcr(表1)，反应条件为：95℃预热30s，而后进行循环反应，95℃变性反应5s，60℃退火、延长反应20s，共设置40个反应循环。采用2^–δδct法对基因表达水平进行相对定量分析，gapdh作为内参。结果显示，与对照组相比，10、50μm芦荟素明显上调细胞alp、runx2、ocn和opnmrna表达水平(见图3c)。

表1大鼠和人成骨相关基因引物序列(alp、runx2、ocn、opn)

实施例4芦荟素通过erk1/2-runx2信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化1、在成骨诱导培养条件下，用不同浓度芦荟素(0、10、50μm)处理骨髓间充质干细胞14d，收集细胞，利用ripa缓冲液裂解细胞后，12,000g离心15min去除细胞碎片，采用bcaproteinassaykit试剂盒测量蛋白浓度。取约20μg蛋白进行凝胶电泳，随后将蛋白转至pvdf膜，脱脂牛奶封闭后，4℃条件下进行一抗(perk1/2、erk1/2、runx2和α-tubulin)过夜孵育，而后二抗孵育1h。采用pierceeclwesternblottingsubstrate试剂显影曝光。利用imagej软件对蛋白条带灰度值进行分析。结果显示，同对照组相比，芦荟素呈浓度依赖性上调骨髓间充质干细胞perk1/2和runx2蛋白表达水平(见图4)。该结果暗示在芦荟素刺激下，erk1/2活性可能参与runx2介导的骨髓间充质干细胞成骨分化进程。

2、为进一步明确erk1/2活性在芦荟素促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中是否起关键作用，我们采用erk1/2抑制剂pd98059(10μm)处理骨髓间充质干细胞，再进行成骨诱导分化，同时在实验组添加10μm芦荟素。培养7d后收集细胞，参照实施例3中方法进行实时荧光定量pcr反应。结果显示，经pd98059处理后，成骨相关基因(runx2、alp、ocn和opn)mrna表达水平显著下调(见图5a)。为了解经pd98059处理后，核内runx2蛋白表达水平变化，将骨髓间充质干细胞接种于载玻片，采用pd98059(10μm)处理骨髓间充质干细胞，再进行成骨诱导分化，同时在实验组添加10μm芦荟素。培养7d后用4％多聚甲醛固定细胞，随后透化和封闭细胞，runx2一抗过夜孵育，二抗孵育120min，加dapi后封片，最后在倒置荧光显微镜下观察、摄片。结果显示，经pd98059处理后，芦荟素介导的核内runx2表达水平明显下调。最后，为明确pd98059对芦荟素介导的骨髓间充质干细胞成骨分化作用的影响，将骨髓间充质干细胞接种于6孔细胞培养板，采用pd98059(10μm)处理骨髓间充质干细胞，再进行成骨诱导分化，同时在实验组添加10μm芦荟素。培养14d后行茜素红染色。结果显示，经pd98059处理后，芦荟素介导的骨髓间充质干细胞矿化结节明显减少。以上结果说明erk1/2活性在芦荟素促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中起关键作用。