本发明属于生物技术领域，涉及一种靶向血管内皮细胞防治心脑血管疾病的罗布麻茶复配功能饮料。
背景技术：
心脑血管疾病是威胁现代人群健康的首要原因，具有高致残率和复发率以及高死亡率的特点，世卫组织发布的信息显示，在过去十年世界十大死亡原因中，冠心病占12.9%、中风占11.4%，共计占死亡原因的24.3%；我国卫健委公布的数据也显示，心脑血管疾病导致的死亡在我国人群中高居首位，而且随着人民饮食结构的高脂肪化，人群脑血管病的危险因素仍呈显著上升趋势。
血管内皮细胞(vascularendothelialcell)是心脑血管疾病的核心靶点，从基础到临床均受到广泛研究和关注。相关病理学研究显示，微血管损伤通常表现为损伤部位内皮细胞坏死，进而导致微血管屏障功能障碍、毛细血管通透性增高、炎症反应、微循环血管痉挛和微血管灌注缺损等现象。内皮细胞作为血管损伤时代谢物质和血流动力学信号调节微循环的重要靶点，而受应激刺激的受损内皮细胞能释放多种血管活性物质，扩张血管，导致微循环障碍；同时释放凝血酶组织因子及炎症介质，作用于炎症细胞，产生炎性反应，并激活纤维蛋白原与血小板，形成血栓，产生严重后果。
血管内皮细胞损伤的具体分子机制，主要有一氧化氮(nitricoxide，no)损伤与活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ros)损伤两条通路。血管内皮的no含量不足导致机体受大量缩血管刺激时无法发挥舒血管效应，引起内皮细胞功能障碍和血管受损；但no过多也会产生严重ros损伤。enos作为no的上游调控因子，是血管壁中影响内皮细胞功能的重要靶点。辅助因子四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，bh4)是enos活性和功能的关键决定因子；bh4失活导致enos解离并不再催化l-精氨酸氧化和no合成，使生成的no减少，引起内皮细胞功能严重障碍；反之bh4水平上调则可有效促进enos偶联，改善及血管内皮细胞的生长增殖，增强血管损伤后血管内皮细胞和循环内皮祖细胞的修复能力。另外，在no的细胞信号转导过程中，no通常由s-硝基化蛋白介导氧化修饰形成s-亚硝基硫醇(s-nitrosothiol，sno)发挥化学信使作用，而辅酶a(coa)通过与一氧化氮结合形成sno-coa作为sno的内源性来源，使体内的no系统处于健康的动态平衡状态之中。
血管内皮细胞的ros来源于nadph氧化酶、线粒体呼吸链泄露和细胞色素氧化酶，这是互相补偿的三条ros信号通路，有着不同的细胞生理功能。正常情况下，机体内促氧化剂水平与抗氧化剂水平处在一种动态平衡之中，但ros的产生和存在有细胞区域性，有极性相和非极性相的重要区别，而ros的消除也有着代谢自由能驱动和反应本身自由能驱动两种模式，因此常导致ros局域失控等病理现象。ros的生物功能取决于胞内浓度，适度浓度的ros有信号传导作用，但是高浓度的ros作用于血管内皮细胞的基底膜，损伤机体抗氧化系统，降低超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽硫转移酶等抗氧化酶活性，过氧化其中的脂质使血管内皮细胞通透性增加，导致蛋白质通过屏障并异常沉积在基底膜中损伤血管内皮细胞的结构和功能。ros还可氧化关键的细胞信号如酪氨酸磷酸酶提高nf-κb活性，减少内皮硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的合成，破坏内皮细胞的糖蛋白，使基底膜增厚，引起内皮细胞功能障碍。同时，ros与no快速结合形成过氧亚硝酸盐等活性氮，后者比nox产生超氧化物速度快3～4倍，可诱导产生硝化应激增加ros的促炎症负荷，严重损伤血管内皮细胞。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nadph氧化酶，nox)通过nadph依赖的单电子还原将体内氧分子还原成超氧负离子，是体内唯一直接产生ros的酶，也是ros损伤血管内皮细胞的重要起因，因此是对抗ros损伤血管内皮细胞的核心靶点，因此需要寻找特异性和选择性nox的抑制剂，但目前nox抑制剂相关研究尚缺乏可靠的筛选体系，目前尚无安全有效的nox酶抑制剂类药物上市。
目前公布的缓解血管内皮细胞损伤的预防保健方案，普遍存在技术不完备等问题，例如申请号为201910015995.1等专利利用rna缓解血管内皮损伤，这导致给药方式方面存在困难；申请号为201811150537.0和201880008458.8等专利仅提出血管内皮细胞损伤的可能药物作用靶点，但尚无成熟有效的药物能够针对该靶点；申请号为201911011122.x等专利给出白藜芦醇等几种广受质疑的中药提取物，声称能防治血管内皮损伤，但作用机制和副作用不详。总之，目前尚无安全有效的针对血管内皮细胞这一核心靶点来预防和治疗心血管疾病的成熟方案。
技术实现要素：
罗布麻(学名：apocynumvenetuml.)是夹竹桃科罗布麻属的直立半灌木，广泛分布于我国北方地区，抗逆性极强，特别容易生长于沙漠边缘和盐碱干旱地等自然环境恶劣的区域。例如在新疆的一些田里，盐含量高达14.5%，青海柴达木盆地有些田地中土壤表层30厘米内含盐量甚至高达50%，罗布麻可以良好生长；在新疆北部阿勒泰地区，极端低温-47℃，地面积雪期130天，罗布麻也可自然生长，其株高可达70-120厘米；在吐鲁番盆地，夏季最高气温达47.8℃，地面温度达52℃以上，罗布麻仍然能生长良好。
罗布麻叶是《中华人民共和国药典》(2010版一部)收录的正品药材；《蒙植药志》记载罗布麻叶或全草治头晕，高血压，心悸等；维吾尔族《民族药志三》记载罗布麻叶用于头晕，心悸和高血压等；《西域水道记》和《西域风闻录》记载取罗布叶和花代茶饮已有千年之久，野生罗布麻茶倍受世代罗布人喜爱，并被誉为“神茶”。
本发明的前期实验研究表明，罗布麻茶是一种有效的nox抑制剂，而nox催化nadph产生超氧阴离子，后者被超氧化物歧化酶代谢为过氧化氢，再和细胞内铁离子产生芬顿反应，生成反应活性极强的羟自由基，产生脂质过氧化和dna受损等广泛ros损伤，而罗布麻茶能通过抑制心脑血管疾病中导致内皮功能紊乱的超氧阴离子的产生，来保护血管内皮细胞，预防相关疾病的发生。
然而单纯利用罗布麻茶来保护血管内皮细胞，存在效果弱而副作用强的问题。鉴于此，本发明通过大量前期研究和实验，发现罗布麻茶确实在一定浓度范围内可以抑制nox，进而降低血管内皮细胞ros浓度，但是存在细胞活力和细胞增殖能力降低等问题，这在细胞水平反应了罗布麻茶的作用效果和副作用。相关分析和实验验证显示，胞内ros可区分为生理浓度的第二信号性ros和超过生理浓度的损伤性ros，而nox容易在外界刺激下过度产生ros，超过生理浓度而形成了损伤性ros，因此不是良好的ros来源。并且罗布麻茶抑制nox减少了胞内ros水平，虽然减少了作为损伤原因的ros过量产生，但是也影响了ros的第二信使效果，对此本发明通过提高no通路活性来替代nox以制造第二信使所需的ros，因为no本来就是血管内皮细胞保护性的信号通路，提高其活性既能产生适量ros又能起到辅助第二信使ros产生的良好作用。
本发明作为一种功能性饮料，以优良的安全性为首要前提，提高no通路活性是通过补充这一代谢通路所需的营养物质实现的。补充5-羟基色氨酸作为bh4合成所需的营养物质使bh4水平上调，可有效促进enos偶联改善血管内皮细胞的生长增殖能力，增强血管损伤后血管内皮细胞的增殖能力。另外补充合成辅酶a所需的泛酸，促进辅酶a通过与一氧化氮结合形成sno-coa可作为sno的内源性来源，来帮助no更好发挥保护性的信使作用。
另外nox酶活受到抑制，nadph就不易被nox过度利用产生ros损伤，那nadph的还原力和自由能能够被用来还原氧化型谷胱甘肽等物质，再配合本配方里极性和非极性双亲性的ros消除剂二氢硫辛酸，能够消除机体或者细胞内区域ros过度产生的脂质过氧化损伤，起到全面保护血管内皮的作用。
在上述分析和实验的基础上，发明人参考了前期工作研究阶段系统建立的“nox不适当激活产生ros损伤，影响no等通路，产生血管内皮细胞损伤，这是导致心脑血管疾病的核心机制”理论框架，在其指导下针对性的筛选，并经过长期的细胞实验和人类志愿者随机双盲对照实验改进和验证，得出最适合防治ros诱导的血管内皮细胞损伤的复合配方，该配方基于罗布麻茶(以总黄酮3-100mg/l终浓度计算原液量)，并且后续添加终浓度为：5-羟基色氨酸(4-200mg/l)、二氢硫辛酸(4-100mg/l)、泛酸(1-10mg/l)和烟酸(2-20mg/l)的辅助成分。本配方的辅助成分化学结构清楚明确，整体上理化性质较为稳定、理论推测和实验证明不存在互相干扰问题，因此对制备方法如各组分添加顺序等无特殊要求。
与现有技术相比，本发明有以下优势。
1.发明创新性强，本专利是发明人在长期从事ros损伤血管内皮细胞机理研究的基础上，逐渐建立了“nox不适当激活产生的ros损伤，影响no等通路，产生血管内皮细胞损伤，这是导致心脑血管疾病的核心机制”这一理论框架，在其指导下针对性的筛选出以罗布麻茶为主要成分的nox低活性技术方案，并通过后续添加多种代谢通路的营养成分，调节no通路，避免局域ros损伤，提高了罗布麻茶的作用效果，一定程度上抑制了其副作用，也能够良好的缓解ros诱导的血管内皮细胞损伤。
2.本发明配方各成分间存在良好的相互作用，能产生增效协同作用。
2.1.配方成分存在良好协同作用：只有在罗布麻茶抑制nox的情况下，补充较多烟酸产生的nadph才不至于被nox代谢为超氧阴离子，进而产生ros损伤；而no通路高活性的心脑血管内皮效果保护，是建立在抑制nox来源的ros和二氢硫辛酸适当清除ros基础上的，否则no很容易与ros快速结合形成过氧亚硝酸盐等活性氮，通过诱导硝化应激增加炎症负荷，严重损伤血管内皮细胞。另外本配方5-羟基色氨酸和泛酸联合诱导的高活性no可以补充罗布麻茶和二氢硫辛酸诱导的低ros水平带来的血管内皮细胞增殖和活性下降。
2.2.配方成分互相维护稳定性：二氢硫辛酸为极性相和非极性相双亲型的ros清除剂，可以保护罗布麻茶中的黄酮等有效成分免于被氧化失活。5-羟基色氨酸、泛酸和烟酸均为不易氧化和热稳定性很高的化合物，可以维持配方中二氢硫辛酸的稳定性。
3.从细胞实验数据看，本发明配方效果明显。
详见实施例1和实施例2，本复合配方在标准化的高通量细胞实验上有明显的生理效果。
4.从志愿者试用数据看，本发明配方显著强于市面主流方案。
在作用效果上，通过综合利用高通量的标准化细胞实验与多中心大样本随机双盲对照的志愿者实验，在获取大量数据基础上统计分析，发现本配方比某些上市配方效果更为良好(详见实施例3)。
5.在安全性上，本配方辅助成分来自公认的低毒性代谢调节性营养物质，并且在实验中专门检查了配方的细胞毒性，保证使用剂量不超过毒性阈值的5%；主要通过小剂量的复合配方的方式增加效果。另外，本发明的前期工作通过标准化的高通量细胞实验，精确探明了配方各成分的作用范围和毒性阈值，从而使各组分的使用剂量有一定的宽容度，利于产品开发上市。
具体实施方式。
下面结合具体实施例对本发明的技术实施方案做进一步详细说明。
实施例1基于高通量的标准化细胞实验的配方有效性和安全性评估。
在前期工作基础上，利用高通量的标准细胞实验，筛选出配方各组分的较优剂量，组成配方a：罗布麻茶(以总黄酮终浓度为10mg/l计算原液量)、5-羟基色氨酸(40mg/l)、二氢硫辛酸(20mg/l)、泛酸(2mg/l)和烟酸(4mg/l)。
基于本发明的前期工作，分别选定配方a中各个组分的对应比值浓度(质量浓度比值按照上述顺序为：20:10:1:2，以5-羟基色氨酸在培养液中终浓度30μmol/l时按照上述比例配置的配方a为1u)，利用吸光度法测定血管内皮细胞活力和atp产量，在5次独立实验的数据基础上进行t检验分析；以p＜0.05为差异显著标准，分析出配方中该组分的起效和实效范围；为提高配方安全性，以p＞0.01的最低剂量作为该组分的毒性剂量阈值，得出配方a的终浓度数据为：最佳浓度为35u，有效范围为10-300u，毒性阈值为5000u。毒性阈值是最大有效剂量的16倍以上，说明本配方的安全性极好。
实施例2表皮干细胞ros自由基消除效果实验。
基于实施例1中的配方a的比率和终浓度单位，在35u这一最佳浓度测定胞内ros消除和损伤效果。首先利用dcf探针测定胞内ros相对浓度，发现a预处理组比阴性对照组低42.3%；其次利用碘化丙啶染色流式细胞术测定细胞死亡率，发现配方a预处理组死亡率1.1%，阴性对照组5.4%，5次独立实验后t检验发现差异显著。以上数据说明本配方a能够降低胞内ros水平，减少细胞死亡，因此可以有效防治ros导致的细胞损伤。
实施例3本配方在较优浓度下的随机双盲对照多中心志愿者实验。
2018年7月至2019年7月，在北京、西安和咸阳三座城市，分别选取各城市志愿者共150人，平均年龄42.3岁，男女比例0.875，体质指数22.3。志愿者分别每日外用外观无法分辨的实施例1所制配方a、已上市心血管保健产品b和c共120天(配方a按照实施例1给出剂量，保健产品b和c按照说明书服用)，采用随机双盲对照原则进行志愿者实验。
分别测定志愿者的血管内皮损伤标志物：vwf、pai-1、e-选择素、血管细胞粘附分子-1、血栓调节蛋白和tpa，对上述结果进行归一化，生成血管内皮损伤评分。结果显示，配方a最终能使志愿者的血管内皮损伤评分平均降低67.2%，分别是单纯使用已上市产品b和c干预效果的13.21倍和16.46倍，另外不论使用配方a、已上市保健产品b和c组的志愿者都未报告额外不适，相关体检也未发现额外异常。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的配方范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换，也应视为本发明的保护范围。