专利名称：眼科手术用灌流液制剂的制作方法
技术范围本发明涉及用于白内障手术、眼内植镜移植手术或青光眼手术的眼科手术用灌流液制剂。更详细地说，就是涉及能够安全且有效地实施该手术、所适用的眼内组织的保护、眼内手术残留物的吸引除去和防止角膜上皮与结膜干燥的眼科手术用灌流液制剂。
作为以达到此灌流液使用目的的制剂化时的注意事项有1)渗透压和pH对于眼内组织和内皮细胞在生理学上要调和；2)添加无机盐、能量源和细胞赋活剂等房水成分的必需化合物；3)在生物学上安全；4)作为制剂能够在室温下长期保存。
目前日本上市的眼科手术用灌流液制剂，是以氧化型谷甘胱肽作为细胞赋活剂的商品，此外以碳酸氢根离子作为基本缓冲体系的商品也在实用化。但是，此制剂为必须使用时混合的二液(相)性制剂，此外不含有保护角膜内皮的有效成分，在制剂的稳定性、使用时的简便性和有效性等方面有不少待解决的问题。
此外以作为能量源的3-羟基丁酸为主要成分的眼科手术用灌流液制剂公开于美国专利第5116868号和美国专利第5298487号说明书。但是，在该专利说明书中没有配合维持角膜内皮机能所必需的碳酸氢根离子。其理由是，碳酸氢根离子在制剂中存在时，因二氧化碳分压变化导致制剂pH变化而不稳定，而且3-羟基丁酸代谢生成二氧化碳，此二氧化碳变为碳酸氢根离子从而能够自动供给碳酸氢根离子，所以没有必要配合含有碳酸氢根离子的制剂。此外，上述制剂中含有人房水成分中没有的乙酸钠。
本发明中用作有效成分的D-3-羟基丁酸或其盐，已知是人和其它几乎所有哺乳类的机体成分，在肝脏经脂肪酸氧化途径生物合成，经血液转运到以角膜为代表的肝外外周组织，作为高效的能量来源(参见“レ-ニンヅャ-新生化学”，第2版，p625,1993年和“Nature”,No.4841,p597,1962年)。此外已知该物质对于角膜组织，与葡萄糖相比，作为能量生成底物很有用(参见“Transplantation”,57,p1778～1785,1994年)。D-3-羟基丁酸或其盐在这些组织的TCA循环中被氧化，产生ATP，最终变成二氧化碳和水(Nature,No.4841,p597,1962年)。
D-3-羟基丁酸及其盐作为医药的应用，已有报道作为对于机体蛋白异化作用亢进状态和机体侵袭患者的营养补充的输液成分(参见特开平2-191212号公报)。
“眼科临床医报”第92卷第7期(1998年)902～905页中，就含β-羟基丁酸盐的眼内灌流液对视网膜的影响，对离体家兔视网膜的视网膜电位图(ERG)进行研究，显示出和市售品BSS PLUS(注册商标)相同或更好的维持视网膜功能。但是，此报道没有公开β-羟基丁酸盐的D体，此外也只公开了对视网膜的影响。
此外，“第36次日本视网膜硝子体(玻璃体)学会总会1997年7月24～26日举行会议的日程、演讲稿集”201，关于含D-β-羟基丁酸钠新处方的眼内灌流液对视网膜的影响用离体家兔视网膜对ERG进行研究，显示了对于视网膜体外标本的ERG表现出和BSS PLUS相同或更好的维持。
但是，此报道没有公开上述眼内灌流液的详细组成，其公开也仅限于对视网膜的影响。
本发明的其它目的在于，提供添加了无机离子、能量源、等张化剂、缓冲剂、碳酸氢根离子和稳定化剂等，除了上述优良特性外，进一步制剂上稳定的眼内灌流液制剂。
本发明更进一步的其它目的和优点如下所述。
根据本发明，本发明的上述目的和优点在于提供用于白内障手术、青光眼手术或眼内植镜移植手术的一液型灌流液制剂，其特征在于由含(1)选自D-3-羟基丁酸及其水溶性盐的至少一种化合物，以D-3-羟基丁酸阴离子计0.1mM～小于500mM(2)水溶性碳酸氢盐，以碳酸氢根离子计0.1mM～小于100mM(3)选自磷酸和水溶性磷酸盐的至少一种化合物，以磷酸离子计0.1mM～小于50mM(4)水溶性钙盐，以钙离子计0.01mM～小于50mM以及(5)水溶性镁盐，以镁离子计0.01mM～小于50mM的水溶液构成。
图2表示本发明溶液和比较溶液对角膜的保护作用(体外实验)。
图3表示同上各溶液对角膜厚度经时变化量的影响。
图4表示发生D-3-HBA和氧化型谷甘胱肽对引发障碍的培养牛角膜内皮细胞的恢复效果。
图5表示含碳酸氢盐制剂处方中D-3-HBA的有无对角膜厚度经时变化量的影响。
图6表示不含碳酸氢盐制剂处方中D-3-HBA的有无对角膜厚度经时变化量的影响。
发明的详细说明以下对本发明的制剂进行详细的说明。
3-羟基丁酸化学结构式的C3位涉及绝对立体构型3，有D体，DL体和L体。其中在本发明中，为最大地发挥眼科手术用灌流液制剂的有效性，应使用D体。这是因为，作为该制剂有效性评价方法的一种，就角膜内皮细胞的激活作用研究各光学异构体的活性，结果发现D体得到活性，而L体几乎完全没有活性，此外D、L体并用时受到L体负面的影响。
D-3-羟基丁酸及其盐，将乙酰乙酸乙酯的酮基用钌-光活膦配合物作催化剂进行不对称氢化，接着将酯进行碱水解可以容易地进行高不对称收率的合成，能够较便宜地得到该化合物(参见特公平6-99367号公报)。
作为本发明中D-3-羟基丁酸的水溶性盐，优选钠盐、钾盐、钡盐、镁盐、锂盐、L-赖氨酸盐、L-组氨酸盐和L-精氨酸盐等。
D-3-羟基丁酸及其水溶性盐可以单独或2种以上组合使用。
本发明中的“水溶性”是指在本发明的制剂中可按制剂所要求的期望浓度溶解的性质。
本发明中，D-3-羟基丁酸和/或水溶性盐在水溶液制剂中的浓度为0.1mM～小于500mM，优选1mM～小于200mM，更优选5mM～小于100mM。
本发明中通过配合碳酸氢根离子，对角膜机能维持的重要指标之一的角膜溶胀有显著抑制作用。实际上，家兔离体强角膜片用添加或没有添加碳酸氢根离子的制剂培养，测定角膜厚度的变化，与该离子添加制剂(本发明)使角膜状态保持通常状态相对，没有添加该离子制剂使角膜溶胀加速，可判断其缺乏角膜保护作用。此外，在应用家兔眼的体内实验中一样，与该离子添加制剂(本发明)使角膜保持通常状态相对，没有添加该离子制剂使角膜溶胀加速。
以上事实可见，配合D-3-羟基丁酸的本发明制剂必须配合碳酸氢根离子。
作为水溶性碳酸氢盐，优选碳酸氢钠和碳酸氢钾。
水溶性碳酸氢盐的浓度为水溶性碳酸氢根离子(HCO3-)0.1mM～小于100mM，优选1mM～小于60mM，更优选10mM～小于60mM。
本发明的制剂中含有磷酸离子。磷酸离子来源于磷酸或水溶性磷酸盐。磷酸离子优选来源于如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾等的水溶性磷酸盐构成的磷酸缓冲液。磷酸缓冲液作为房水的成分存在。磷酸离子浓度0.1mM～小于50mM，优选0.5mM～小于30mM，更优选1mM～小于10mM。
本发明的制剂还含有钙盐。钙盐可以以由如上述的D-3-羟基丁酸离子、碳酸氢根离子或磷酸离子和钙离子形成的盐、或其它水溶性盐的形式往本发明的制剂中添加。作为如此的其它水溶性盐，例如优选氯化钙、甘油磷酸钙、葡萄糖醛酸钙等。钙盐可以使用1种或2种以上并用。
水溶性钙盐的浓度，以钙离子计0.01mM～小于50mM，优选0.1mM～小于20mM，更优选0.5mM～小于10mM。
本发明的制剂还可含有水溶性镁盐。镁盐可以以由如上述的D-3-羟基丁酸离子、碳酸氢根离子或磷酸离子和镁离子形成的盐、或其它水溶性盐的形式往本发明的制剂中添加。作为如此的其它水溶性盐，例如优选氯化镁、硫酸镁等。
水溶性镁盐的浓度，作为镁离子是0.01mM～小于50mM，优选0.1mM～小于20mM，更优选0.5mM～小于10mM。
作为本发明中灌流液制剂的添加物，可适当应用人房水中存在的无机盐、作为其它能量源的葡萄糖、使眼内组织和内皮细胞的渗透压和pH调和的等张化剂及缓冲剂、和制剂的稳定化剂等。
作为本发明所用的无机盐和等张化剂，除了上述钙盐和镁盐外，例如优选使用如氯化钠、氯化钾等碱金属的无机盐，如甘露醇、山梨醇、木糖醇和右旋糖酐等糖类的等张化剂。
这些可以单独使用或2种以上并用。这些无机盐和等张化剂的浓度分别优选在0.1～1000mM的范围。此外，制剂的渗透压可望保持在270～350m0sm的范围。
作为缓冲剂，除了上述水溶性磷酸盐外，可以使用柠檬酸、柠檬酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、以及如硼酸和硼酸钠的硼酸类缓冲剂。缓冲剂的浓度优选0.1～50mM。
本发明水溶液制剂的pH范围，为了不对眼内组织和细胞造成障碍并维持其功能，必须优选pH6.8～8.2。更优选pH7.2～8.0的范围，使用家兔眼的功能性试验和安全性试验的结果表明眼科手术用灌流液在此pH范围内是可以的。
在本发明中，灌流液制剂的主要能量源为D-3-羟基丁酸，但作为辅助能量源可以辅助性地添加葡萄糖。葡萄糖的浓度优选0.1～50mM的浓度范围。
作为稳定化剂，优选使用水溶性柠檬酸盐。作为水溶性柠檬酸盐，例如优选柠檬酸及其钠盐和钾盐。其浓度以柠檬酸根离子计，优选0.01～50mM，更优选0.1～10mM。
如此的主要成分和添加物，可按其所定量依次溶解于蒸馏水，用稀盐酸或稀碱液调节pH后，作为一液型制剂使用透明玻璃容器或塑料容器密封保存。这样保存的制剂在40℃·75％湿度下保存6个月的试样和试验开始时比较，其外观和渗透压等没有变化。另一方面，关于pH，柠檬酸或其盐优选在0.1～1.5mM，更优选0.1～10mM的浓度范围内设定，实验开始时制剂的pH为7.3～7.4，上述保存结束时pH为7.4～7.8，该水溶液的pH变化较小，即使在碳酸氢根离子的存在下仍得到比较稳定的灌流液制剂。
表1
实施例2进行实施例1中含有D-3-HBA的溶液No.1的制剂稳定性实验。将500毫升该制剂充填于容积600毫升的透明玻璃容器中，密封，调制5份受检液。将其在调温至40℃±0.5℃、调湿度至75±5％RH的恒温恒湿容器内保存6个月。其结果是溶液的外观、不溶性异物实验和渗透压都没有变化。关于溶液的pH，保存开始时为7.3～7.4，保存6个月后为7.4～7.8，变化较小，可判定该制剂在室温下可长期稳定保存。实施例3为显示3-HBA的异构体、D体、DL体和L体中D体有效，使用培养牛角膜内皮细胞按下述MTT测定法(Chem.Pharm.Bull.,41,1118,1993年)定量测定各异构体的细胞激活作用。
将D体、DL体和L体的D-3～HBA分别以0(对照)、5、20mM的浓度用DULBECCO的MEM盐类培养基溶解的溶液注入预先培养的牛角膜内皮细胞黏附(4×104细胞/毫升)的24孔胶原包被板，培养48小时。培养后，各孔中加入50微升细胞计数试剂(同仁化学公司制造)发色后，用上清测定450nm处的吸光度，结果如
图1所示。
关于D体、DL体和L体各自的细胞激活作用，在所有浓度中，添加D-3-HBA培养的细胞活性最高，最适浓度为20mM。L体和对照组(没有添加HBA)比较，没有一个浓度有显著性差异，此外对于DL体，5mM和20mM的浓度和对照组没有显示显著性差异。
对成熟家兔在角膜周围附着约5毫米巩膜的状态下摘取巩角膜片(4种受检液每种5片共20片)，在受检灌流液中、36℃条件下培养5小时，然后用超声波角膜厚度计(DGH-500 PACHETTE、DGHTECHNOLOGY)计测角膜厚度。
各受检液5小时培养结束后的角膜厚度变化量(=培养前的角膜厚度-培养5小时后的角膜厚度)如图2所示。
D-3-HBA和碳酸氢根离子配合的溶液No.1和不含碳酸氢根离子的溶液No.2比较，显示显著的角膜保护作用；此外和市售品比较液1和比较液2相比，对角膜溶胀显示出同等或以上的抑制作用。
各家兔用盐酸赛拉嗪和盐酸氯胺酮肌肉注射全身麻醉后，各个体左右眼的角膜轮部用眼科手术刀切开3.2毫米的宽度，将针头磨圆的18G注射针从切口插入前房内，4种受检液分别以10毫升/分钟的流速灌流120分钟。灌流前和灌流开始后每30分钟至120分钟止，在0.4％盐酸羟普鲁卡因点眼麻醉下用上述超声波角膜厚度计测定各受检液的角膜厚度变化量。各角膜厚度的经时变化量如图3所示。
其结果和实施例4的体外实验结果相同，图3显示，含有D-3-HBA和碳酸氢根离子的溶液No.1和没有添加碳酸氢根离子的溶液No.2、比较液1和比较液2相比，角膜厚度的变化显著减少，是具有优良角膜保护作用的灌流液制剂。
使用赋予超声波障碍的牛角膜内皮细胞，D-3-HBA和氧化型谷甘胱肽的屏障功能恢复作用按以下方法进行实验。
将用92W/cm2的超声波以0.1秒的间隔照射3次处理使之发生超声波障碍的滤膜上的培养牛角膜内皮细胞单层在配合20mM D-3-HBA或0.3mM氧化型谷甘胱肽的DULBECCO的MEM培养基(加有10％胎牛血清)中培养，以该内皮细胞层的经时电阻值变化为指标测定屏障功能的恢复程度，结果如图4所示。
添加D-3-HBA的培养基中的单层电阻值和添加氧化型谷甘胱肽的培养基和只是该MEM培养基的相比，任何观测时间都显示和超声波照射前阻抗值相近的值，显示出快速的屏障功能恢复作用。
表2 实验使用荷兰兔(雌雄，体重1.9～2.9千克)。各家兔用盐酸赛拉嗪(セラクタ-ル,バィエル药品公司)和盐酸氯胺酮(ケタラ-ル，三共公司)肌肉注射全身麻醉后，角膜轮部用眼科手术刀切开宽3.2毫米的切口，将针头磨圆的18G注射针从切口插入前房内，灌流液以10毫升/分钟的流速灌流90分钟。灌流结束后切开部位用穿线缝合针一针缝合。角膜厚度的测定使用实施例4所用的超声波角膜厚度计，在灌流前和灌流中(每隔30分钟)测定。
通过将D-3-HBA和碳酸氢根离子在眼内灌流液中配合，能显著保持D-3-HBA使角膜厚度变化变小的作用(图5)。另一方面，在没有配合碳酸氢根离子的眼内灌流液处方中，D-3-HBA使角膜厚度变化小的作用不显著(图6)。
综上所述，根据本发明，组合作为能量源的D-3-羟基丁酸和/或其盐、碳酸氢根离子、磷酸离子、钙离子、镁离子、和根据情况需要还有柠檬酸离子，作为眼科手术用灌流液，其安全性高且对以角膜内皮细胞为首的眼组织的保护作用和物理性侵袭恢复作用优良，进一步添加无机盐、等张化剂、葡萄糖、缓冲剂和稳定化剂能够调制稳定的眼科手术用灌流液制剂。
权利要求
1．用于白内障手术、青光眼手术或眼内植镜移植手术的一液型灌流液制剂，其特征在于由含(1)选自D-3-羟基丁酸及其水溶性盐的至少一种的化合物，以D-3-羟基丁酸阴离子计0.1mM～小于500mM(2)水溶性碳酸氢盐，以碳酸氢根离子计0.1mM～小于100mM(3)选自磷酸和水溶性磷酸盐的至少一种的化合物，以磷酸离子计0.1mM～小于50mM(4)水溶性钙盐，以钙离子计0.01mM～小于50mM以及(5)水溶性镁盐，以镁离子计0.01mM～小于50mM的水溶液构成。
2．根据权利要求1记载的制剂，其中D-3-羟基丁酸的水溶性盐选自D-3-羟基丁酸的钠盐、钾盐、钡盐、镁盐、锂盐、L-赖氨酸盐、L-组氨酸盐和L-精氨酸盐。
3．根据权利要求1记载的制剂，其中水溶性碳酸氢盐为碳酸氢钠或碳酸氢钾。
4．根据权利要求1记载的制剂，其中水溶性磷酸盐选自磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。
5．根据权利要求1记载的制剂，其中水溶性钙盐选自氯化钙、甘油磷酸钙和葡萄糖醛酸钙。
6．根据权利要求1记载的制剂，其中水溶性镁盐为氯化镁或硫酸镁。
7．根据权利要求1记载的制剂，含有水溶性柠檬酸和/或其盐。
8．根据权利要求7记载的制剂，其中水溶性柠檬酸盐为柠檬酸钠或柠檬酸钾。
全文摘要
在白内障、青光眼或眼内植镜移植等眼科手术的术中、术后,能够优良保护眼组织和内皮细胞且机体安全性高的一液型眼内灌流液制剂。此制剂由含有选自D－3－羟基丁酸及其水溶性盐的至少一种化合物、水溶性碳酸氢盐、选自磷酸和水溶性磷酸盐的至少一种化合物、水溶性钙盐及水溶性镁盐的水溶液构成。
文档编号A61K33/00GK1314810SQ98814280
公开日2001年9月26日 申请日期1998年10月21日 优先权日1997年4月22日
发明者米田丰秋, 直井信久, 见市博明, 中村滋, 秦俊尚, 齐藤文郎, 大沼毅 申请人:欧得士株式会社