吡咯取代的2－吲哚满酮蛋白激酶抑制剂的制作方法

专利名称：吡咯取代的2－吲哚满酮蛋白激酶抑制剂的制作方法
相关的申请本申请涉及并且对1998年5月29日提交的美国临时专利申请系列号60/087,310号和1999年1月15日提交的美国临时专利申请系列号60/116,106号的优先权提出了权利要求，好象在此充分阐明的那样，这两个专利通过引用结合到本文中。前言本发明一般涉及有机化学、生物化学、药理学和医学。更详细地说，本发明涉及调节蛋白激酶(“PKs”)活性的新的吡咯取代的2-吲哚满酮化合物和它们的生理学上可接受的盐和前药，并由此期待呈现对抗与异常PK活性相关的疾病的有益健康作用。
PKs为催化蛋白质的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基上羟基磷酸化的酶。这个表面上简单的活性的结果是令人惊愕的；细胞的生长、分化和增殖，即细胞生命的所有方面实质上都以一种或另一种方式依赖于PK活性。而且，异常PK活性已涉及到宿主的疾病，范围从相对非威胁生命的疾病例如牛皮癣到极度致命的疾病例如成胶质细胞瘤(脑癌)。
PKs可便利地分为两类，即蛋白酪氨酸激酶(PTKs)和丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)。
PTK活性的主要方面之一是它们与生长因子受体有关联。生长因子受体为细胞表面蛋白。当由生长因子配体结合时，生长因子受体转变为活化型，其与细胞膜内表面的蛋白相互作用。这导致受体和其它蛋白的酪氨酸残基磷酸化并导致在细胞内部依次与多种细胞应答作用例如细胞分裂(增殖)、细胞分化、细胞生长、对细胞外微环境的代谢作用的表达等的多种细胞质信号分子形成复合物。对更完全的讨论，参见Schlessinger和Ullrich，神经元，9:303-391(1992)，该文献包括任何绘图通过引用结合到本文中作为一个整体。
具有PTK活性的生长因子受体称作受体酪氨酸激酶(“RTKs”)。它们包括一个具有多样生物活性的跨膜受体的大家族。目前，已鉴定至少十九(19)种性质截然不同的亚家族的RTKs。这些亚族的一个实例为称作“HER”RTKs的亚家族，其包括EGFR(表皮生长因子受体)、HER2、HER3和HER4。这些RTKs包括细胞外糖基化配体结合域、跨膜域和细胞内细胞质催化域，它们能够使蛋白上的酪氨酸残基磷酸化。
另一类RTK亚家族包括胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子I受体(IGF-1R)和胰岛素受体相关受体(IRR)。IR和IGF-1R与胰岛素、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ相互作用，形成两个完全细胞外糖基化α亚单位的杂化四聚物和两个β亚单位，它们穿过细胞膜并且含有酪氨酸激酶域。
第三种RTK亚家族称作血小板衍生生长因子受体(“PDGFR”)组，其包括PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、c-kit和c-frns。这些受体包括由可变化数目的免疫球蛋白样环状结构构成的糖基化细胞外域和其中酪氨酸激酶域由不相关的氨基酸序列中断的细胞内域。
另一组由于其与PDGFR亚家族的相似性，有时被纳入后一组，这一组是胎肝激酶(“flk”)受体亚家族。该组被认为由激酶嵌入域-受体胎肝激酶-1(KDR/FLK-1)、flk-1R、flk-4和fms样酪氨酸激酶1(flt-1)组成。
酪氨酸激酶生长因子受体族的另一个成员是成纤维细胞生长因子(“FGF”)受体亚组。该组包括四种受体FGFR1-4和七个配体FGF1-7。在尚未很好定义时，似乎所述受体包括含有可变化数目的免疫球蛋白样环状结构的糖基化细胞外域和其中酪氨酸激酶序列由不相关的氨基酸序列区中断的细胞内域。
仍然是酪氨酸激酶生长因子受体家族的另一个成员为血管内皮生长因子(“VEGF”)受体亚组。VEGF为相似于PDGF但是在体内具有不同的生物功能和靶细胞特异性的二聚化糖蛋白。目前尤其认为VEGF在血管形成和血管发生中起必要作用。
Plowman等在DN&P,7(6):334-339(1994)中描述已知的RTK亚家族更完全的条目，该文献包括任何绘图作为一整体通过引用结合到本文中。
除了RTKs以外，也存在一个称作“非受体酪氨酸激酶”或“细胞酪氨酸激酶”的完全细胞内PTKs家族。将在此使用后一名称，缩写为“CTK”。CTKs不含有细胞外域和跨膜域。目前，已在11个亚家族(Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes、Fps、Fak、Jak和Ack)中鉴定超过24个CTKs。迄今Src亚家族似乎是最大的一组CTKs并且包括Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk。对CTKs的更详细的讨论，参见Bolen，癌基因，8:2025-2031(1993)，其全文包括任何绘图作为一整体提出，通过引用结合到本文中。
像CTKs一样，丝氨酸/苏氨酸激酶STKs在细胞内占据主导地位，尽管仅具有几种STK型受体激酶。STKs是最常见的细胞溶胶激酶；即激酶在细胞质部分而不是在细胞质的细胞器和细胞骨架内发挥它们的功能。细胞溶胶是细胞内一个区域，在这里大多数细胞的中间代谢和生物合成活性发生；例如，蛋白质是在细胞溶胶中的核糖体上合成的。
RTKs、CTKs和STKs全部都明显与宿主的病理状况包括癌症有关。与PTKs有关的其它病理状况包括(但不局限于)牛皮癣、肝硬化、糖尿病、血管发生、再狭窄、眼科疾病、类风湿性关节炎和其它的炎性疾病、免疫疾病例如自身免疫疾病、心血管疾病例如动脉硬化和多种肾病。
关于癌症，提出两个主要的假设来解释过度的细胞增殖，该增殖驱动与已知由PK调节的功能有关的肿瘤发展。即人们建议恶性细胞生长是由于控制细胞分裂和/或分化的机制被破坏引起的。已显示多种原癌基因的蛋白质产物参与调控细胞生长和分化的信号传导途径。原癌基因的这些蛋白质产物包括以上讨论的细胞外生长因子、跨膜生长因子PTK受体(PTKs)、细胞质PTKs(CTKs)和细胞溶质STKs。
鉴于PK相关细胞活性与广泛的人类疾病之间的明显关联，花费大量的努力试图鉴定调控PK活性的方法并不令人惊奇。这些方法中的一些包括在参与实际细胞过程中使用大分子模拟的那些仿生学方法(例如，突变型配体(美国专利申请第4,966,849号)；可溶性受体和抗体(申请号WO 94/10202,Kendall和Thomas,Proc.Nat′l Acad.Sci.,90:10705-09(1994),Kim等，自然，362:841-844(1993))；RNA配体(Jelinek，等，生物化学，33:10450-56)；Takano，等，Mol.Bio.Cell4:358A(1993)；Kinsella，等，Exp.Cell Res.199:56-62(1992)；Wright，等，J.Cellular Phys.,152:448-57)和酪氨酸激酶抑制剂(WO 94/03427、WO92/21660、WO 91/15495、WO 94/14808、美国专利第5,330,992号、Mariani，等，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.,35:2268(1994))。
除了以上之外，已试图鉴定作为PK抑制剂的小分子。例如，双-单环、双环和杂环芳基化合物(PCT WO 92/20642)、1,2-亚乙烯基-氮杂吲哚衍生物(PCT WO 94/14808)和1-环丙基-4-吡啶基喹诺酮类(美国专利第5,330,992号)已被描述为酪氨酸激酶抑制剂。苯乙烯基化合物(美国专利第5,217,999号)、苯乙烯基取代的吡啶基化合物(美国专利第5,302,606号)、喹唑啉衍生物(欧洲专利申请第0 566 266 A1号)、硒吲哚类和硒化物(PCT WO 94/03427)、三环多羟基化合物(PCT WO92/21660)和苄基膦酸化合物(PCT WO 91/15495)全部被描述为用于治疗癌症的PTK抑制剂。
发明概述我们自己鉴定调控PK活性的有机小分子并因此期待其用于治疗和预防涉及异常PK活性疾病的努力，已使得我们发现一族新的吡咯取代的2-吲哚满酮化合物，该类化合物呈现PK调控能力并因此期待具有对抗与异常PK活性相关疾病的有益健康的作用。正是这些化合物成为本发明目的。
因此，本发明一般涉及新的吡咯取代的2-吲哚满酮类，它们调节受体酪氨酸激酶(RTKs)、非受体蛋白酪氨酸激酶(CTKs)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STKs)活性。另外，本发明涉及用于治疗或预防PK引起的疾病例如(通过举例说明但不局限于)癌症、糖尿病、肝硬变、心血管疾病如动脉硬化、血管发生、免疫疾病如自身免疫疾病和肾病的公开的化合物和它们的生理学上可接受的盐和前药的制备和药用组合物的用途。
在此可互换使用的术语“2-吲哚满酮”、“吲哚满-2-酮”和“2-羟基吲哚”指的是具有以下化学结构的分子。 “吡咯”指的是具有以下化学结构的分子。 在此可互换使用的“吡咯取代的2-吲哚满酮”和“3-吡咯亚基-2-吲哚满酮”指的是具有在式1中显示的通式结构的化学化合物。
“药用组合物”指的是在此描述的一种或多种化合物或者它们的生理学上可接受的盐和前药与其它的化学成分例如生理学上可接受的载体和赋形剂的混合物。药用组合物的目的是使得化合物便利地给予有机体。
“前药”指的是在体内转化为母体药物的物质。前药经常是有用的，因为在一些情况中，它们可比母体药物更易于给药。例如，它们经口服给药是生物有效的而母体药物则不是生物有效的。前药在药用组合物中也可改善溶解性来超过母体药物的溶解性。前药不加以限制的实例为其作为酯(“前药”)给药的本发明化合物以便利于穿过细胞膜(在此水溶性对流动性是有害的，但是然后代谢水解为羧酸)，活性实体一旦进入细胞，水溶性就是有益的。
前药的另一个实例可为短的多肽，例如(不局限于)通过末端氨基键合于本发明化合物的羧基的2-10个氨基酸多肽，其中所述多肽体内水解或代谢释放出活性分子。
“吡咯醛”指的是具有以下化学结构的分子。 如同在此使用的“生理学上可接受的载体”指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
“赋形剂”指的是加入到药用组合物中以进一步便利于给予化合物的惰性物质。赋形剂的实例包括(不局限于)碳酸钙、磷酸钙、多种糖类和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。1．化学A．一般结构特征一方面，本发明涉及吡咯取代的2-吲哚满酮，除非在所述化合物的吡咯和2-吲哚满酮两部分任选取代之外，其必须在吡咯部分上用一个或多个本身被至少一个极性基团取代的烃链来取代。权利要求保护的化合物的生理学上可接受的盐和前药也处于本发明范围内。
“烃链”指的是如在此定义的烷基、链烯基或炔基。
“极性”基团指的是其中原子的核彼此共价结合以形成不带有平等结合它们的共价键电子的基团的基团；即电子云在一个原子周围比在另一个原子周围更厚。这导致共价键的一端是相对负性而共价键的另一端是相对正性，即存在负极和正极。极性基团的实例包括(不局限于)羟基、烷氧基、羧基、硝基、氰基、氨基、铵、酰氨基、脲基、磺酰氨基、亚硫酰基、磺酰基、膦酰基、吗啉代、哌嗪基和四唑基。
不受任何特殊的理论限制时，在此申请者相信极性基团例如(但不局限于)通过氢键、范德华力和/或离子键(但不是共价键)可与在PTK活性位点上的氨基酸进行电子之间的相互作用。这些相互作用可有助于本发明的分子具有足够的的结合力结合于活性位点以干扰或阻止天然作用物进入所述位点。极性基团也可有助于这些化合物的选择性；即一个极性基团可比其它的极性基团对PTK结合域具有更高的亲和性，以至于含有第一个特殊极性基团的化合物比含有其它极性基团的化合物更有潜力。
因此，本发明的一个方面涉及具有以下化学结构的化合物 R1选自氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、羟基、烷氧基、C-羧基、O-羧基、乙酰基、C-酰氨基、C-硫代酰氨基、磺酰基和三卤代甲磺酰基。
R2选自氢、卤代、烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂脂环基。
R3、R4、R5和R6独立选自氢、烷基、三卤代烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、亚硫酰基、磺酰基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、三卤代甲磺酰氨基、羰基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、氰基、硝基、卤代、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、氨基和-NR11R12。
R11和R12独立选自氢、烷基、环烷基、芳基、羰基、乙酰基、磺酰基、三氟甲磺酰基及接合为五-或六-元杂脂环。
R3和R4、R4和R5或R4和R5可接合形成六-元芳环，亚甲二氧基或亚乙二氧基。
R7选自氢、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、羰基、乙酰基、C-酰氨基、C-硫代酰氨基、脒基、C-羧基、O-羧基、磺酰基和三卤代甲磺酰基。
R8、R9和R10独立选自氢、烷基、三卤代烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、亚硫酰基、磺酰基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、羰基、C-羧基、O-羧基、氰基、硝基、卤代、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、氨基和-NR11R12，然而条件是R8、R9或R10中至少一个为具有式-(alk1)Z的基团。
Alk1选自烷基、链烯基或炔基。
Z为极性基团。
如在此使用的术语“烷基”指的是包括直链和枝链基团的饱和脂肪烃。所述烷基优选具有1-20个碳原子(无论何时，数目的范围例如在此陈述的“1-20”，其意指在烷基的情况下可含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等等直到达到并包括20个碳原子)。更优选为中等大小的具有1-10个碳原子的烷基。最优选为具有1-4个碳原子的低级烷基。所述烷基可为取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个各自选自以下的基团环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤代、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-羧基、O-羧基、硝基、甲硅烷基、氨基和R11和R12如上定义的-NR11R12。
“环烷基”指的是全部为碳的单环或稠和的环(即带有一个相邻对碳原子的环)基团，其中一个或多个环不具有完全连接的pi-电子系统。环烷基的实例(不局限于)为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、金刚烷、环己二烯、环庚烷和环庚三烯。环烷基可为取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个各自选自以下的基团，包括烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤代、羰基、硫代羰基、C-羧基、O-羧基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、氨基和R11和R12如上定义的-NR11R12。
如在此定义的“链烯基”指的是包括至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键的烷基。
如在此定义的“炔基”指的是包括至少两个碳原子和至少一个碳-碳叁键的烷基。
“芳基”指的是所有为碳的单环或稠和环的具有完全连接的pi-电子系统的多元环(即其带有相邻对碳原子的环)基团。芳基的实例(不局限于)为苯基、萘基和蒽基。芳基可为取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个选自以下的基团，包括卤代、三卤代甲基、烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、羰基、硫代羰基、C-羧基、O-羧基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、亚硫酰基、磺酰基、氨基和R11和R12如同在此定义的-NR11R12的基团。
如在此使用的“杂芳基”指的是单环或稠和环(即带有相邻对原子的环)基团，其在环上具有一个或多个选自氮、氧和硫的原子并且另外具有完全连接的pi-电子系统。杂芳基的实例(不局限于)为吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、嘌呤和咔唑。杂芳基可为取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个选自以下的基团，包括烷基、环烷基、卤代、三卤代甲基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、羰基、硫代羰基、亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、亚硫酰基、磺酰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、氨基和R11和R12如上定义的-NR11R12。
“杂脂环基”指的是在环上具有一个或多个选自氮、氧和硫的原子的单环或稠和环。所述环也可含有一个或多个双键。然而，所述环不具有完全连接的pi-电子系统。杂脂环可为取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个选自以下的基团，包括烷基、环烷基、卤代、三卤代甲基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、羰基、硫代羰基、C-羧基、O-羧基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、亚硫酰基、磺酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、氨基和R11和R12如上定义的-NR11R12。
“羟基“指的是-OH基团。
“烷氧基”指的是如在此定义的-O-烷基和-O-环烷基两者。
“芳氧基”指的是如在此定义的-O-芳基和-O-杂芳基两者。
“巯基”指的是-SH基团。
“烷硫基”指的是如在此定义的S-烷基和-S-环烷基两者。
“芳基硫代”指的是如在此定义的-S-芳基和-S-杂芳基两者。
“羰基”指的是-C(=O)-R”基团，其中R”选自如在此定义的氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基(通过环碳键合)和杂脂环基(通过环碳键合)。
“醛”指的是其中R”为氢的羰基。
“硫代羰基”指的是其中R”如在此定义的-C(=S)-R”基团。
“C-羧基”指的是其中R”如在此定义的-C(=O)O-R”基团。
“O-羧基”指的是其中R”如在此定义的-OC(=O)R”基团。
“酯”指的是其中R”如同在此定义的-C(=O)O-R″基团，除非R″不能为氢。
“乙酰基”指的是-C(=O)CH3基团。
“羧酸”指的是其中R″为氢的C-羧基。
“卤代”指的是氟、氯、溴或碘。
“三卤代甲基”指的是其中X为如在此定义的卤代基团的-CX3基团。
“三卤代甲磺酰基”指的是其中X为如上定义的X3CS(=O)2-基团。
“氰基”指的是-C≡N基团。
“亚硫酰基”指-S(=O)-R″基团，其中R″除了如上定义外，也可为羟基。
“磺酰基”指的是其中R″除了如上定义的以外也可为羟基的-S(=O)2R″基团。
“亚甲二氧基”指的是其中两个氧原子连接于相邻的碳原子上的-OCH2O-基团。
“亚乙二氧基”指的是其中两个氧原子连接于相邻的碳原子上的-OCH2CH2O-基团。
“S-亚磺酰氨基”指的是其中R11和R12如在此定义的-S(=O)2NR11R12基团。
“N-亚磺酰氨基”指的是其中R11和R12如在此定义的-NR11S(=O)2R12基团。
“O-氨基甲酰基”指的是其中R11和R12如在此定义的-OC(=O)NR11R12基团。
“N-氨基甲酰基”指的是其中R11和R12如在此定义的R12OC(=O)NR11-基团。
“O-硫代氨基甲酰基”指的是其中R11和R12如在此定义的-OC(=S)NR11R12基团。
“N-硫代氨基甲酰基”指的是其中R11和R12如在此定义的R12OC(=S)NR11-基团。
“氨基”指的是其中R11和R12两者为氢的-NR11R12基团。
“C-酰氨基”指的是R11和R12如在此定义的-C(=O)NR11R12基团。
“N-酰氨基”指的是R11和R12如在此定义的R12C(=O)NR11基团。
“铵”基团指的是其中R11和R12独立选自烷基、环烷基、芳基和杂芳基的-+NHR11R12。
“脲基”指的是R11和R12如在此定义的并且R13与R11和R12定义相同的-NR11C(=O)NR12R13。
“胍基”指的是R11、R12和R13如在此定义的-R11NC(=N)NR12R13。
“脒基”指的是R11和R12如在此定义的R11R12NC(=N)-基团
“硝基”指的是-NO2基团。
“膦酰基”指的是R″如在此定义的-OP(=O)2OR”。
“吗啉代”指的是具有以下化学结构的基团。 “哌嗪基”指的是具有以下化学结构的基团。 “四唑并”指的是具有以下化学结构的基团 B．优选的结构特征。
R1为氢是本发明优选的特征。
R2为氢也是本发明优选的特征。
R7为氢同样是本发明优选的特征。
本发明优选的特征是所有以上三个限定均存在于相同的分子中；即在本发明化合物中，R1、R2和R7为氢。
还优选R3、R4、R5和R6选自氢、未取代的低级烷基、用选自羟基、卤代、用氢和未取代的低级烷基、氨基或-NR11R12的基团取代的C-羧基取代的低级烷基、未取代的低级烷基烷氧基、用一个或多个卤代基团取代的低级烷氧基、用选自未取代的芳基或用一个或多个独立选自未取代的低级烷基、羟基、未取代的低级烷基烷氧基、卤代、氨基、未取代的低级烷基S-亚磺酰氨基或-NR11R12的基团取代的芳基的基团取代的低级烷氧基、未取代的芳基或用一个或多个独立选自未取代的低级烷基、未取代的低级烷基烷氧基、用一个或多个卤代基团取代的低级烷氧基、用选自未取代的芳基或用一个或多个独立选自未取代的低级烷基、羟基、未取代的低级烷基烷氧基、卤代、氨基、未取代的低级烷基S-亚磺酰氨基或-NR11R12的基团取代的芳基的基团取代的低级烷氧基、羟基、氨基、未取代的低级烷基亚磺酰氨基、用选自氢或未取代的低级烷基的基团取代的C-羧基、吗啉代、-NR11R12、三卤代甲基、芳基、用一个或多个独立选自羟基、卤代、三卤代甲基、氨基、-NR11R12的基团取代的芳基、亚磺酰氨基、用选自氢或未取代的低级烷基的基团取代的C-羧基、未取代的低级烷基或用选自羟基、卤代的基团取代的低级烷基、用选自氢或未取代的低级烷基、氨基或-NR11R12的基团取代的C-羧基、未取代的杂脂环基、用一个或多个独立选自卤代、羟基、未取代的低级烷基、未取代的低级烷基羰基、羟基、未取代的低级烷基烷氧基或用一个或多个卤代基团的基团取代的杂脂环基、未取代的芳氧基、用一个或多个独立选自未取代的低级烷基、三卤代甲基、卤代、羟基、氨基或-NR11R12的基团取代的芳氧基、巯基、未取代的低级烷基烷硫基、未取代的芳硫基、用一个或多个选自卤代、羟基、氨基或-NR11R12的基团取代的芳硫基、用选自氢和未取代的低级烷基的基团取代的C-羧基、未取代的低级烷基O-羧基、未取代的低级烷基S-亚磺酰氨基、硝基、未取代的低级烷基C-酰氨基、未取代的低级烷基N-酰氨基、氨基和-R11R12。
在本发明的另一个优选实施方案中，R3、R4、R5和R6独立选自氢、卤代、未取代的低级烷基、用一个或多个选自羟基、卤代、以选自氢或未取代的低级烷基、氨基或-NR11R12的基团取代的C-羧基的基团取代的低级烷基、未取代的低级烷基烷氧基、用一个或多个卤代基团取代的低级烷基烷氧基、未取代的芳氧基、用一个或多个独立选自未取代的低级烷基、用一个或多个卤代基团取代的低级烷基、羟基、未取代的低级烷基烷氧基、卤代、氨基或-NR11R12的基团取代的芳氧基、其中R11和R12独立选自氢和未取代的低级烷基的S-亚磺酰氨基、未取代的芳基、用一个或多个独立选自卤代、未取代的低级烷基、用一个或多个卤代基团取代的低级烷基、未取代的低级烷基烷氧基、氨基或-NR11R12的基团取代的芳基、未取代的杂芳基、用一个或多个独立选自未取代的低级烷基、用一个或多个卤代基团取代的低级烷基、未取代的低级烷基烷氧基、羟基、卤代、氨基或-NR11R12的基团取代的杂芳基、未取代的杂脂环基、用一个或多个独立选自卤代、羟基、未取代的低级烷基、用一个或多个卤代基团取代的低级烷基、未取代的低级烷基烷氧基、氨基或-NR11R12的基团取代的杂脂环基、未取代的低级烷基O-羧基、其中R11和R12独立选自氢、未取代的低级烷基和未取代的芳基的C-酰氨基和其中R11和R12独立选自氢、未取代的低级烷基和未取代的芳基的N-酰氨基。
本发明优选的特征是R8、R9和R10中的一个为-(alk1)Z而其它两个独立选自氢、羟基、未取代的低级烷基、未取代的低级链烯基、未取代的低级炔基、未取代的低级烷基烷氧基、用一个或多个卤代基团取代的低级烷氧基、未取代的芳基烷氧基、氨基、-NR11R12、卤代、用选自氢或未取代的低级烷基的基团取代的C-羧基、未取代的低级烷基O-羧基、未取代的低级烷基C-酰氨基、未取代的低级烷基N-酰氨基、乙酰基、未取代的低级烷基S-亚磺酰氨基、未取代的芳基或用选自卤代、羟基、未取代的低级烷基烷氧基、用一个或多个卤代基团取代的烷氧基、用选自氢或未取代的低级烷基、未取代的低级烷基O-羧基、氨基、未取代的低级烷基S-亚磺酰氨基和-NR11R12的基团取代的C-羧基的基团取代的芳基。
R8和R10选自氢和未取代的低级烷基是本发明优选的特征。
alk1为未取代的低级烷基也是本发明优选的特征。
本发明的另一个优选的特征是Z选自羟基、氨基、-NR11R12、季铵、用选自氢或未取代的低级烷基的基团取代的C-羧基、用选自氢和未取代的低级烷基的基团取代的C-酰氨基、吗啉代、哌啶基、四唑基和膦酰基。
本发明另一个优选的特征为alk1为两个至四个碳的未取代的低级烷基和Z为羧酸。
本发明优选的特征为R9为alk1Z。
本发明同样优选的特征为R11和R12独立选自氢、未取代的低级烷基、羟基、未取代的低级烷基烷氧基、未取代的低级烷基羰基、未取代的低级烷基O-羧基和乙酰基。
在本发明另一个优选实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7为氢，R8和R10为甲基和R9为-CH2CH2C(=O)OH。
也为本发明优选实施方案的是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8为氢，R10为甲基和R9为-CH2CH2C(=O)OH。
在本发明另一个优选实施方案中，R7选自氢、未取代的低级烷基、和用选自未取代的环烷基、未取代的芳基和用选自羟基、未取代的低级烷基烷氧基和卤代的基团取代的芳基的基团取代的低级烷基。
z选自-C(=O)NR13R14也是本发明优选的实施方案，其中R13和R14独立选自氢、未取代的低级烷基、用选自氨基和-NR11R12的基团取代的低级烷基、未取代的芳基、用一个或多个选自卤代、羟基、未取代的低级烷基烷氧基和三卤代甲基的基团取代的芳基、未取代的杂芳基、未取代的杂脂环基以及接合在一起为五-元或六-元未取代的杂脂环基和-NR11R12，其中R11和R12独立选自未取代的低级烷基以及接合在一起为五-元或六-元未取代的杂脂环。
本发明的另一个优选的实施方案是R7选自未取代的低级烷基、用一个或多个选自未取代的环烷基的基团取代的低级烷基、未取代的芳基、用一个或多个独立选自卤代和未取代的低级烷基烷氧基和未取代的低级烷基羧基烷基取代的芳基，并且Z选自未取代的C-羧基和未取代的低级烷基C-羧基。
最后，本发明优选的实施方案是R3、R4、R5和R6独立选自氢、卤代、未取代的低级烷基、用一个或多个羟基取代的低级烷基、未取代的低级烷氧基、未取代的芳基、用一个或多个未取代的低级烷氧基取代的芳基和-S(O)2NR11R12,R5为氢，R6为-NR11R12和R11和R12独立选自氢、未取代的低级烷基和接合在一起为五-元或六-元未取代的杂脂环。
在此所指的化学式可存在互变异构体和结构异构体现象。例如，在此描述的化合物可使2-吲哚满酮部分连接于吡咯部分的有关双键采用E或Z构型，或它们可为E和Z的混合物。本发明包括任何具有调控RTK、CTK和/或STK活性的互变异构体或结构异构体形式和它们的混合物并且不局限于任何一种互变异构体或结构异构体形式。2．合成/组合库本发明的另一方面是至少10个能够经结构2的羟基吲哚与结构3的醛反应形成的3-吡咯烷基-2-吲哚满酮化合物的组合库。 其中R1-R10具有以上阐明的含义。
如同在此使用的“组合库”指的是在多维列阵的化合物中由一维的每个化合物与其它的每一个维中的化合物反应形成的所有化合物。在本发明上下文中，所述列阵是二维的并且一维表示本发明所有的羟基吲哚类和第二维表示本发明所有的醛。每一个羟基吲哚可与每个和每一个醛反应以形成3-吡咯烷基-2-吲哚满酮化合物。以该方法形成的所有3-吡咯烷基-2-吲哚满酮化合物处于本发明范围内。经一些羟基吲哚与所有的醛反应、所有的羟基吲哚与一些醛反应或者一些羟基吲哚与一些醛反应形成的更小的组合库也处于本发明范围内。
以上组合库中的羟基吲哚优选选自羟基吲哚本身和取代的羟基吲哚，例如(但不局限于)6-溴羟基吲哚、5-羟基羟基吲哚、5-甲氧基羟基吲哚、6-甲氧基羟基吲哚、5-苯基氨基磺酰基羟基吲哚、4-[2-(2-异丙基苯氧基)-乙基]羟基吲哚、4-[2-(3-异丙基苯氧基)乙基]羟基吲哚、4-[2-(4-异丙基苯氧基)乙基]羟基吲哚、5-氟羟基吲哚、6-氟羟基吲哚、7-氟羟基吲哚、6-三氟甲基羟基吲哚、5-氯羟基吲哚、6-氯羟基吲哚、吲哚-4-羧酸、5-溴羟基吲哚、6-(N-乙酰氨基)-羟基吲哚、4-甲基羟基吲哚、5-甲基羟基吲哚、4-甲基-5-氯羟基吲哚、5-乙基羟基吲哚、6-羟基羟基吲哚、5-乙酰基羟基吲哚、羟基吲哚-5-羧酸、5-甲氧基羟基吲哚、6-甲氧基羟基吲哚、5-氨基羟基吲哚、6-氨基羟基吲哚、4-(2-N-吗啉代乙基)羟基吲哚、7-氮杂羟基吲哚、羟基吲哚-4-氨基甲酸叔丁酯、羟基吲哚-6-氨基甲酸叔丁酯、4-(2-羧基乙基)羟基吲哚、4-正丁基羟基吲哚、4,5-二甲氧基羟基吲哚、6-(甲亚磺酰氨基)羟基吲哚、6-(苯甲酰氨基)羟基吲哚、5-乙氧基羟基吲哚、6-苯基羟基吲哚、6-(2-甲氧基苯-1-基)羟基吲哚、6-(3-甲氧基苯-1-基)羟基吲哚、6-(4-甲氧基苯-1-基)羟基吲哚、5-氨基磺酰基羟基吲哚、5-异丙基氨基磺酰基羟基吲哚、二甲基氨基磺酰基羟基吲哚、5-(N-吗啉代磺酰基)羟基吲哚和4-(2-羟基乙基)羟基吲哚。
以上组合库中的醛优选选自(但不局限于)3-(5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-(5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-(1-苄基-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-(5-甲酰基-1-甲氧基羰基甲基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-[5-甲酰基-1-(3-甲氧基-苄基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、3-(1-环己基甲基-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸甲酯、3-[1-(2,2-二甲基-丙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、1,3,5-三甲基-4-(3-吗啉-4-基-3-氧代-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(2-吗啉-4-基-乙基)丙酰胺、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-苯基丙酰胺、1,3,5-三甲基-4-(3-氧代-3-哌啶-1--基-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛、1,3,5-三甲基-4-(3-氧代-3-吡咯烷-1-基-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-甲氧基-苯基)丙酰胺、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-甲氧基-苯基)丙酰胺、N-(4-氟-苯基)-3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)丙酰胺、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-三氟甲基-苯基)丙酰胺、3-[5-甲酰基-1-(3-甲氧基-苄基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3-(1-环己基甲基-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3--基)丙酸、3-[1-(3-氟-苄基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、3-(1-苄基-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-[1-(4-氟苄基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、3-[1-(4-氟-苄基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3-[1-(3-氟-苄基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛、4-(3-二甲基氨基-丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-甲醛、5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸、3,5-二甲基-4-(4-甲基-哌嗪-1-羰基)-1H-吡咯-2-甲醛、5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺。
本发明另一方面提供用于合成式1的3-吡咯烷基-2-吲哚满酮的方法，该方法包括优选在碱存在下，使式2的羟基吲哚与式3的醛反应于溶剂中。
可与式3的醛反应得到式1的3-吡咯烷基-2-吲哚满酮的式2的羟基吲哚的实例为羟基吲哚本身和取代的羟基吲哚，例如(但不局限于)6-溴羟基吲哚、5-羟基羟基吲哚、5-甲氧基羟基吲哚、6-甲氧基羟基吲哚、5-苯基氨基磺酰基羟基吲哚、4-[2-(2-异丙基苯氧基)-乙基]羟基吲哚、4-[2-(3-异丙基苯氧基)乙基]羟基吲哚、4-[2-(4-异丙基苯氧基)乙基]羟基吲哚、5-氟羟基吲哚、6-氟羟基吲哚、7-氟羟基吲哚、6-三氟甲基羟基吲哚、5-氯羟基吲哚、6-氯羟基吲哚、吲哚-4-羧酸、5-溴羟基吲哚、6-(N-乙酰氨基)-羟基吲哚、4-甲基羟基吲哚、5-甲基羟基吲哚、4-甲基-5-氯羟基吲哚、5-乙基羟基吲哚、6-羟基羟基吲哚、5-乙酰基羟基吲哚、羟基吲哚-5-羧酸、5-甲氧基羟基吲哚、6-甲氧基羟基吲哚、5-氨基羟基吲哚、6-氨基羟基吲哚、4-(2-N-吗啉代乙基)羟基吲哚、7-氮杂羟基吲哚、羟基吲哚-4-氨基甲酸叔丁酯、羟基吲哚-6-氨基甲酸叔丁酯、4-(2-羧基乙基)羟基吲哚、4-正丁基羟基吲哚、4,5-二甲氧基羟基吲哚、6-(甲亚磺酰氨基)羟基吲哚、6-(苯甲酰氨基)羟基吲哚、5-乙氧基羟基吲哚、6-苯基羟基吲哚、6-(2-甲氧基苯-1-基)羟基吲哚、6-(3-甲氧基苯-1-基)羟基吲哚、6-(4-甲氧基苯-1-基)羟基吲哚、5-氨基磺酰基羟基吲哚、5-异丙基氨基磺酰基羟基吲哚、二甲基氨基磺酰基羟基吲哚、5-(N-吗啉代磺酰基)羟基吲哚和4-(2-羟基乙基)羟基吲哚。
可与结构2的羟基吲哚反应的结构3的醛实例为(但不局限于)3-(5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-(5-甲酰基-4-甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-(1-苄基-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-(5-甲酰基-1-甲氧基羰基甲基-2,4-二-甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-[5-甲酰基-1-(3-甲氧基-苄基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、3-(1-环已基甲基-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸甲酯、3-[1-(2,2-二甲基-丙基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、1,3,5-三甲基-4-(3-吗啉-4-基-3-氧代-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(2-吗啉-4-基-乙基)丙酰胺、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-苯基丙酰胺、1,3,5-三甲基-4-(3-氧代-3-哌啶-1-基-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛、1,3,5-三甲基-4-(3-氧代-3-吡咯烷-1-基-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-甲氧基-苯基)丙酰胺、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-甲氧基-苯基)丙酰胺、N-(4-氟-苯基)-3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)丙酰胺、3-(5-甲酰基-1,2,4-三甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-三氟甲基-苯基)丙酰胺、3-[5-甲酰基-1-(3-甲氧基-苄基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3-(1-环己基甲基-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-[1-(3-氟-苄基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、3-(1-苄基-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)丙酸、3-[1-(4-氟苄基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸甲酯、3-[1-(4-氟-苄基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3-[1-(3-氟-苄基)-5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]丙酸、3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛、4-(3-二甲基氨基-丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-甲醛、5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸、3,5-二甲基-4-(4-甲基-哌嗪-1-羰基)-1H-吡咯-2-甲醛、5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺。
该反应可在碱存在下进行。该碱可为有机或者无机碱。如果使用有机碱，其优选为氮碱。有机氮碱的实例包括(但不局限于)二异丙基胺、三甲胺、三乙胺、苯胺、吡啶、1,8-二氮杂二环[5.4.1]十一-7-烯、吡咯烷和哌啶。
无机碱的实例为(但不局限于)氨、碱金属或碱土金属氢氧化物、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐和酰胺。碱金属包括锂、钠和钾而碱土金属包括钙、镁和钡。
在本发明一个优选的实施方案中，当溶剂为质子溶剂例如水或醇时，所述碱为碱金属或碱土金属无机碱，优选为碱金属或碱土金属氢氧化物。
基于已知的普通有机合成原理和在此的公开两者，本领域技术人员将意识到哪种碱最适合于所期待的反应。
其中所述反应进行的溶剂可为质子或质子惰性溶剂，其优选为质子溶剂。“质子溶剂”为具有共价结合于氧或氮原子的氢原子的溶剂，该溶剂有利于给出氢原子使显酸性并因此通过氢键能够与溶质“共享”。质子溶剂实例包括(但不局限于)水和醇类。
“质子惰性溶剂”可为极性的或非极性的，但在两者中的任何一种情况下，不含有酸性氢，因此不具有能与溶质结合的氢。非极性质子惰性溶剂实例为(但不局限于)戊烷、己烷、苯、甲苯、二氯甲烷和四氯化碳。极性质子惰性溶剂实例为氯仿、四氢呋喃、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺。
在本发明优选的实施方案中，所述溶剂为质子溶剂，优选为水或醇如乙醇。
所述反应在高于室温的温度下进行。该温度一般为大约30℃至大约150℃，优选为大约80℃至大约100℃，最优选为大约75℃至大约85℃，其大约是乙醇的沸点。“大约”意指该温度范围优选在所指明的温度的10摄氏℃范围内，更优选在所指明温度的5摄氏℃范围内，和最优选在所指明温度的2摄氏℃范围内。因此，例如“大约75℃”意指75±10℃，优选为75±5℃，和最优选为75±2℃。3．生物化学/药物治疗学本发明另一方面涉及用于通过使PK与本发明化合物或它们的生理学上可接受的盐或前药结触来调控PK催化活性的方法。
在此使用的“PK”指的是受体蛋白酪氨酸激酶(RTKs)、非受体或“细胞”酪氨酸激酶(CTKs)和丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)。
术语“方法”指的是用于实现所给定任务的方式、手段、技术和步骤，包括(但不局限于)已知的或者通过化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的专业人员从已知的方式、手段、技术和步骤易于发展的那些方式、手段、技术和步骤。
如在此使用的术语“调控”或“调节”指的是改变RTKs、CTKs和STKs的催化活性。调控尤其指的是RTKs、CTKs和STKs催化活性的活化，优选指的是依RTK、CTK或STK所接触的化合物或者盐的浓度而定的RTKs、CTKs和STKs催化活性的活化或者抑制，或者更优选指的是RTKs、CTKs和STKs的催化活性的抑制。
如在此使用的术语“催化活性”指的是在RTKs和/或CTKs直接或间接影响下酪氨酸磷酸化的速率或者在STKs直接或间接影响下丝氨酸和苏氨酸磷酸化的速率。
如在此使用的术语“接触”指的是使本发明化合物与靶PK结合到一起，所述化合物以这样的方式能够影响PK的催化活性，即或者直接通过与激酶本身相互作用，或者间接通过与另一个激酶的催化活性依赖的分子相互作用。这样的“接触”可在“体外”即在试管、petri盘等中能够完成，在试管中，接触仅包括一个化合物与重要的PK或者可包括整个细胞。细胞也在细胞培养基盘中维持或生长并在该环境中与化合物接触。在本文中，具体化合物影响与PK相关疾病的能力，即如下定义的化合物的IC50在试图体内用化合物与更复杂的生命有机体之前能够测定。对有机体外部的细胞，存在得到与化合物接触的PKs的多重方法并且这些方法对那些本领域技术人员是熟知的，方法包括(但不局限于)直接的细胞微注射和多种跨膜载体技术。
本发明另一方面是可在体外或体内使用本发明化合物调控PKs的催化活性。
“体外”指的是在人工环境例如(不局限于)在试管或培养基中进行的方法。
如在此使用的“体内”指的是在生命有机体例如(不局限于)小鼠、大鼠或兔子中进行的方法。
本发明的另一方面是，由本发明化合物调控催化活性的蛋白激酶选自受体蛋白酪氨酸激酶、细胞酪氨酸激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶。
本发明一方面是由本发明化合物调控催化活性的受体蛋白激酶选自EGF、HER2、HER3、HER4、IR、IGF-1R、IRR、PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、C-kit、C-fms、Flk-1R、Flk4、KDR/Flk-1、Flt-1、FGFR-1R、FGFR-2R、FGFR-3R和FGFR-4R。
另外，本发明的一方面是，由本发明化合物调控催化活性的细胞酪氨酸激酶选自Src、Frk、Btk、Csk、Abl、ZAp70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk。
本发明另一方面是，由本发明化合物调控催化活性的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶选自CDK2和Raf。
本发明化合物与药学上可接受的载体的药用组合物也为本发明的另一个方面。这样的药用组合物也可含有赋形剂。
用于在有机体中治疗或预防与蛋白激酶有关的疾病的方法，包括给予有机体治疗有效量的化合物、盐或前药，即本发明的3-吡咯烷基-2-吲哚满酮的方法为本发明另一方面。
如在此使用的“PK相关的疾病”、“PK引起的疾病”和“异常PK活性”全部指以不适当的即低下的，或者更常见地是过度的PK催化活性为特征的疾病，其中具体的PK可以是RTK、CTK或STK。不适宜的催化活性能够作为以下的结果出现(1)在不能正常表达PKs的细胞中PK表达，(2)导致不合乎需要的细胞增殖、分化和/或生长的增加的PK表达，或者，(3)导致不合乎需要的细胞增殖、分化和/或生长的减少的降低的PK表达。PK的过度活性指的是基因编码的特殊PK或者产生PK活性水平扩增，其可与细胞增殖、分化和/或生长失调(即由于PK水平增加，细胞失调的一种或多种症状的严重性增加)相关。当然，活性低下是相反的，其中细胞失调的一种或多种症状的严重性随着PK活性水平的降低而增加。
在此使用的术语“预防”、“预防的”和“预防作用”指的是阻碍有机体在第一个地方获到PK相关疾病的方法。
在此使用的术语“治疗”、“治疗的”和“治疗作用”指的是缓解或消除PK介导的细胞失调和/或其伴随症状。特别关于癌症，这些术语单纯意指患有癌症的个体的期望寿命将增加或者将所述疾病的一种或多种症状将减少。
术语“有机体”指的是包括至少一种细胞的生命实体。生命有机体能够像例如单个真核细胞那样简单或者像哺乳动物包括人那样复杂。
如同在此使用的术语“治疗有效量”指的是其将使所治疗的疾病的一种或多种症状缓解至一定程度所给予化合物的量。关于癌症的治疗，治疗有效量指的是具有以下作用的量，包括(1)减少肿瘤的体积，(2)抑制(即延缓到一定程度，优选终止)肿瘤转移，(3)将肿瘤生长抑制到一定程度(即延缓到一定程度，优选为生长终止)和/或(4)将与癌症有关的一种或多种症状缓解至某种程度(或者优选为消除)。
本发明一方面是以上指出的与蛋白激酶有关的疾病选自与受体蛋白酪氨酸激酶有关的疾病、与细胞酪氨酸激酶有关的疾病和与丝氨酸-苏氨酸激酶有关的疾病。
本发明的另一方面是以上指出的与蛋白激酶有关的疾病选自与EGFR有关的疾病、与PDGFR有关的疾病、与IGFR有关的疾病和与flk有关的疾病。
在本发明另一方面，以上指出的与蛋白激酶有关的疾病选自鳞状细胞癌、肉瘤例如卡波济氏肉瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、结肠癌、胃肠癌、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌和神经胶质瘤的癌症。
在本发明另一方面，以上指出的与蛋白激酶有关的疾病选自糖尿病、高增殖疾病、VHL病、再狭窄、纤维变性、牛皮癣、骨关节炎、类风湿性关节炎、炎性疾病和血管发生。
可使用本发明化合物治疗或预防的其它疾病为免疫性疾病例如自身免疫疾病(AIDS)和心血管疾病例如动脉硬化。
作为本发明的一个方面是，调控蛋白激酶催化活性的化学化合物可通过细胞表达的所述蛋白激酶与本发明的3-吡咯烷基-2-吲哚满酮化合物、盐或前药接触并且然后监控所述细胞的作用来鉴定。
“监控”指的是观察或检测化合物与细胞表达的特殊PK接触的作用。观察或检测到的作用可以是在PK的催化活性下细胞表型的变化，或为PK与自然结合配偶体相互作用的变化。用于观察或检测这样作用的技术在本领域中是熟知的。
在本发明的最后一个方面中，以上提到的作用选自细胞表型中的变化或无变化、所述蛋白激酶的催化活性中的变化或无变化或者所述蛋白激酶与自然结合配偶体相互作用的变化或无变化。
“细胞表型”指的是细胞或组织的外在表面或者细胞或组织的生物功能。细胞表型的实例(不局限于)为细胞体积、细胞生长、细胞增殖、细胞分化、细胞存活、编程性细胞死亡和营养摄取和用途。通过在本领域中熟知的技术测量这样的表型的特性是可能的。
“自然结合配偶体”指的是结合于细胞中特殊PK的多肽。自然结合配偶体能够在PK介导的信号传导过程中在信号的传播中起作用。自然结合配偶体与PK相互作用的变化能够作为增加的或减少的PK/自然结合配偶体复合物的浓度来证明其本身的变化，因而在PK介导信号传导的能力中观察到变化。
本发明的另一个方面是，在此描述的化合物、或者它的盐或前药可与其它的化学治疗药物结合用于治疗以上讨论的疾病和失调。例如，本发明化合物、盐或前药可以仅与烷化剂例如氟尿嘧啶(5-FU)联合或者进一步与以下药物联合使用，包括甲酰四氢叶酸；或者其它的烷化剂例如(不局限于)其它的嘧啶类似物如UFT、加西他滨、吉西他滨和阿糖胞苷、烷基磺酸酯例如白消安(用于治疗慢性粒细胞白血病)、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类例如苯佐替派、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类例如六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基醇密胺；氮芥类例如苯丁酸氮芥(用于治疗慢性淋巴细胞白血病、原发性巨球蛋白血症和非何杰金氏淋巴瘤)、环磷酰胺(用于治疗何杰金氏病、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、维耳姆斯氏瘤和横纹肌肉瘤)、雌莫司汀、异环磷酰胺、新氮芥、松龙苯芥和尿嘧啶氮芥(用于治疗原发性血小板增多、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病和卵巢癌)、三嗪类例如达卡巴嗪(用于治疗软组织肉瘤)。
本发明化合物、盐或前药同样可期待在与以下其它的抗代谢化学治疗药物的联合中具有有利的作用，包括例如(不局限于)叶酸类似物如甲氨喋呤(用于治疗急性淋巴细胞白血病、绒毛膜癌、蕈样肉芽肿乳腺癌、头和颈癌、骨原性肉瘤)和蝶罗呤、嘌呤类似物例如巯基嘌呤和已发现用于治疗急性粒细胞、急性淋巴细胞和慢性粒细胞白血病的硫代乌嘌呤。
本发明化合物、盐或前药也期待在与以下基于天然产物的化学治疗药物的联合使用中证明是有效的，包括例如(不局限于)长春生物碱如长春碱(用于治疗乳腺和睾丸癌)、长春新碱和长春地辛、表鬼臼毒素例如依托泊甙和替尼泊甙，两者都用于治疗睾丸癌和卡波西氏肉瘤、抗生素类化学治疗药例如柔红霉素、多西比星、表柔比星、丝裂霉素(用于治疗胃、颈、结肠、乳腺、膀胱和胰的癌症)、放线菌素D、temozolomide、普犬霉素、博来霉素(用于治疗皮肤癌、食管和泌尿生殖道癌)和酶化学治疗药物例如L-天冬酰胺酶。
除了以上提到之外，本发明化合物、盐或前药可期待在与以下药物的联合使用中具有有益的作用，包括铂配位复合物(顺铂等)、取代的脲例如羟基脲、甲基肼衍生物例如丙卡巴肼、肾上腺类皮质激素抑制剂例如对氯苯邻氯苯二氯乙烷、氨鲁米特、激素和激素拮抗剂例如肾上腺皮质激素(例如泼尼松)、孕激素(例如己酸孕酮)、雌激素(例如己烯雌酚)、抗雌激素例如他莫昔芬、雄激素例如丙酸睾酮和芳香酶抑制剂(例如anastrozole)。
最后，在与米托蒽醌或紫杉醇联合使用中，期望本发明化合物的组合可特别有效地用于治疗实体肿瘤癌症或者白血病例如(不局限于)急性骨髓内产生的(非淋巴细胞)白血病。
期待可与以上一种或多种化学治疗药物联合使用的具有有效作用的本发明的优选化合物为3-[2,4-二甲基-5-(2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]丙酸。
本发明详细描述1．表格的简短描述表1显示本发明一些举例说明的化合物的化学结构和生物活性。化合物的编号对应于实施例部分的实施例编号。即表1中化合物1的合成在实施例1中描述。所使用的生物分析在以下详细描述。结果以IC50值报道，即与在不加入受试化合物的对照组的PTK活性相比较，引起靶PKT活性50％变化的受试化合物的微摩尔(μM)浓度。所显示的结果特别表明引起靶PTK活性50％减少所需要的受试化合物的浓度。在表1中呈现的化合物仅为举例说明并且不以任何方式构成对本发明范围的限制。
表1 表2
表2显示本发明一些另外的化合物的化学结构。如同在表1中一样，化合物的编号对应于实施例编号。以上生物分析的一般描述也应用于在表2中显示的生物分析。2．适应症/靶疾病由本发明化合物调控催化活性的PKs包括蛋白酪氨酸激酶(其具有两种类型受体酪氨酸激酶(RTKs)和细胞酪氨酸激酶(CTKs))和丝氨酸-苏氨酸激酶(STKs)。经细胞外与特殊生长因子(配体)相互作用，随后经受体二聚化作用，短暂刺激内在蛋白酪氨酸激酶活性和磷酸化作用启动RTK介导的信号传导。由此产生细胞内信号传导分子的结合位点并导致与一系列细胞质信号分子形成复合物，以利于适宜的细胞应答(例如细胞分裂、细胞外微环境的代谢作用等)。参见Schlessinger和Ullrich,1992，神经元，9:303-391。
已显示在生长因子受体上酪氨酸磷酸化作用位点作为对SH2(src同源物)信号分子域的高亲和性接合位点起作用。Fantle等，1992，细胞69:413-423,Songyang等，1994,Mol.Cell.Biol.14:2777-2785),Songyang等，1993，细胞72:767-778，和Koch等，1991，科学252:668-678。已鉴定与RTKs有关的几种细胞内底物蛋白质。它们可分为两个主要的组(1)具有催化域的底物和(2)缺乏这样的域的底物但是其用作接合体并与催化的活性分子相关，Songyang等，1993，细胞72:767-778。由紧绕着磷酸化酪氨酸残基的氨基酸残基确定受体和它们的底物的SH2域之间的相互作用的特异性。在SH2域和在围绕特殊受体上的磷酸酪氨酸残基的氨基酸序列之间的结合亲合性之间的差异与在它们的底物磷酸化作用模式(profiles)中所观察到的差异相一致。Songyang等，1993，细胞72:767-778。这些观察提示不仅通过其表达的模式和配体可利用性而且通过特殊受体活化的下游信号传导途径的阵列测定每种RTK的功能。因此，磷酸化作用提供重要的调控步骤，其确定经特异性生长因子受体以及分化因子受体募集的信号途径的选择性。
主要是细胞溶胶的STKs经常作为对PTK事件的下线应答来影响细胞内部的生物化学。STKs参与启动DNA合成并随后有丝分裂导致细胞增殖的信号过程。
因此，在其它应答中PK信号传导导致细胞增殖、分化、生长和代谢。异常的细胞增殖可导致广泛的失调和疾病，包括瘤形成例如癌、肉瘤、成细胞胶质瘤和血管瘤的发展，疾病例如白血病、牛皮癣、动脉硬化、关节炎和糖尿病视网膜病和其它的与未控制的血管发生和/或血管形成有关的疾病。
为了实践本发明，并不需要准确理解本发明化合物抑制PKs的机制。然而，并不限制于任何特别的机制或理论，人们确信化合物在PKs的催化区与氨基酸相互作用。PKs一般具有一个两裂片结构，其中ATP以乎结合在氨基酸被保持在PKs之间区域中两裂片之间的裂缝中。相信PKs抑制剂在前述ATP结合于PKs的相同一般区域上经非共价相互作用例如氢键、范德华力和离子相互作用来结合。更详细地说，人们认为本发明化合物的2-吲哚满酮成分通过ATP的腺嘌呤环结合在一般正常占据的空间上。然后特别分子对特定PK的特异性可作为在2-吲哚满酮核上多种取代基和对特定PKs的特异性的氨基酸域之间的另外的相互作用的结果出现。因此，不同的吲哚满酮取代基可有助于优选结合到特定的PKs上。选择在不同ATP(或者其它的核苷酸)结合位点上具有活性的化合物的能力使得本发明化合物用于针对具有这样位点的任何蛋白质。在此公开的化合物可因此具有作为用于这样蛋白的体外试验以及通过与这样的蛋白相互作用呈现体内治疗作用的用途。
另一方面，通过与本发明化合物接触调控其催化活性的蛋白激酶为蛋白酪氨酸激酶，更详细地讲，它是受体蛋白酪氨酸激酶。在其催化活性能够由本发明化合物或者它们的盐调控的受体蛋白酪氨酸激酶当中，包括有(不局限于)EGF、HER2、HER3、HER4、IR、IGF-1R、IRR、PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、C-Kit、C-fms、Flk-1R、Flk4、KDR/Flk-1、Flt-1、FGFR-1R、FGFR-2R、FGFR-3R和FGFR-4R。
其催化活性通过与本发明化合物或者它们的盐或前药接触调控的蛋白酪氨酸激酶也能够为非受体或细胞蛋白酪氨酸激酶(CTK)。因此，可通过与本发明化合物或盐接触来调控CTKs例如(不局限于)Src、Frk、Btk、Csk、Abl、ZAp70、Fes、Fps、Fak、Jak、Ack、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr和Yrk的催化活性。
可与本发明化合物接触以调控它们的催化活性的另一组PKs为丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶例如(不局限于)CDK2和Raf。
另一方面，本发明涉及通过将治疗有效量的本发明化合物或者它们的盐或前药给予有机体来治疗或预防PK相关疾病的方法。
将含有本发明化合物或者它们的盐或前药的药用组合物给予有机体以用于预防或治疗PK相关疾病也是本发明的一个方面。
本发明因此涉及通过影响RTKs、CTKs和/或STKs的酶活性来调控PK信号传导，进而干扰由这样的蛋白传导的信号的化合物。更详细地讲，本发明涉及调控RTK、CTK和/或STK介导的信号传导途径作为治疗方法以治愈许多种类的实体肿瘤，包括(但不局限于)癌、肉瘤包括卡波济氏肉瘤、成红细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、星形细胞瘤、黑素瘤和成肌细胞瘤的化合物。本发明也期待治疗或预防非实体肿瘤的癌症例如白血病。适应症可包括(但不局限于)脑癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、血癌、肺癌和骨癌。
与在此描述的化合物可用于预防、治疗和研究的不适当的PK活性相关的多种类型疾病的另外实例(不局限于)为细胞增殖失调、纤维变性疾病和代谢紊乱。
可由本发明预防、治疗或进一步研究的细胞增殖失调包括癌症、血管增生性疾病和肾小球膜细胞增殖失调。
血管增生性疾病指的是与异常血管形成(血管形成)和血管发生(血管的扩展)有关的疾病。当血管形成和血管发生在多种正常生理过程例如胚胎发育、黄体形成、伤口愈合和器官再生中起重要作用时，它们也在癌症发展中起关键性作用，在那儿它们引起保持肿瘤存活所需的新的毛细血管的形成。血管增生性疾病的其它实例包括其中新的毛细血管侵袭关节并破坏软骨的关节炎和眼科疾病，如其中视网膜中新的毛细血管侵袭玻璃体、出血并引起失明的糖尿病视网膜变性。
高亲合性结合于VEGF的两种结构相关的RTKs已被鉴定为fms样酪氨酸1受体(fit-1)(Shibuya等，1990，癌基因，5:519-524；De Vries等，1992，科学，255:989-991)和也被称作VEGF-R2的KDR/FLK-1受体。已报道血管内皮生长因子(VEGF)是具有体外内皮细胞生长促进活性的内皮细胞特异性有丝分裂原。Ferrara和Henzel,1989,Biochein.Biophys.Res.Comm.,161:851-858；Vaisman等，1990,J.Biol.Chem.,265:19461-19566。在U.S.申请系列第08/193,829号、08/038,596号和07/975,750号中阐明的信息强烈提示VEGF不仅造成内皮细胞增殖而且也是正常和病理的血管发生的主要调节剂。一般参见Klagsburn和Soker,1993,Current Biology,3(10)699-702；Houck等，1992,J.Biol.Chem.,267:26031-26037。
正常的血管形成和血管发生在多种生理过程例如胚胎发育、伤口愈合、器官再生和雌性生殖过程例如排卵期间黄体中的卵泡发生和妊娠后胎盘生长中起重要作用。Folkman和Shing,1992,J.BiologicalChem.,267(16):10931-34。未控制的血管形成和/或血管发生与疾病例如糖尿病以及与依赖血管形成而生长的噁性实体肿瘤有关。Klagsburn和Soker,1993,Current Biology,3(10):699-702；Folkham,1991,J.Natl.CancerInst.,82:4-6；Weidner等，1991,New Engl.J.Med.,324:1-5。
VEGF在血管发生和血管形成期间的内皮细胞增殖和转移的推测作用表明KDR/FLK-1受体在这些过程中的重要作用。疾病例如糖尿病(Folkman,198，在第11届血栓和止血会议中(Verstraeta等，编辑)，第583-596页，Leuven大学出版社，Leuven)和关节炎以及噁性肿瘤生长可起因于未控制的血管发生。参见例如Folkman,1971,N.Engl.J.Med.,285:1182-1186。VEGF特异性结合的受体对调节和调控血管形成和/或血管发生和多种与由这样的过程引起的异常细胞生长有关的严重疾病是重要和有效的治疗靶。Plowman，等1994,DN&P,7(6):334-339。更详细地讲，KDR/FLK-1受体在新生血管形成中的高度特异性作用使其成为选择的靶向用于治疗癌症和其它与血管未控制的形成有关疾病的治疗方法。
因此，本发明一个方面涉及能够调节和/或调控酪氨酸激酶信号传导，包括KDR/FLK-1受体信号传导以抑制或促进血管发生和/或血管形成的化合物，即当通过配体例如VEGF活化时，化合物抑制、预防或干扰经KDR/FLK-1传导的信号。尽管人们相信本发明化合物沿着酪氨酸激酶信号传导途径作用于受体或其它的成分，它们也可直接作用于因未控制的血管发生形成的肿瘤细胞。
尽管人和鼠配对体(counterparts)属“flk-Ⅰ”受体的命名法是不同的，它们在许多方面是可互换的。鼠受体flk-1和它的人配对体KDR在细胞内域中分享93.4％的序列同源性。同样，鼠FLK-Ⅰ如同小鼠VEGF那样用相同的亲和性结合于人VEGF。并且相应地由衍生于两种物种之一的配体激活。Millauer等，1993，细胞，72:835-846；Quinn等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7533-7537。当在293种细胞(人胚肾成纤维细胞)中共表达时，Flk-1也与之有关，随后酪氨酸使人RTK底物(例如PLC-γ或p85)磷酸化。
因此依赖FLK-1受体的模型可直接应用以了解KDR受体。例如，在鉴定调控鼠信号传导途径的化合物的方法中，鼠FLK-1受体的用途是直接可用于鉴定可用来调控人信号传导途径的化合物，即其调节涉及KDR受体的活性。因此，在适宜的体内模型中，可以证实在体外鉴定为KDR/FLK-1抑制剂的化学化合物。已证实体内小鼠和大鼠动物模型两者对测验作用于KDR/FLK-1诱导的信号传导途径的药物的临床有效性具有优良价值。
因此，本发明一方面涉及通过影响KDR/FLK-1受体的酶活性来调节、调控和/或抑制血管形成和/或血管发生并干扰由KDR/FLK-1传导的信号的化合物。本发明另一方面涉及调节、调控和/或抑制KDR/FLK-1介导的信号传导途径作为治疗以下多种实体肿瘤的治疗方法的化合物，包括(但不局限于)成细胞胶质瘤、黑素瘤和卡波济氏肉瘤、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和表皮样癌。另外，数据提示给予抑制KDR/FLK-1介导的信号传导途径的化合物也可用于治疗血管瘤、再狭窄和糖尿病视网膜变性。
本发明另一方面涉及通过其它受体介导途径包括含有flt-1受体的途径抑制血管形成和血管发生。
受体酪氨酸激酶介导的信号传导由细胞外与特异性生长因子(配体)相互作用，随后经受体二聚化作用、短暂刺激内在蛋白酪氨酸激酶活性及自动磷酸化作用来启动。因此产生用于细胞内信号传导分子的结合位点，这导致形成与一系列细胞质信号分子的复合物，其有利于适当的细胞应答，例如细胞分裂和对细胞外微环境的代谢作用。参见Schlessinger和Ullrich,1992，神经元，9:1-20。
KDR/FLK-1的细胞内区域与PDGF-β受体(50.3％同源性)和/或相关的flt-1受体的细胞内区域的密切同源性表明导入重叠信号传导途径。例如，对PDGF-β受体而言，src家族(Twamley等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7696-7700)的成员，磷脂酰肌醇-3’-激酶(Hu等，1992,Mol.Cell.Biol.,12:981-990)、磷脂酶cγ(Kashishihian和Cooper,1993,Mol.Cell.Biol.,4:49-51)、ras-GTP酶-活化蛋白(Kashishihian等，1992,EMBO J.,11:1373-1382)、PTP-ID/syp(Kazlauskas等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,10 90:6939-6943)、Grb2(Arvidsson等，1994,Mol.Cell.Biol.,14:6715-6726)和接合体分子Shc和Nck(Nishimura等，1993,Mol.Cell.Biol.,13:6889-6896)已显示出结合于包括不同自动磷酸化位点的区域。一般参见Claesson-Welsh,1994,Prog.Growth Factor Res.,5:37-54。因此，可能是经KDR/FLK-1活化的信号传导途径包括ras途径(Rozakis等，1992，自然，360:689-692)、PI-3′-激酶、src介导的和plcγ介导的途径。这些途径的每一个在内皮细胞中可在KDR/FLK-1的血管发生和/或血管形成的作用上起关键作用。结果，本发明的另一方面涉及在此描述的调控如由这些途径控制这样过程的血管发生和血管形成的有机化合物的用途。
相反，也涉与血管皱缩、收缩或闭塞相关的疾病例如再狭窄及并可通过本发明方法治疗或预防。
纤维变性疾病指的是细胞外基质的异常形成。纤维变性疾病的实例包括肝硬变和肾小球膜细胞增殖疾病。肝硬变的特征在于导致肝瘢痕形成的细胞外基质成分增加。通过病毒感染如肝炎也能够引起导致肝瘢痕的细胞外基质成分增加。脂细胞在肝硬变中似乎起主要作用。其它有关的纤维变性疾病包括动脉粥样硬化。
肾小球膜细胞增殖疾病指的是由肾小球膜细胞的异常增殖引起的疾病。肾小球膜增殖疾病包括多种人的肾疾病例如肾小球性肾炎、糖尿病性肾病变和噁性肾硬化以及这样的疾病如血栓性微血管造影术综合征、移植排斥反应和肾小球病。RTK PDGFR已参与肾小球膜细胞增殖的维持。Floege等，1993,Kidney International 43:47S-54S。
许多癌症为细胞增殖疾病并且如同先前提到的那样，PKs与细胞增殖疾病有关。因此，PKs如RTK家族的成员与癌症的发展有关是不令人惊奇的。像EGFR(Tuzi等，1991,Br.J.Cancer 63:227-233,Torp等，1992,APMIS 100:713-719)、HER2/neu(Slamon等，1989，科学244:707-712)和PDGF-R(Kumabe等，1992，癌基因，7:627-633)一样，这些受体中的一些在许多肿瘤中过度表达和/或经自分泌环持续活化。事实上，在大多数普通的和严重的癌症中，已证实这些受体过度表达(Akbasak和Suner-Akbasak等，1992,J.Neurol.Sci.,111:119-133,Dickson等，1992,Cancer Treatment Res.61:249-273,Korc等，1992,J.Clin.Invest.90:1352-1360)和自分泌环状结构(Lee和Donoghue,1992,J.Cell.Biol.,118:1057-1070,Korc等，同上，Akbasak和Suner-Akbasak,同上)。例如，EGFR与鳞状上皮细胞癌、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、头和颈癌、肺癌和膀胱癌有关。HER2与乳腺、卵巢、胃、肺、胰腺和膀胱癌有关。PDGFR与成胶质细胞瘤和黑素瘤以及肺、卵巢和前列腺癌有关。RTK c-met也与噁性肿瘤形成有关。例如，在其它的癌症中，c-met与结肠直肠的、甲状腺、胰、胃和肝细胞癌和淋巴瘤有关。另外c-met与白血病有关。在患有何杰金氏病和伯基特氏病的患者中也检测到c-met基因的过度表达。
除了涉及营养维持和Ⅱ型糖尿病以外，IGF-IR也与几种类型的癌症有关。例如，IGF-Ⅰ作为自分泌生长刺激因子与几种肿瘤类型如人乳腺癌细胞(Arteaga等，1989,J.Clin.Invest.84:1418-1423)和小肺肿瘤细胞有关(Macauley等，1990,Cancer Res.,50:2511-2517)。另外，在整体参与神经系统的正常生长和分化期间，IGF-IR也似乎为人神经胶质瘤的自分泌刺激因子。Sandberg-Nordqvist等，1993,Cancer Res.,53:2475-2478。IGF-IR和它的配体在细胞增殖中的重要性进一步通过以下事实得到支持，即通过IGF-Ⅰ刺激生长在培养基中的多种细胞类型(成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T-淋巴细胞、骨髓细胞、软骨细胞和成骨细胞(骨髓的干细胞))。Goldring和Goldring,1991，真核基因表达，1:301-326。在一系列最近的出版物中，Baserga提示IGF-IR在转化的机制中起中心作用并且如同这样的转化能够成为优选的靶，用于治疗性介入广泛范围的人噁性肿瘤谱。Baserga,1995,Cancer Res.,55:249-252。Baserga等，1994,Cell,79:927-930.Coppola,1994,Mol.Cell.Biol.,14:4588-4595。
STKs已涉及多种类型的癌症，包括值得注意的乳腺癌(Cance，等，Int.J.Cancer,54:571-77(1993))。
异常PK活性与疾病之间的关系并不局限于癌症。例如，RTKs与疾病例如牛皮癣、糖尿病、子宫内膜异位症、血管发生、动脉硬化粥样斑块发展、阿尔茨海默氏病、yon Hippel-Lindau病、表皮过度增殖、神经退化疾病、与年龄相关的肌肉退化和血管瘤有关。例如已表明EGFR是角膜和皮肤伤口愈合的原因。表明在胰岛素-R和IGF-1R中的缺陷是Ⅱ型糖尿病的原因。在Plowman等，1994,DN&P7:334-339中阐明特异性RTKs与它们的治疗适应症之间更完全的相关性。
如同先前提到的那样，不仅RTKs而且CTKs包括(但不局限于)src、abl、fps、yes、fyn、lyn、lck、blk、hck、fgr和yrk(由Bolen等，1992,FASEB J.,6:3403-3409综述)也与增殖和代谢信号传导途径有关并因此能够被期待，且已显示出参与多种本发明所指明的PTK介导的疾病。例如，突变的src(v-src)已在鸡中显示为一种肿瘤蛋白(pp60v-src)。此外，它的细胞同源物原肿瘤基因pp60c-src传递多种受体的肿瘤信号。在肿瘤中过度表达的EGFR或HER2/neu导致pp60c-src的成分活化，其为噁性肿瘤细胞的特性但在正常细胞中是不存在的。另一方面，小鼠在c-src表达上的缺陷呈现骨硬化的表型，表明c-src在破骨细胞功能上的关键参与作用并可能与相关的疾病有联系。
相似地，Zap70已参与可与自身免疫失调有关的T-细胞信号。
STKs与炎症、自动免疫疾病、免疫应答和过度增殖疾病如再狭窄、纤维变性、牛皮癣、骨关节炎和类风湿性关节炎有关。
PKs也参与胚胎植入。因此，本发明化合物可提供预防这样的胚胎植入的有效方法并由此用作生育控制药物。
最后，目前猜测RTks和CTKs两者与超免疫失调有联系。
鉴定调控以上讨论的一种或多种蛋白激酶的催化活性的化学化合物的方法为本发明另一个方面。该方法包括使表达要求的蛋白激酶的细胞与本发明化合物(或者其盐或前药)接触并监测化合物对细胞的任何作用。可通过裸眼或通过使用仪器观察到该作用，细胞表型的变化或不变化。受到监控的细胞表型上的变化或不变化可为例如(不局限于)细胞中的蛋白激酶催化活性的变化或不变化或者蛋白激酶与自然结合配偶体相互作用的变化或不变化。
多种举例说明的本发明化合物对几种PTKs的作用的实例显示在表1和2和以下生物实施例部分中。提出的化合物和数据不以任何方式构成对本发明范围的限制。5．药用组合物和用途本发明化合物、它们的前药或者所述化合物或它的前药两者中任何一种生理上可接受的盐可以给予病人或以其中前述物质与适宜的载体或赋形剂混合的药用组合物的形式给予。用于配制和给予药物的技术可在“雷明顿氏药剂学”，Mack出版公司，Easton,PA，最新一版中发现。给药途径如在此使用的“给药”或“给予”指的是将本发明化合物、盐或前药或者含有本发明化合物、盐或前药的药用组合物传递给有机体用于预防或治疗PK相关疾病的目的。
适宜的给药途径可包括(不局限于)口服、直肠、透过粘膜或肠道给药或者肌内、皮下、髓内、鞘内、直接心室内、静脉、玻璃体内、腹膜内、鼻内或眼内注射。给药的优选途径为口服和非肠道。
或者，人可以局部而非全身的方式给予所述化合物，例如，经常以贮库或缓释制剂的形式将化合物直接注射到实体瘤中。
此外，人们可以靶向药物传递系统例如以肿瘤特异性抗体包被的脂质体给予药物。这些脂质体将选择性靶向于肿瘤并由肿瘤吸收。组合物/制剂可通过本领域熟知的方法例如借助常规混合、溶解、制粒、包被(dragee-making)、研磨、乳化、包囊、包埋或冷冻干燥的方法制备本发明的药用组合物。
使用一种或多种生理学上可接受的载体，包括便于将活性化合物加工成为药学上可使用的制剂的赋形剂和辅剂，可以常规方法配制用于本发明的药用组合物。依所选择的给药途径来确定适当的制剂。
对注射而言，将本发明化合物配制成水溶液剂，优选在生理学上相适配的缓冲液如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。对透膜给药，可在制剂中使用适于穿过屏障的渗透剂。这样的渗透剂一般为本领域已知的。
对口服给药而言，通过使活性化合物与本领域已知的药学上可接受的载体混合，能够配制化合物。这样的载体使本发明化合物能够配制成片剂、丸剂、糖锭剂、糖衣药丸、胶囊剂、溶液剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等，它们由患者用于口服摄取。使用固体赋形剂，任选将生成的混合物研磨，并加工颗粒混合物，加入其它适宜的辅料(如果要求)后，得到片剂或糖衣药丸芯，其能够制备用于口服用途的药用制剂。有用的赋形剂尤其为填充剂如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇、纤维素制剂如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉和其它的材料例如明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果要求，可加入崩解剂如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸。也可使用盐如藻酸钠。
用适宜的包被提供糖衣药丸芯。为此目的，可使用浓的糖溶液，其可任选含有阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆用溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入到片剂或糖衣药丸包被中，以用于鉴定或区别不同的活性化合物剂量的组合。
能够口服使用的药用组合物包括以凝胶组成的推入配合的胶囊剂以及用明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇组成的软密封胶囊剂。推入配合的胶囊剂能含有与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于适宜的液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。也可将稳定剂加入到这些制剂中。
对吸入给药，使用加压填充或雾化器和适宜的抛射剂例如(不局限于)二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳，以气溶胶喷雾剂的形式便利地传递本发明用途的化合物。在加压的气溶胶情况下，可通过提供传递计算量的阀来控制该剂量单位。例如用于吸入剂或吹入剂的明胶的胶囊和药筒可配制成含有化合物和适宜的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
也可将化合物配制成用于非肠道给药的制剂，例如，通过大丸剂注射或者持续输注。用于注射的制剂可以单位剂型的形式存在，例如以安瓿或以含有加入防腐剂的多剂量容器形式存在。这些组合物可采取这样的形式如在油或水媒介物中的混悬液、溶液剂或乳液，并可含有制剂材料如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于非肠道给药的药用组合物包括水溶性形式的水溶液，例如(不局限于)活性化合物的盐。另外，在亲脂性媒介物中可制备活性化合物的混悬液。适宜的亲脂性媒介物包括脂肪油如芝麻油，合成脂肪酸酯如油酸乙酯和甘油三酯或材料例如脂质体。水注射混悬液可含有增加混悬液粘度的物质如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。该混悬液也可任选含有适宜的稳定剂和/或增加化合物溶解性的试剂以用于制备高浓度溶液。
或者，所述活性成分可以在临用前与适宜的媒介物如灭菌、无热原水构成的粉末形式存在。
使用例如常规栓剂基质如可可豆脂或其它的甘油酯，也可将所述化合物配制成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂。
除了先前描述的制剂以外，也可将化合物配制成贮库制剂。可经植入(例如，皮下或肌内)或者经肌内注射给予这样长效作用的制剂。对于这种给药途径，本发明化合物可与适宜的聚合性或疏水性材料(例如，以与药学上可接受的油一起的乳剂)一起，与离子交换树脂一起配制而成，或配制成微溶性的衍生物例如(不局限于)微溶的盐。
用于疏水性本发明化合物的药用载体的非限制性实例为共溶剂系统，包括苄醇、非极性表面活性剂、可与水混溶的有机聚合物和水相如VPD共溶剂系统。VPD为3％w/v苄醇、8％w/v非极性表面活性剂多乙氧基醚80TM和65％w/v聚乙二醇300的溶液，用无水乙醇加至体积。VPD共溶剂系统(VPD∶D5W)包括用5％葡聚糖水溶液1∶1稀释的VPD。该共溶剂系统很好溶解疏水性化合物，并在全身给药时其本身产生低的毒性。自然，可在较大范围内改变这样的共溶剂系统的比例而不会破坏其溶解性和毒性性质。此外，可改变该共溶剂系统的成份例如，其它的低毒性非极性表面活性剂可被用来替代多乙氧基醚80TM，可改变聚乙二醇的部分体积，其它的生物上可适配的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮可替代聚乙二醇，并且其它的糖类或多糖可替代葡聚糖。
另外，可使用用于疏水性药用化合物的其它传递系统。脂质体和乳剂为用于疏水性药物的传递媒介物或载体的熟知的实例。另外，尽管经常以更高的毒性为代价，也可使用一定的有机溶剂如二甲基亚砜。
另外，使用缓释系统如含有治疗药物的固体疏水聚合物的半透基质可传递化合物。多种缓释材料已被确定并且为本领域技术人员熟知。依它们的化学性质而定，缓释胶囊剂可释放化合物几周直到超过100天。依治疗药物的化学性质和生物稳定性而定，可使用另外的用于稳定蛋白质的策略。
在此药用组合物也包括适宜的固体或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的实例包括(但不局限于)碳酸钙、磷酸钙、多种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。
本发明许多调控PK的化合物作为生理学上可接受的盐可被提供，其中权利要求保护的化合物可形成负或正荷电粒子。其中化合物形成正荷电部分的盐的实例包括(不局限于)季铵(本文另外定义)、盐类如盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐，其中季铵基团的氮原子为所选择的已与适当的酸反应的本发明化合物的氮。其中本发明化合物形成负荷电粒子的盐包括(不局限于)通过化合物的羧酸基团与适当的碱反应形成的钠盐、钾盐、钙盐和镁盐(例如，氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钙(Ca(OH))2等)。剂量适宜用于本发明的药用组合物包括其中包含足够达到预期目的即调控PK活性或治疗或预防PK相关疾病的量的活性成分的组合物。
更详细地讲，治疗有效量意指化合物有效预防、缓解或改善疾病症状或者延长受治疗者的存活率的一定的量。
治疗有效量的确定处于该领域技术人员的能力范围内，尤其按照在此提供的详细的公开。
对在本发明方法中使用的任何化合物而言，由细胞培养测定能够初步估算治疗有效量或剂量。然后，配制该剂量用于动物模型，以得到循环的浓度范围，该循环的浓度包括如在细胞培养基上测定的IC50(即取得PK活性的半数最大抑制的受试化合物的浓度)。这样的信息然后能够用于更准确的测定对人有用的剂量。
通过在细胞培养基或实验动物中的标准药用方法，例如通过测定研究目标化合物的IC50和LD50(两者于本文中另外讨论)，能够测定在此描述的化合物的毒性和治疗效果。从这些细胞培养试验和动物研究中得到的数据能够用于配制用于人的一定范围的剂量。依使用的剂型和使用的给药途径而定，可改变剂量。根据患者的疾病，医师能够选择准确的制剂、给药途径和剂量。(参见例如Fingl，等，1975，在“治疗学的药理基础”中，第1章第1页)。
可各自调整剂量和给予间隔的时间，以提供足以维持激酶调控作用的活性物质的血浆水平。这些血浆水平称作最小有效浓度(MECs)。对每个化合物而言，所述MEC将是不同的，但是从体外数据能够估计，例如可使用在此描述的试验，确定达到激酶50-90％抑制所必需的浓度。必需达到MEC的剂量将依个体性质和给药途径而定。HPLC测定或生物测定能够用于测定血浆浓度。
使用MEC值也可确定剂量间隔。应使用维持血浆水平高于MEC10-90％，优选为30-90％之间，并且最优选为50-90％之间的时间方案给予化合物。
在局部给药或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可与血浆浓度无关并且本领域其它的已知的方法可用来测定正确的剂量和间隔。
当然，所给予的组合物的量将依受治疗者、疾病的严重性、给药方式、主治医师的判断等而定。包装如果要求，所述组合物可用包装或分配器装置例如FDA批准的药剂盒存在，其可包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如所述包装可包括金属或塑料箔，如起泡包装。包装或分配器装置可附有用于服药方法的说明书。所述包装或分配器也可附有与通过管理药品制造、使用或销售的政府机构开处方的形式存在的容器有关的注意事项，该注意事项为由组合物形式或人用或兽用给药的机构批准的反映。这样的注意事项例如可具有经美国食品与药品管理局批准的标签，以作为处方药或批准的产物的插页。也可制备以适配的药用载体配制的包含本发明化合物的组合物，放置在适当的容器中，并贴上用于治疗适应症的标签。在标签上指明的适宜疾病可包括治疗肿瘤、抑制血管发生、治疗纤维变性、糖尿病等。6．合成使用化学领域的熟知技术，可易于合成本发明化合物以及前体2-羟基吲哚类和醛类。本领域技术人员将意识到用于形成本发明化合物的其它合成途径是可以利用的，并通过实施例(但不局限于)提供如下。A．一般合成方法。
可使用以下一般方法学来制备本发明化合物
将适当取代的2-羟基吲哚(1当量)、适当取代的醛(1.2当量)和哌啶(0.1当量)与乙醇(1-2ml/mmol2-羟基吲哚)混合，并然后在90℃下将该混合物加热3至5小时。冷却后，将反应混合物浓缩并酸化至pH3。把形成的沉淀过滤，用水洗至pH7并然后用冷的乙醇、乙酸乙酯和/或己烷洗涤且真空干燥，得到目标化合物。可任选通过层析法进一步纯化所述产物。B.2-羟基吲哚类以下实施例为2-羟基吲哚前体至本发明化合物的代表性合成。使用以上一般合成方法或以下部分C中举例说明的方法，通过与适当取代的吡咯醛反应，这些2-羟基吲哚类将形成权利要求保护的化合物。应理解的是以下合成对合成方法或其合成被举例说明的羟基吲哚类并不构成限制。5-氨基-2-羟基吲哚在甲醇中，将5-硝基-2-羟基吲哚(6.3g)经10％钯炭氢化，得到3.0g(60％收率)的为白色固体的标题化合物。5-溴-2-羟基吲哚将在20mL乙腈中的2-羟基吲哚(1.3g)冷却至-10℃并在搅拌下缓慢加入2.0g N-溴代琥珀酰亚胺。在-10℃下，将反应物搅拌1小时并在0℃下搅拌2小时。收集沉淀，用水洗涤并干燥，得到1.9g(90％收率)的标题化合物。4-甲基-2-羟基吲哚搅拌下，将在20mL无水乙醚中的草酸二乙酯(30mL)加入到悬浮在50mL无水乙醚中的乙醇钾(19g)中。在冰浴上，将混合物冷却并缓慢加入在20mL无水乙醚中的20mL 3-硝基-邻二甲苯。将粘稠的深红色混合物加热至回流反应0.5hr，浓缩至深红色固体，并用10％氢氧化钠处理直到几乎所有的固体溶解。用30％过氧化氢处理深红色混合物直到红色变为黄色。或者用10％氢氧化钠和30％过氧化氢处理该混合物直到深红色不再存在。滤除固体并将滤液用6N盐酸酸化。通过真空过滤收集生成的沉淀，用水洗涤，并真空干燥，得到9.8g(45％收率)的灰白色固体的2-甲基-6-硝基苯基乙酸。在甲醇中，将固体经10％钯炭氢化，得到9.04g白色固体的标题化合物。7-溴-5-氯-2-羟基吲哚将5-氯-2-羟基吲哚(16.8g)和19.6g的N-溴代琥珀酰亚胺悬浮于140mL乙腈中并回流3小时。当回流2小时时，薄层层析法(硅胶，乙酸乙酯)显示5-氯-2-羟基吲哚或N-溴代琥珀酰亚胺(Rf0.8)、产物(Rf0.85)和第二个产物(Rf0.9)，再回流另1小时之后其比例不变化。将混合物冷却至10℃，真空过滤收集沉淀，用25 mL乙醇洗涤并在漏斗中抽吸干燥20分钟，得到14.1g湿的产物(56％收率)。将固体悬浮于200mL变性乙醇中，并通过搅拌浆洗且回流10分钟。将混合物在冰浴上冷却至10℃。通过真空过滤收集固体产物，用25mL乙醇洗涤并在40℃下真空干燥，得到12.7g(51％收率)的7-溴-5-氯-2-羟基吲哚。5-氟-2-羟基吲哚将5-氟靛红(8.2g)溶于50mL水合肼中并回流1.0小时。然后将反应混合物倾入冰水中。之后过滤沉淀，用水洗涤并于真空烘箱中干燥，得到标题化合物。5-硝基-2-羟基吲哚将2-羟基吲哚(6.5g)溶于25mL浓硫酸中并将混合物维持在-10至-15℃期间，滴加入2.1mL发烟硝酸。加入硝酸后，在0℃下，将反应混合物搅拌0.5小时并倾入到冰水中。通过过滤收集沉淀，用水洗涤并从50％乙酸结晶，然后过滤结晶产物，用水洗涤并真空下干燥，得到6.3g(70％)的5-硝基-2-羟基吲哚。5-碘-2-羟基吲哚伴随机械搅拌下，将2-羟基吲哚(82.9g)悬浮于630mL乙酸中并将混合物在冰水浴上冷却至10℃。在10分钟内，分批加入固体N-碘代琥珀酰亚胺(175g)。加入完成后，在10℃下，将混合物搅拌1.0小时。此时其已存在的悬浮的固体变得非常粘稠。通过真空过滤收集固体，用100mL在水中的50％乙酸和200mL水先后洗涤，并在漏斗中抽吸干燥20分钟。真空下干燥产物，得到93.5g(36％)经质子NMR分析含有大约5％的2-羟基吲哚的5-碘-2-羟基吲哚。5-甲基-2-羟基吲哚在140至160℃下，将5-甲基靛红(15.0g)和60mL水合肼加热4小时。薄层层析法(乙酸乙酯∶己烷1∶2，硅胶)显示无原料剩余。将反应混合物冷却至室温，倾入到300 mL冰水中并用6N盐酸酸化至pH2。在室温下放置2天后，通过真空过滤收集沉淀，用水洗涤并在真空下干燥，得到6.5g(47％收率)的5-甲基-2-羟基吲哚。5-溴-4-甲基羟基吲哚和5,7-二溴-4-甲基羟基吲哚将在40 mL乙腈中的4-甲基-2-羟基吲哚(5g)用7.26g N-溴代琥珀酰亚胺处理并在室温下搅拌4小时。薄层层析法(乙酸乙酯∶己烷1∶2，硅胶)显示5-溴(Rf0.3)和5,7-二溴(Rf0.5)产物的混合物。加入另外7.26gN-溴代琥珀酰亚胺并将混合物搅拌另外4小时。通过真空过滤收集固体，用20mL乙腈洗涤并干燥，得到单-和二溴化合物的1∶1混合物。浓缩滤液并在硅胶上层析化(乙酸乙酯∶己烷(1∶2))，得到1.67g为米色固体的5-溴-4-甲基-2-羟基吲哚。将剩余的1∶1固体混合物从冰乙酸重结晶两次，得到3.2g为浅橙色固体的5,7-二溴-4-甲基-2-羟基吲哚。将来自该物料的滤液如上进行层析化，得到0.6g 5-溴-4-甲基-2-羟基吲哚和0.5g 5,7-二溴-4-甲基-2-羟基吲哚。6-氟-2-羟基吲哚将氢化钠(2.6g)和14.5g的丙二酸二甲酯在160mL二甲基亚砜中进行搅拌并加热至100℃1.0小时。将该混合物冷却至室温，加入7.95g的2,5-二氟硝基苯并将混合物搅拌30分钟。然后将混合物加热至100℃反应1.0小时，冷却至室温并倾入到400 mL饱和氯化铵溶液中。用200 mL乙酸乙酯提取混合物并用盐水洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物从甲醇中结晶，得到24.4g(80％收率)的为白色固体的4-氟-2-硝基苯基丙二酸二甲酯，其在薄层层析法上(乙酸乙酯∶己烷1∶6，硅胶)Rf为0.2。浓缩滤液并在硅胶柱上(乙酸乙酯∶己烷1∶8)层析化，得到另外5.03g的4-氟-2-硝基-苯基丙二酸二甲酯，总计29.5g(96％收率)。
将4-氟-2-硝基苯基丙二酸二甲酯(5.0g)在20mL 6N盐酸中回流24小时。将反应物冷却并通过真空过滤，收集白色固体，用水洗涤并干燥，得到3.3g(87％收率)的4-氟-2-硝基苯基乙酸，其在薄层层析法上(乙酸乙酯∶己烷1∶2，硅胶)Rf为0.6。
在60磅/平方英寸H2下，将溶于15 mL乙酸中的4-氟-2-硝基苯基乙酸(3.3g)经0.45g 10％钯炭氢化2小时。经过滤除去催化剂并用15 mL甲醇洗涤。浓缩合并的滤液并用水稀释。通过真空过滤收集沉淀，用水洗涤并干燥，得到1.6g(70％收率)6-氟-2-羟基吲哚，其在薄层层析法上Rf为0.24。浓缩滤液，得到具有与第一次收获相似NMR谱的红紫色固体。层析红紫色固体(乙酸乙酯∶己烷1∶2，硅胶)，得到为白色固体的6-氟-2-羟基吲哚的第二批产物。5-氨基磺酰基-2-羟基吲哚向盛有27mL氯磺酸的100mL烧瓶中，缓慢加入13.3g 2-羟基吲哚。加入期间，将反应温度维持在低于30℃。加入后，在室温下将反应混合物搅拌1.5小时，加热至68℃1小时，冷却，并倾入到水中。用水洗涤沉淀并在真空烘箱中干燥，得到11.0g的5-氯磺酰基-2-羟基吲哚(50％收率)，其无须进一步纯化即可使用。
将5-氯磺酰基-2-羟基吲哚(2.1g)加入到在10mL乙醇中的氢氧化铵10mL并在室温下搅拌过夜。浓缩混合物并通过真空过滤收集固体，得到0.4g(20％收率)为灰白色固体的标题化合物。5-甲基氨基磺酰基-2-羟基吲哚在室温下，将在10mL 2M甲基胺中的3.38g的5-氯磺酰基-2-羟基吲哚在四氢呋喃中的悬浮液搅拌4小时，其间形成白色固体。通过真空过滤收集沉淀，用5mL水洗涤两次并于40℃下真空干燥过夜，得到3.0g(88％收率)的5-甲基氨基磺酰基-2-羟基吲哚。5-(4-三氟甲基苯基氨基磺酰基)-2-羟基吲哚在室温下，将2.1g 5-氯磺酰基-2-羟基吲哚、1.6g 4-三氟甲基苯胺和1.4g吡啶在20mL二氯甲烷中的悬浮液搅拌4小时。通过真空过滤收集形成的沉淀，用5mL水洗涤两次并于40℃下真空干燥过夜，得到2.4g的粗产物，其经薄层层析法分析含有一些杂质。将该粗品产物在硅胶上层析化，用乙酸乙酯∶己烷(1∶2)洗脱，得到1.2g(37％收率)的5-(4-三氟甲基苯基-氨基磺酰基)-2-羟基吲哚。5-(吗啉代磺酰基)-2-羟基吲哚在室温下，将2.3g 5-氯磺酰基-2-羟基吲哚和2.2g吗啉在50mL二氯甲烷中的悬浮液搅拌3小时。通过真空过滤收集白色沉淀，用乙酸乙酯和己烷洗涤并在40℃下真空干燥过夜，得到2.1g(74％收率)的5-(吗啉代磺酰基)-2-羟基吲哚。6-三氟甲基-2-羟基吲哚将二甲基亚砜(330mL)加入到7.9g氢化钠中，随后滴加43.6g草酸二乙酯。将该混合物加热至100℃反应1.0小时并冷却至室温。加入2-硝基-4-三氟甲基甲苯(31.3g)，在室温下，将反应物搅拌30分钟并然后加热至100℃1小时。将反应物冷却并倾入到饱和氯化铵水溶液、乙酸乙酯和己烷的混合物中。用饱和氯化铵、水和盐水洗涤有机层，干燥，并浓缩，得到2-(2-硝基-4-三氟甲基苯基)丙二酸二甲酯。
将该二酯溶于在100mL二甲基亚砜中的6.4g氯化锂和2.7mL水的混合物中并加热至100℃3小时。将反应物冷却并倾入到乙酸乙酯和盐水的混合物中。用盐水洗涤有机相，用硫酸钠干燥，浓缩并在硅胶上层析化(10％乙酸乙酯在己烷中)。将含有产物的部分蒸发，得到25.7g 2-硝基-4-三氟甲基苯基乙酸甲酯。
将2-硝基-4-三氟甲基苯基乙酸甲酯(26mg)经10％钯炭氢化并然后在100℃下加热3小时。经过滤除去催化剂并蒸发溶剂，得到标题化合物。5-(2-氯乙基)羟基吲哚在冰浴上，将在30mL三氟乙酸中的5-氯乙酰基-2-羟基吲哚(4.18g)用4.65g三乙基硅烷处理并在室温下搅拌3小时。将混合物倾入到150mL水中并通过真空过滤收集沉淀，用50mL水洗涤并干燥，得到2.53g(65％收率)的为红棕色固体的5-(2-氯乙基)-2-羟基吲哚。5-甲氧基羰基-2-羟基吲哚在用一氧化碳饱和的气氛中，将5-碘代-2-羟基吲哚(17g)与2g二乙酸钯、18.2g三乙胺、150mL甲醇、15mL二甲基亚砜和2.6g DPPP回流。24小时后，将反应物过滤以除去催化剂并浓缩滤液。将浓缩物在硅胶上层析化(30％乙酸乙酯在己烷中)。将含有产物的部分浓缩并放置。通过真空过滤收集沉淀的产物，得到0.8g(7％)为灰白色固体的标题化合物。4-羧基-2-羟基吲哚在室温下，将三甲基甲硅烷基重氮甲烷在己烷中的溶液(2M)滴加到2.01g 2-氯-3-羧基-硝基苯在20mL甲醇中的溶液中，直到不再有气体发生。将过量三甲基甲硅烷基重氮甲烷用乙酸骤冷。通过旋转泵将反应混合物干燥并将残余物在真空烘箱中进一步干燥过夜。该产物(2-氯-3-甲氧基羰基-硝基苯)是纯的足以用于以下反应。
将丙二酸二甲酯(6.0mL)加入到冰冷却的2.1g氢化钠在15mLDMSO中的悬浮液中。然后在100℃下，将反应混合物搅拌1.0小时且然后冷却至室温，将2-氯-3-甲氧基羰基-硝基苯(2.15g)一次性加入到以上混合物中并将混合物加热至100℃反应1.5小时。然后将反应混合物冷却至室温并倾入到冰水中，酸化至pH5，并用乙酸乙酯提取。用盐水洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到3.0g2-甲氧基羰基-6-硝基苯基丙二酸二甲酯。
将2-甲氧基羰基-6-硝基苯基丙二酸二甲酯(3.0g)在50mL的6N盐酸中回流过夜。将混合物浓缩至干并与在20mL乙醇中的1.1g氯化锡(Ⅱ)回流2小时。将混合物通过硅藻土过滤，浓缩并在硅胶上层析化(乙酸乙酯∶已烷∶乙酸)，得到0.65g(37％收率)为白色固体的4-羧基-2-羟基吲哚。5-羧基-2-羟基吲哚将2-羟基吲哚(6.7g)加入到在冰浴上搅拌着的23g三氯化铝在30mL二氯乙烷中的悬浮液中。缓慢加入氯乙酰氯(11.3g)并放出氯化氢气体。搅拌10分钟后，将反应物温热至40至50℃ 1.5小时。薄层层析法(乙酸乙酯，硅胶)显示没有剩余的原料。将混合物冷却至室温并倾入到冰水中。通过真空过滤收集沉淀，用水洗涤并真空下干燥，得到10.3g(98％)为灰白色固体的5-氯乙酰基-2-羟基吲哚。
在80至90℃下，将9.3g 5-氯乙酰基-2-羟基吲哚在90mL吡啶中的悬浮液搅拌3小时然后冷却至室温。通过真空过滤收集沉淀并用20mL乙醇洗涤。将固体溶解于90mL的2.5N氢氧化钠中并在70至80℃下搅拌3小时。将混合物冷却至室温并用0.5N盐酸酸化至pH2。通过真空过滤收集沉淀并用水彻底洗涤，得到作为深棕色固体的粗品5-羧基-2-羟基吲哚。将滤液放置过夜后，得到2g为黄色固体的5-羧基-2-羟基吲哚。将粗品深棕色产物溶于热乙醇中，通过过滤除去不溶的物料并浓缩滤液，得到作为5.6g棕色固体的5-羧基-2-羟基吲哚。合并的收率为97％。5-羧基乙基-2-羟基吲哚将在含有25mL浓盐酸的10mL水中的5-氰基乙基-2-羟基吲哚(4.02g)回流4小时。将混合物冷却，加入水并通过真空过滤收集生成的固体，用水洗涤并干燥，得到1.9g(44％收率)为黄色固体的标题化合物。5-碘代-4-甲基-2-羟基吲哚于冰浴上，向在40mL冰乙酸中的2g4-甲基-2-羟基吲哚中加入3.67gN-碘代琥珀酰亚胺。将混合物搅拌1小时，用100mL在水中的50％乙酸稀释并过滤。将生成的白色固体在高真空下干燥，得到3.27g(88％收率)为灰白色固体的标题化合物。5-氯-4-甲基-2-羟基吲哚在室温下，将3.0g 4-甲基-2-羟基吲哚在50mL乙腈中的悬浮液搅拌，其间分批加入3.3gN-氯代琥珀酰亚胺。然后加入三氟乙酸(1mL)。在室温下，将该悬浮液搅拌3天，其间总是出现固体。通过真空过滤收集白色固体，用小量冷的丙酮洗涤并于40℃下在真空烘箱中干燥过夜，得到2.5g(68％收率)的5-氯-4-甲基-2-羟基吲哚。5-丁基-2-羟基吲哚在室温下，将三乙基硅烷(2.3g)加入到在20mL三氟乙酸中的2g4-丁酰基-2-羟基吲哚中并将该溶液搅拌3小时。将反应物倾入到冰水中，得到红色的油，其放置后固化。通过真空过滤收集固体，用水和己烷洗涤并干燥，得到1.7g(91％收率)作为灰白色固体的标题化合物。5-乙基-2-羟基吲哚于冰浴上，向在15mL三氟乙酸中的5-乙酰基-2-羟基吲哚(2g)中缓慢加入1.8g三乙基硅烷；然后在室温下将反应物搅拌5小时。加入1mL三乙基硅烷并继续搅拌过夜。将反应混合物倾入到冰水中并通过真空过滤收集生成的沉淀，用水大量洗涤并真空下干燥，得到1.3g(71％收率)为黄色固体的标题化合物。5-(吗啉-4-乙基)-2-羟基吲哚在100℃下，将5-氯乙基-2-羟基吲哚(2.3g)、1.2mL吗啉和1.2mL二异丙基乙基胺在10mL二甲基亚砜中加热过夜。将混合物冷却，倾入到水中并用乙酸乙酯提取。用盐水洗涤有机层，干燥并蒸发。将残余物在硅胶上层析化(5％甲醇在氯仿中)，得到0.9g(31％)为白色固体的标题化合物。5-(4-甲氧基羰基苯甲酰氨基)-2-羟基吲哚在室温下，将82.0mg 5-氨基-2-羟基吲哚和131.0mg 4-甲氧基羰基苯甲酰氯在吡啶中的混合物搅拌3小时并倾入到冰水中。过滤该沉淀，用水洗涤并在真空烘箱中干燥，得到138.0mg 5-(4-甲氧基羰基苯甲酰氨基)-2-羟基吲哚(81％收率)。5-(4-羧基苯甲酰氨基)-2-羟基吲哚将在25mL甲醇中的5-(4-甲氧基羰基苯甲酰氨基)-2-羟基吲哚(0.9g)和0.4g氢氧化钠回流3小时。浓缩该混合物，加入水，并用6N盐酸将混合物酸化。通过真空过滤收集沉淀，得到0.75g(87％)为白色固体的标题化合物。5-甲氧基-2-羟基吲哚将水合氯醛(9.6g)溶于含有83g硫酸钠的200mL水中。将溶液温热至60℃，加入11.4g羟胺盐酸盐在50mL水中的溶液并将混合物控制在60℃。在另一个烧瓶中，将在80mL水中的6.4g4-甲氧基苯胺和4.3mL浓盐酸温热至80℃。将第一个溶液加入到第二个溶液中并将混合物回流2分钟，之后将其缓慢冷却至室温并然后在冰浴中冷却。通过真空过滤收集褐色沉淀，用水洗涤并在真空下干燥，得到8.6g(85％收率)的N-(2-肟基-乙酰基)甲氧基苯胺。
将含有5mL水的浓硫酸(45mL)温热至60℃并一次性加入8.6gN-(2-肟基乙酰基)甲氧基苯胺。将该搅拌着的混合物加热至93℃10分钟并然后使之冷却至室温。将该混合物倾入到500g冰中并用乙酸乙酯提取3次。经无水硫酸钠干燥合并的提取液并浓缩，得到5.1g(65％收率)为深红色固体的5-甲氧基靛红。将5-甲氧基靛红(5.0g)和30mL水合肼加热至回流15分钟。将反应混合物冷却至室温并加入50mL水。将混合物每次用25mL乙酸乙酯提取3次，合并有机层，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到黄色固体。将该固体在乙酸乙酯中搅拌并通过真空过滤除去1.1g不溶的物料且将其保留。该物料证明为2-肼基羰基甲基-4-甲氧基苯胺。浓缩滤液并在硅胶上层析化，用乙酸乙酯∶己烷(1∶1)洗脱，得到0.7g为黄色固体的5-甲氧基-2-羟基吲哚。将1.1g 2-肼基羰基甲基-4-甲氧基苯胺在20mL 1N氢氧化钠中回流1小时。将混合物冷却，用浓盐酸酸化至pH2并每次用25mL乙酸乙酯提取3次。合并有机提取液，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到0.8g作为黄色固体的5-甲氧基-2-羟基吲哚。合并的产量为1.5g或33％。7-氮杂羟基吲哚将3,3-二溴-7-氮杂羟基吲哚(2.9g)溶于20mL乙酸和30mL乙腈的混合物中。向该溶液中加入6.5g锌粉。在室温下，将混合物搅拌2小时。从混合物中过滤固体并蒸发溶剂。将残余物用乙酸乙酯浆化。将含有不溶固体的乙酸乙酯溶液通过短硅胶柱。将收集的乙酸乙酯溶液蒸发并在真空下干燥残余物，得到1.8g(收率91％)的7-氮杂羟基吲哚乙酸盐。5-二甲基氨基磺酰基-2-羟基吲哚在室温下，将2.3g 5-氯磺酰基-2-羟基吲哚在10mL2 M二甲基胺的甲醇的悬浮液搅拌4小时，其间形成白色固体。通过真空过滤收集沉淀，用5mL 1N氢氧化钠和5mL 1N盐酸洗涤并于40℃下真空干燥过夜，得到1.9g(79％收率)的5-二甲基氨基-磺酰基-2-羟基吲哚。6-苯基-2-羟基吲哚将在25mL二甲基亚砜中的丙二酸二甲酯(10mL)滴加到悬浮在25mL二甲基亚砜中的3.5g氢化钠中并在100℃下将混合物加热10分钟。将混合物冷却至室温并加入在25mL二甲基亚砜中的4.7g4-氟-3-硝基联苯。在100℃下，将混合物加热2小时，冷却并用300mL饱和氯化铵溶液骤冷。将混合物用乙酸乙酯提取3次并用水和盐水洗涤合并的有机层且蒸发，得到作为黄色油的粗品3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
将粗品3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯在30mL 6N盐酸中回流24小时。经过滤收集沉淀，用水洗涤并干燥，得到4.5g为乳色固体的3-硝基联苯-4-乙酸。
将铁粉(2.6g)一次性加入到在40mL乙酸中的4.5g 3-硝基联苯-4-乙酸中。将混合物回流2小时，浓缩至干并在乙酸乙酯中处理。经过滤除去固体并将滤液用1N盐酸和盐水洗涤两次且经无水硫酸钠干燥。浓缩滤液，得到3.4g(93％收率)为浅棕色固体的6-苯基-2-羟基吲哚。6-(2-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚将四(三苯基膦)钯(Ig)加入到5g2-甲氧基苯基硼酸、6.6g5-溴-2-氟硝基苯和30mL 2M碳酸钠溶液在50mL甲苯和50mL乙醇中的混合物中。将混合物回流2小时，浓缩，并将残余物用乙酸乙酯提取两次。用水和盐水洗涤乙酸乙酯层，然后干燥并浓缩，得到放置固化的粗品4-氟-2’-甲氧基-3-硝基联苯的深绿色的油。
将丙二酸二甲酯(14mL)滴加入到悬浮在50mL二甲基亚砜中的2.9g氢化钠中。在100℃下，将混合物加热15分钟并冷却至室温。加入在60mL二甲基亚砜中的粗品4-氟-2’-甲氧基-3-硝基联苯并在100℃下将混合物加热2小时。将反应混合物冷却并用300mL饱和氯化钠溶液骤冷且用乙酸乙酯提取两次。合并提取液，用饱和氯化铵、水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到作为黄色油的粗品2’-甲氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
在100℃下，将在50mL 6N盐酸中的粗品2’-甲氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯加热24小时并冷却。经过滤收集沉淀，用水和已烷洗涤并干燥，得到9.8g为淡褐色固体的2’-甲氧基-2-硝基联苯基-4-乙酸。
将铁粉(5g)一次性加入到在50mL冰乙酸中的9.8g 2’-甲氧基-3-硝基联苯-4-乙酸中并加热至100℃3小时。将反应混合物浓缩至干，在乙酸乙酯中进行超声处理并过滤除去不溶物。将滤液用1N盐酸、水和盐水先后洗涤两次，经无水硫酸钠干燥并浓缩。将残余物在硅胶上用乙酸乙酯∶己烷(1∶2)层析，得到5.4g为玫瑰红色固体的6-(2-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚。6-(3-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚将四(三苯基膦)钯(0.8g)加入到5g3-甲氧基苯基硼酸、5g5-溴-2-氟-硝基苯和11mL 2M碳酸钠溶液在100mL甲苯中的混合物中。将混合物回流2小时，用水稀释并用乙酸乙酯提取。用饱和的碳酸氢钠和盐水洗涤该乙酸乙酯并然后干燥且浓缩，得到油性固体。将该固体在硅胶上层析(乙酸乙酯∶己烷(1∶6))，得到4.3g(77％收率)的4-氟-3’-甲氧基-3-硝基联苯。
将丙二酸二甲酯(9.7mL)滴加入到悬浮在50mL二甲基亚砜中的2.0g氢化钠中。将混合物加热至100℃35分钟并冷却至室温。加入在50mL二甲基亚砜中的4-氟-2’-甲氧基-3-硝基联苯(4.2g)并在100℃下将混合物加热1小时。将反应混合物冷却并用300mL饱和氯化铵溶液骤冷且用乙酸乙酯提取两次。合并提取液，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到为浅黄色固体的粗品3’-甲氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
在110℃下，将粗品3’-甲氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯在45mL 6N盐酸中加热4天并然后冷却。通过过滤收集沉淀，用水和己烷洗涤并干燥，得到5.3g为淡褐色固体的3’-甲氧基-2-硝基联苯-4-乙酸。
将3’-甲氧基-3-硝基联苯-4-乙酸(5.2g)溶于甲醇中并在室温下经0.8g 10％钯炭氢化3小时。经过滤除去催化剂，用甲醇洗涤并合并滤液且浓缩，得到棕色固体。将固体在硅胶上用乙酸乙酯∶己烷∶乙酸(33∶66∶1)层析，得到3.0g为桃红色固体的6-(3-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚。6-(4-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚将四(三苯基膦)钯(Ig)加入到5g 4-甲氧基苯基硼酸、6.6g 5-溴-2-氟硝基苯和30mL 2M碳酸钠溶液在50mL甲苯和50mL乙醇中的混合物中。将混合物回流2小时，浓缩，并将残余物用乙酸乙酯提取两次。用水和盐水洗涤该乙酸乙酯层，干燥并浓缩，得到棕色油性固体。将该固体在硅胶上层析(5％乙酸乙酯在己烷中)，得到为浅黄色固体的粗品4-氟-4’-甲氧基-3-硝基联苯。
将丙二酸二甲酯(10mL)滴加入到悬浮在60mL二甲基亚砜中的2.0g氢化钠中。将混合物加热至100℃反应10分钟并冷却至室温。加入在50mL二甲基亚砜中的粗品4-氟-2’-甲氧基-3-硝基联苯(5.2g)并在100℃下将混合物加热2小时。将反应混合物冷却并用300mL饱和氯化钠溶液骤冷且用乙酸乙酯提取三次。合并提取液，用饱和氯化铵、水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到为黄色油的粗品4’-甲氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
在100℃下，将粗品4’-甲氧基-3-硝基-联苯-4-丙二酸二甲酯在60mL 6N盐酸中加热15小时并冷却。经过滤收集沉淀，用水和己烷洗涤并干燥，得到7.2g为淡褐色固体的粗品4’-甲氧基-3-硝基联苯-4-乙酸。
将铁粉(3.6g)一次性加入到在50mL冰乙酸中的7.2g 4’-甲氧基-3-硝基联苯-4-乙酸中并在100℃下加热过夜。将反应混合物浓缩至干，在乙酸乙酯中进行超声处理并过滤除去不溶物。将滤液用1N盐酸和盐水洗涤两次，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到2.7g为玫瑰红色固体的6-(4-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚。6-(3-乙氧基苯基)-2-羟基吲哚将四(三苯基膦)钯(0.8g)加入到4.2g 3-乙氧基苯基硼酸、5.0g 5-溴-2-氟硝基苯和22mL 2M碳酸钠溶液在50mL甲苯和50mL乙醇中的混合物中。将混合物回流2小时，浓缩，加入水并将混合物用乙酸乙酯提取两次。用水和盐水洗涤该乙酸乙酯层，然后干燥并浓缩。将残余物在硅胶上层析(5％乙酸乙酯在己烷中)，得到5.3g(90％收率)为黄色油的粗品4-氟-3’-乙氧基-3-硝基联苯。
将丙二酸二甲酯(11.4mL)滴加入到悬浮在20mL二甲基亚砜中的4.0g氢化钠中。将混合物加热至100℃反应10分钟并然后冷却至室温。加入在25mL二甲基亚砜中的粗品4-氟-3’-乙氧基-3-硝基联苯(5.3g)并在100℃下将混合物加热2小时。将反应混合物冷却并用300mL饱和氯化铵溶液骤冷且用乙酸乙酯提取三次。合并提取液，用水和盐水洗涤并然后经无水硫酸钠干燥且浓缩，得到作为黄色油的粗品3’-乙氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
在100℃下，将粗品3’-乙氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯在60mL 6N盐酸中加热4天并然后冷却。通过过滤收集沉淀，用水和己烷洗涤并干燥，得到4.7g为淡褐色固体的粗品3’-乙氧基-3-硝基联苯基-4-乙酸。
将铁粉(2.4g)一次性加入到在40mL冰乙酸中的4.6g 3’-乙氧基-3-硝基联苯-4-乙酸中并回流2小时。将反应混合物浓缩至干，用乙酸乙酯重复处理并过滤除去不溶物。将滤液用1N盐酸和盐水洗涤两次并然后经无水硫酸钠干燥且浓缩，得到3.5g(91％收率)为淡棕色固体的6-(3-乙氧基苯基)-2-羟基吲哚。6-溴-2-羟基吲哚将丙二酸二甲酯(13mL)滴加入到在20mL二甲基亚砜中悬浮的2.7g氢化钠中。将混合物加热至100℃反应10分钟并然后冷却至室温。加入在25mL二甲基亚砜中的5-溴-2-氟硝基苯(5.0g)并在100℃下将混合物加热2小时。将反应混合物冷却并用300mL饱和氯化铵溶液骤冷且用乙酸乙酯提取三次。合并提取液，用饱和氯化铵、水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到为浅黄色油的粗品4-溴-2-硝基苯基丙二酸二甲酯。
在110℃下，将粗品4-溴-2-硝基苯基丙二酸二甲酯在40mL 6N盐酸中加热24小时并然后冷却。通过过滤收集沉淀，用水洗涤并干燥，得到5.3g(89％收率)为灰白色固体的4-溴-2-硝基-苯基乙酸。
在100℃下，将在5 mL乙醇中的4-溴-2-硝基苯基乙酸(0.26g)、0.26g锌粉和3mL 50％硫酸加热过夜。过滤反应混合物，用少量乙酸稀释，浓缩除去乙醇，用水稀释并用乙酸乙酯提取两次。用盐水洗涤合并的提取液，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到0.19g(90％收率)为黄色固体的6-溴-2-羟基吲哚。5-乙酰基-2-羟基吲哚将2-羟基吲哚(3g)悬浮于1,2-二氯乙烷中并缓慢加入3.2mL乙酰氯。将生成的悬浮液加热至50℃反应5小时，冷却，并倾入到水中。通过真空过滤收集生成的沉淀，用水大量洗涤并在真空下干燥，得到2.9g(73％收率)为棕色固体的标题化合物。5-丁酰基-2-羟基吲哚在冰浴中，向悬浮于30mL 1,2-二氯乙烷中的15g三氯化铝中先后加入7.5g 2-羟基吲哚和12g丁酰氯。将生成的悬浮液加热至50℃反应过夜。将混合物倾入到冰水中并用乙酸乙酯提取3次。用盐水洗涤合并的乙酸乙酯层，经硫酸钠干燥并浓缩至干，得到棕色固体。将该固体在硅胶上层析(50％乙酸乙酯在己烷中)，得到3g(25％)为黄色固体的标题化合物。5-氰基乙基-2-羟基吲哚将氰化钾(2.0g)加入到15mL二甲基亚砜中并加热至90℃。伴随搅拌下，缓慢加入溶于5mL二甲基亚砜中的5-氯乙基-2-羟基吲哚(3.0g)，并将反应物加热至150℃2小时。将混合物冷却，倾入到冰水中并通过真空过滤收集沉淀，用水洗涤，干燥并然后在硅胶上层析化(5％甲醇在氯仿中)，得到1.2g(42％收率)标题化合物。6-(吗啉-4-基)-2-羟基吲哚将在20ml乙醇中的6-氨基-2-羟基吲哚(2.2g)、4.0g 2,2’-二溴乙醚和7.9g碳酸钠回流过夜，浓缩并用50ml水稀释。将混合物用50ml乙酸乙酯提取三次并合并有机提取液，用20ml盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩至干。将固体在硅胶柱上层析化(乙酸乙酯∶己烷(1∶1)含有0.7％乙酸)，得到1.2g(37％收率)为米色固体的标题化合物。6-(3-三氟乙酰基苯基)-2-羟基吲哚在氮气下，将在50mL甲苯中的3-氨基苯基硼酸(3.9g)、5g 5-溴-2-氟-硝基苯、0.8g四(三苯基膦)钯和23mL 2M碳酸氢钠溶液回流2.5小时。将反应混合物倾入到200mL冰水中并将混合物用50mL乙酸乙酯提取三次。用50mL水和20mL盐水洗涤合并的有机层，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到9.7g(92％收率)为深棕色油的2-氟-5-(3-氨基苯基)硝基苯。
在0℃下，将三氟乙酸酐(5.4mL)缓慢加入到搅拌着的9.7g 2-氟-5-(3-氨基苯基)硝基苯和5.3mL三乙胺在50mL二氯甲烷中的溶液中，并将混合物搅拌另外20分钟。浓缩混合物并将残余物在硅胶柱上层析化(10％乙酸乙酯在己烷中)，得到8.6g(65％收率)为浅橙色油的2-氟-5-(3-三氟乙酰氨基苯基)硝基苯，其放置固化。
在氮气下，将丙二酸二甲酯(9.6mL)滴加入到搅拌着的3.2g在矿物油中的60％氢化钠在40mL无水二甲基亚砜中的悬浮液中。将混合物搅拌10分钟并加入在20mL二甲基亚砜中的2-氟-5-(3-三氟乙酰氨基-苯基)硝基苯。将生成的深红色混合物加热至100℃反应2小时。通过倾入到100mL饱和氯化铵溶液中将反应物骤冷并用50mL乙酸乙酯提取两次。每次用50mL饱和氯化铵溶液、水和盐水洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到黄色的油。将该油在硅胶柱上层析化(乙酸乙酯∶己烷(1∶4))，得到4.4g(50％收率)为浅黄色固体的2-[2-硝基-4-(3-三氟乙酰氨基苯基)苯基]-丙二酸二甲酯。
将2-[2-硝基-4-(3-三氟乙酰氨基苯基)-苯基]丙二酸二甲酯(4.4g)在50mL 6N盐酸中回流过夜。将反应混合物冷却至室温并通过真空过滤收集固体，用水洗涤，并真空下干燥，得到2.7g(73％收率)的2-[2-硝基-4-(3-三氟乙酰氨基苯基)苯基]乙酸。
在100℃下，将2-[2-硝基-4-(3-三氟乙酰氨基苯基)苯基]乙酸(100mg)和50mg铁粉在3mL乙酸中加热2小时。浓缩反应混合物并将残余物在5mL乙酸乙酯中进行超声处理。通过真空过滤除去不溶的固体并用1N盐酸、水和盐水洗涤滤液，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到10mg(14％收率)为玫瑰红色固体的标题化合物。
B．醛类5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸在配备有温度计、加料漏斗和机械搅拌器的500mL三口圆底烧瓶中，将叔丁基-3-氧代丁酸酯(158g,1mol)溶于200mL乙酸中。在冰浴上，将混合物冷却至大约10℃。将温度保持在15℃以下，在75分钟内加入亚硝酸钠(69g,1mol)。撤除冷却浴并将混合物搅拌30分钟且然后使之放置3.5小时，得到叔丁基-2-肟基-3-氧代丁酸酯。
在配备有温度计、加料漏斗、机械搅拌器并置于油浴上的2L三口圆底烧瓶中，将乙基-3-氧代丁酸酯(130g,1mol)溶于400mL乙酸中。加入锌粉(50g,0.76mol)并在搅拌下将混合物加热至60℃。缓慢加入以上制备的叔丁基-2-肟基-3-氧代丁酸酯溶液，反应混合物的温度维持在大约65℃。然后加入更多的锌粉(4×50g,3.06mol)，所有的叔丁基酯加入之后再加入最后一份锌粉。在加入结束时温度为64℃。将温度升至70-75℃，搅拌一小时并然后倾入到5L水中。
通过真空过滤收集灰色浮动的沉淀并用2L水洗涤，得到354g湿的粗品产物。将该粗品产物溶于1L热乙醇中并热过滤除去锌。冷却滤液，其间形成沉淀。通过真空过滤收集沉淀并干燥，得到118g产物。将滤液置于冰箱中过夜，其间沉淀出另外的产物。得到总共173.2g的3,5-二甲基-1H-吡咯-2,4-二羧酸2-叔丁基酯4-乙酯。
在配备有机械搅拌的2L三口圆底烧瓶中，将3,5-二甲基-1H-吡咯-2,4-二羧酸2-叔丁基酯4-乙酯(80.1g,0.3mol)和400mL三氟乙酸搅拌5分钟并于油浴中温热至40℃。然后将混合物冷却至-5℃并立即加入原甲酸三乙酯(67.0g,0.45mol)。将温度升至15℃。将混合物搅拌大约1分钟，撤除冷却浴并然后搅拌1小时。通过旋转蒸发除去三氟乙酸并将残余物放于冰箱中，期间固化。通过温热将固体溶解并倾入到500g冰中。用800mL二氯甲烷提取混合物，得到红色溶液和棕色沉淀，两者均被保留。分离沉淀并用150mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤。也用150mL碳酸氢钠洗涤二氯甲烷相。然后将二氯甲烷溶液用100mL水洗涤另外3次。将二氯甲烷溶液蒸发至干。将剩余的深色残余物从含有Darco炭黑的乙酸乙酯中重结晶两次，得到金黄色针晶。将棕色沉淀从同样含有Darco的350mL乙酸乙酯中重结晶，得到红黄色固体。合并所有重结晶的固体并从500mL乙醇中重结晶，得到37.4g(63.9％)作为黄色针晶的5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(mp 165.6-166.3℃，文献值163-164℃)。将蒸发乙酸乙酯和乙醇母液后得到的残余物合并，并从500mL乙醇中重结晶，得到第二批收获物(10.1g)或作为深黄色针晶的产物。
将5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(2g,10mmol)加入到溶于甲醇(3mL)和水(10mL)中的氢氧化钾(3g,53mmol)的溶液中。将混合物回流3小时，冷却至室温并用6N盐酸酸化至pH3。通过过滤收集形成的固体，用水洗涤并在真空烘箱中干燥过夜，得到1.6g(93％)5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:12.09(s,br,2H,NH&COOH),9.59(s,1H,CHO),2.44(s,3H,CH3),2.40(s,3H,CH3)。5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基乙基)酰胺向5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(1.67g,10mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的混合物中加入苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP试剂，6g,13.5mmol)，随后加入3mL二异丙基乙基胺。搅拌5分钟后，加入1mL N,N-二甲基乙二胺并在室温下将混合物搅拌24小时。向反应混合物中加入25mL 1N氢氧化钠和25mL盐水。搅拌30分钟后，将反应混合物倾入到水(100mL)中并用在二氯甲烷中的10％甲醇(3×200mL)提取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥并用旋转蒸发器蒸发。将剩余的残余物经层析法(硅胶柱，5-10％甲醇在二氯甲烷中)纯化，得到1g(42％)的5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(2-二甲基氨基-乙基)-酰胺。
1H NMR(360MHz,DMSO-d6)δ:11.77(s,1H,NH),9.53(s,1H,CHO),7.34(t,J=5.6Hz,1H,CONH),3.27(m,2H,CONCH2CH2),2.37(t,J=6.8Hz,2H,CONCH2CH2),2.35(s,3H,CH3),2.3(s,3H,CH3),2.17(s,6H,2×CH3)。
MSm/z238.3[M+1]+。3,5-二甲基-4-(4-甲基-哌嗪-1-基羰基)-1H-吡咯-2-甲醛向5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-羧酸(1.67g,10mmol)在二甲基甲酰胺(10mL)中的混合物中加入苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)-磷鎓六氟磷酸盐(BOP试剂，6g,13.5mmol)随后加入3mL二异丙基乙基胺。搅拌5分钟后，加入2mL 1-甲基哌嗪并在室温下将混合物搅拌24小时。然后向反应物中加入25mL 1N氢氧化钠和25mL盐水。搅拌30分钟后，将反应混合物倾入到水(100mL)中并用在二氯甲烷中的10％甲醇提取(3×200mL)。合并有机层，经无水硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上蒸发。将剩余的残余物经层析法(硅胶柱，5％-10％甲醇在二氯甲烷中)纯化，得到1g(40％)的3,5-二甲基-4-(4-甲基-哌嗪-1-羰基)-1H-吡咯-2-甲醛。
1H NMR(360MHz,DMSO-d6)δ:11.82(s,1H,NH),9.50(s,1H,CHO),3.14(br m,4H,2xCH2),2.29(br m,4H,2xCH2),2.19(s,3H,CH3),2.17(s,3H,CH3),2.14(s,3H,CH3)。
MS EI 249[M]+。
C．实施例-吡咯取代的2-吲哚满酮的合成。
借助实施例仅显示以下本发明代表性化合物的合成，并不构成对关于本发明合成方法或在本发明中包括的化合物范围的限制。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.31(s,br,1H,NH-1’),12.06(s,br,1H,COOH),10.88(s,br,1H,NH-1),7.93(d,J=1.88Hz,1H,H-4),7.75(s,1H,H-乙烯基)，7.19(d,J=3.1Hz,1H,H-2’),7.1(dd,b,J=1.88,8.40Hz,1H,H-6),6.84(d,J=8.40Hz,1H,H-7),2.65(t,J=7.44Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.44Hz,2H,CH2CH2COOH),2.28(s,3H,CH3)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.1(s,br,1H,NH-1’),12.04(s,br,1H,COOH),10.76(s,br,1H,NH-1),7.63(d,J=8.29Hz,1H,H-4),7.46(s,1H,H-乙烯基)，7.07(d,J=3.03Hz,1H,H-2’),6.55(dd,J=2.32,8.29Hz,1H,H-5),6.43(d,J=2.32Hz,1H,H-7),3.74(s,3H,OCH3),2.63(t,J=7.31Hz,2H,CH2CH2COOH),2.45(t,J=7.31Hz,2H,CH2CH2COOH),2.23(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)327([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.42(s,br,1H,NH-1’),12.03(s,br,1H,COOH),10.80(s,br,1H,NH-1),7.87(d,J=2.06Hz,1H,H-4),7.67(s,1H,H-乙烯基)，7.06(dd,J=2.06,8.3Hz,1H,H-6),6.83(d,J=8.3Hz,1H,H-7),2.64(t,J=7.6Hz,2H,CH2CH2COOH),2.34(t,J=7.6Hz,2H,CH2CH2COOH),2.29(s,3H,CH3),2.27(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)345([M+1]+,64)。
向配备有温度计和机械搅拌器并置于蒸气浴上加热的5L三口烧瓶中加入350g 5-乙酰-基-4-氧代己酸乙酯、329g氨基丙二酸乙酯盐酸盐、133g乙酸钠和1.2L乙酸。在37分钟内，将混合物加热至99℃。到62℃时，二氧化碳逸出迅速。在99℃下，总计35分钟后，气体CO2逸出大大减慢。另外1小时以后，将混合物冷却，通过真空过滤除去氯化钠，并蒸发溶剂。将残余物与1L冷水混合。通过真空过滤收集沉淀，用400mL水洗涤，并溶于1L热的95％乙醇中。将溶液用20g Darco G-60处理，趁热过滤，并冷却至室温。通过真空过滤收集结晶固体，在滤膜上，用200mL 50％乙醇洗涤两次并于70℃下真空干燥，得到285g(64％收率)2-乙氧基羰基-4-(2-乙氧基羰基乙基)-3,5-二甲基吡咯。将滤液冷冻过夜，得到另一份53.1g(11.9％收率)产物，总收率75.9％。
将2-乙氧基羰基-4-(2-乙氧基羰基乙基)-3,5-二甲基吡咯(285g)和3500 mL乙醚置于配备有机械搅拌器、回流冷凝器和加料漏斗并在冰浴上冷却的5L三口烧瓶中。在145分钟内滴加硫酰氯(435g)。当滴加进行时，混合物变为浑浊和绿色，然后变成清澈。在加入结束时，混合物是澄清的并带有微弱黄色。将混合物搅拌另外1小时并然后加热至回流反应1小时。将混合物冷却并旋转蒸发，用1500mL乙醚稀释，并再次旋转蒸发。再次重复进行稀释和旋转蒸发。将残余物加入到8L含有802g乙酸和535g氢氧化钠的水中。将混合物短暂加热至85℃并然后伴随搅拌下使之冷却过夜。分离含有固体的水层并用800mL乙醚提取。将固体和醚层加入到2.5L含有300g碳酸钠的水中，搅拌1小时并过滤除去小量固体(～7g)。将亚硫酸(137g)加入到混合物中并将生成的沉淀用250mL水洗涤两次且真空下干燥，得到56.4g产物。将亚硫酸(92g)加入到滤液中并将生成的沉淀用0.5L水洗涤两次且真空下干燥，得到220g产物，总计276.4g(86.8％收率)的2-羧基-5-乙氧基羰基-3-(2-乙氧基羰基乙基)-4-甲基吡咯。
在帕尔压热器中，将2-羧基-5-乙氧基羰基-3-(2-乙氧基羰基乙基)-4-甲基吡咯(50.5g)和400ml 10％氢氧化钠溶液加热至180℃反应90分钟。将该过程重复另外4次直到处理完成总共252.5g 2-羧基-5-乙氧基羰基-3-(2-乙氧基羰基乙基)-4-甲基吡咯。合并这五份溶液并旋转蒸发直到得到体积为大约1.8L粘稠的黑色残余物。在水浴上，将混合物冷却至10℃并缓慢加入50％硫酸以维持温度在＜20℃直到pH2。加入乙醚(1400mL)，过滤混合物且保留沉淀。用500mL乙醚在索格利特萃取器上萃取沉淀。用250mL水和150mL水先后洗涤合并的醚层。用150 mL乙醚反萃取合并的水层。将所有醚层旋转蒸发并将残余物干燥，得到123.5g 3-(2-羧基乙基)-4-甲基吡咯。
在磁力搅拌的接受器烧瓶中，将3-(2-羧基乙基)-4-甲基吡咯(123g)与1500mL乙醚和250mL甲醇混合。将另一个配备有磁力搅拌、蒸馏头和冷凝器的3L三口圆底烧瓶通向接受器烧瓶的入口，并在水浴上加热。向3L烧瓶中放入240g溶于1800mL乙醚中的Diazald和73g溶于360mL 95％乙醇及112mL水中的氢氧化钾溶液。搅拌3L烧瓶并在水浴上加热至65-75℃且在大约2.5小时内将重氮甲烷-乙醚混合物蒸馏进入搅拌着的接受器烧瓶中。向3L烧瓶中加入乙醚(200mL)并继续蒸馏直到完全。将接受器烧瓶搅拌另外30分钟并然后加入10mL乙酸。用500mL水将混合物提取两次，然后用200mL饱和碳酸氢钠提取两次。经无水硫酸钠干燥醚层并蒸馏，得到深色流体残余物。通过4英寸维格罗分馏柱将残余物蒸馏两次并通过10英寸真空夹套式维格罗分馏柱蒸馏一次，得到108g(80.6％收率)的3-(2-乙氧基羰基乙基)-4-甲基吡咯。BP 108-113℃在0.5mm下。
将二甲基甲酰胺加入到500mL配备有机械搅拌、温度计和滴液漏斗的三口圆底烧瓶中并在氮气氛下维持。将烧瓶冷却至0℃并在80分钟内滴加58.4mL磷酰氯。加入二氯乙烷(280mL)并使混合物温热至室温且然后冷却至-10℃。在1小时内，将溶于80mL二氯乙烷中的3-(2-甲氧基羰基-乙基)-4-甲基吡咯(55.7g)滴加入内并将混合物搅拌另外35分钟。在＜30℃下，将混合物旋转蒸发。将流体残余物倾入到2700mL冰冷的2N氢氧化钠溶液中。在20分钟内，将生成的溶液加热至88℃并然后在该温度下维持反应另外30分钟。将溶液冷却至环境温度并用200mL乙醚提取。将水溶液冷却至0℃并通过缓慢加入大约1350mL 5N盐酸酸化至pH3.5。通过真空过滤收集黄色沉淀，用100mL水洗涤4次，并于环境温度下在真空烘箱中干燥，得到54.4g(90.2％收率)粗品4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯。
将粗品物料置于425mL乙醇和700mL乙醚的回流混合物中并热过滤以除去不溶的残余物，将其保留。将滤液置于冷藏箱中，并通过真空过滤收集生成的沉淀且用50mL乙醚洗涤。将滤液用于再次提取不溶的残余物，热过滤并置于冷藏箱中。将生成的沉淀和第一份沉淀合并，得到26.1g为棕色粉末的4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯，MP149.0-150.3℃。将滤液与先前制备的滤液合并且浓缩，得到43g棕色固体。将固体置于500mL乙醚和100mL乙醇的回流混合物中，过滤。在回流下，用Norit处理滤液并再次热过滤。将滤液置于冷藏箱中，得到3份额外产量的4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-乙基吡咯，7.7g,MP148-151℃,3.2g,MP128-134℃和4.1g,MP148.2-150.0℃。
在250mL配备有温度计、回流冷凝器和磁力搅拌的三口圆底烧瓶中，将在50mL乙醇中的4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(9.0g)和6.0g 2-羟基吲哚加热至70℃。当大部分固体已溶解时，缓慢加入4.5g哌啶并将混合物回流4小时。缓慢加入乙酸(12mL)生成大量沉淀。将混合物回流5分钟，冷却至室温并通过真空过滤收集沉淀且用30mL乙醇洗涤。在回流下，将沉淀用30mL乙醇浆洗，冷却至室温，通过真空过滤收集，用20mL乙醇洗涤并真空下干燥，得到11.9g(80％收率)作为橙色固体的3-[4-(2-羧基乙基)-3-甲基吡咯-2-亚甲基]-2-吲哚满酮，SU6663。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.29(s,br,1H,NH-1'),12.05(s,br,1H,COOH),10.78(s,br,1H,NH-1),7,73(d,J=7.43Hz,1H,H-4),7.61(s,1H,H-乙烯基)，7.13(d,J=2.75Hz,1H,H-2’),7.10(t,J=7.43Hz,1H,H-6),6.97(t,J=7.43Hz,1H,H-5),6.85(d,J=7.43Hz,1H,H-7),2.64(t,J=7.38Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.38Hz,2H,CH2CH2COOH),2.25(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)297([M+1]+,100)。
1HNMR(d6-DMSO)δ11.9(s,1H,COOH),9.9(s,1H,NH),6.2(s,1H，芳香的)，2.5(t,2H,CH2),2.2(t,2H,CH2),2.0(s,3H,CH3),1.9(s,3H,CH3)；MP134-136℃。
在配备有磁力搅拌、温度计和滴液漏斗的1L三口圆底烧瓶中，在冰盐浴上，将在250mL二氯甲烷中的二甲基甲酰胺(28.5g)冷却至-1℃。将磷酰氯(59.3g)置于滴液漏斗中并缓慢加入到反应混合物中。用25mL二氯甲烷冲洗漏斗以确保所有的磷酰氯。混合物达到的最大温度为5℃。将混合物搅拌15分钟，其间温度为-3℃。在15分钟内，分批加入固体3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基吡咯(32.6g)。混合物达到的最大温度为7℃。将该红黑色混合物搅拌另外30分钟并然后加热至回流反应1小时。将混合物冷却至15℃并加入300mL水导致反应剧烈，其间温度升高。搅拌混合物并冷却至22℃，分离这些层并保留。将有机层用100mL水提取并且合并水层且用50mL二氯甲烷洗涤。弃去有机层。用～180mL 10N氢氧化钠将水层pH调至11。温度升至40℃。将混合物搅拌30分钟，此时温度为27℃。用～120mL10N盐酸将混合物酸化至pH2，这使得温度升至30℃。加入乙酸乙酯(150mL)并搅拌混合物以提取产物。在搅拌期间，在水层上部出现很大量的黑色固体。分离乙酸乙酯层并用100mL乙酸乙酯将水层和固体提取两次。通过真空过滤收集仍然存在的固体，用水彻底洗涤并于40℃下真空干燥，得到12g(31％收率)为棕黑色固体的3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯。薄层层析法(二氯甲烷∶乙酸，95∶5，硅胶)显示在Rf0.7的斑点和在原点的有色斑点。合并乙酸乙酯层，经无水硫酸钠干燥，并蒸发至棕黑色固体，将其于40℃下真空干燥，得到21g(55％收率，总收率86％)的3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯，在外观上与先前经薄层层析法得到的固体一致。
或者，在配备有机械搅拌、温度计和滴液漏斗的5L三口圆底烧瓶中，将在750mL二氯甲烷中的二甲基甲酰胺(124mL)在冰盐浴上冷却至-9℃。借助滴液漏斗迅速加入磷酰氯(114mL)，用50mL二氯甲烷冲洗漏斗至反应混合物中。混合物达到最大温度为-4℃。在20分钟内，分批加入固体3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基吡咯(133.6g)。混合物达到最大温度为3℃。将该深红色混合物加热至回流反应1分钟并然后冷却至-1℃。将混合物冷却至1℃并迅速加入800mL冰水。所达到的最大温度为15℃。分离并弃去有机层。用～800mL 10N氢氧化钾将水层缓慢调节至pH 12-13，加入冰以控制温度。温度升至37℃。在环境温度下，将混合物搅拌90分钟，此时，薄层层析法显示产物Rf为0.3，在原点仅有微量的浅色物料。将混合物冷却至0℃。用～600mL 10N盐酸将混合物酸化至pH3，加入冰以控制温度。所达到的最大温度为10℃。在冷却下，将混合物搅拌1小时。通过真空过滤收集固体，用100mL水洗涤4次并于50-60℃下真空干燥，得到140.6g(90％收率)为棕色固体的3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯。
1HNMR(d6-DMSO):δ12.0(s,1H,COOH),11.3(s,1H,NH),9.4(s,1H,CHO),2.6(t,2H,CH2),2.3(t,2H,CH2),2.2(s,3H,CH3),2.1(s,3H,CH3)；MP145-147℃。
通过将配备有磁力搅拌和回流冷凝器的250mL圆底烧瓶在油浴上加热，将3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯(18.2g)和11.7g2-羟基吲哚溶于100mL乙醇中。加入吡咯烷(7.0g)并将反应混合物回流2小时，此时，出现大量棕黑色固体。薄层层析法(乙酸乙酯∶乙醇∶乙酸，96∶2∶2，硅胶)显示不存在羟基吲哚原料。加入8mL乙酸并将混合物回流15分钟。用50mL乙醇稀释粘稠的混合物并冷却至10℃。通过真空过滤收集固体，并用50mL乙醇洗涤。在回流下，将该固体于125mL乙醇中搅拌10分钟，冷却至10℃，通过真空过滤收集并用50mL乙醇洗涤。在45℃下，将产物真空干燥过夜，得到25.5g(88％收率)为橙色固体的3-[2,4-二甲基-3-(2-羧基乙基)吡咯-5-亚甲基]-2-吲哚满酮。
或者，在50℃下，将溶于50ml水中的3-(5-甲酰基-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)-丙酸(10g,51mmol)、2-羟基吲哚(6.5g,49mmol)和氢氧化钠(40g,58mmol)搅拌4小时。将反应混合物冷却至室温，过滤并用12N盐酸将滤液酸化至pH3。通过真空过滤收集沉淀的固体，用10mL水洗涤并在真空下干燥过夜。用热乙醇将粗品固体浆洗两次。然后通过真空过滤收集固体，用10mL乙醇洗涤并真空下干燥，得到13.8g(91％收率)的3-[2,4-二甲基-5-(2-氧代-1,2二氢-亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.38(s,br,1H,NH-1’),12.05(s,br,1H,COOH),10.70(s,br,1H,NH-1),7.69(d,J=7.39Hz,1H,H-4),7.53(s,1H,H-乙烯基)，7.06(t,J=7.39Hz,1H,H-6),6.95(t,J=7.39Hz,1H,H-5),6.85(d,J=7.39Hz,1H,H-7),2.63(t,J=7.45Hz,2H,CH2CH2COOH),2.34(t,J=7.45Hz,2H,CH2CH2COOH),2.28(s,3H,CH3),2.24(s,3H,CH3)；MS m/z(相对强度，％)311([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.44(s,br,1H,NH-1),7.32-7.36(m,2H),6.76(d,J=8.50Hz,1H,H-7),3.5(s,2H,CH2)；MSm/z212.1/214.1(M+/[M+2]+)。
将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90mg)、106mg 5-溴-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热至95℃反应5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于2 N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH 6并在真空烘箱中干燥，得到120mg(64％)为棕色固体的标题化合物。
1H NMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.31(s,br,1H,NH-1’),12.06(s,br,1H,COOH),10.90(s,br,1H,NH-1),8.06(s,br,1H,H-4),7.75(s,1H,H-乙烯基)，7.23(d,br,J=8.50Hz,1H,H-6),7.19(d,J=2.84Hz,1H,H-2’),6.80(d,br,J=8.50Hz,1H,H-7),2.65(t,J=7.65Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.65Hz,2H,CH2CH2COOH),2.28(s,3H,CH3)；MSm/z 375.1/377.2(M+/[M+2]+)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.45(s,1H,NH-1),7.49(s,1H,H-4),7.48(d,J=8.10Hz,1H,H-6),6.64(d,J=8.10Hz,1H,H-7)，和3.46(s,2H,CH2-3)；MSm/z 258[M-1]+。
在95℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90mg)、130mg 5-碘代-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于2N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥，得到162mg(77％)为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.30(s,br,1H,NH-1’),12.06(s,br,1H,COOH),10.88(s,br,1H,NH-1),8.18(s,br,1H,H-4),7.73(s,1H,H-乙烯基)，7.40(d,br,J=8.03Hz,1H,H-6),7.19(d,J=2.94Hz,1H,H-2’),6.69(d,br,J=8.03Hz,1H,H-7),2.65(t,J=7.40Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.40Hz,2H,CH2CH2COOH),2.28(s,3H,CH3)；MSm/z 423[M+1]+。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.27(s,br,1H,NH-1),7.06(t,J=7.71Hz,1H,H-6),6.74(d,J=7.73Hz,H-5),6.63(d,J=7.73Hz,1H,H-7),3.36(s,2H,CH2),2.18(s,3H,CH3)。
在95℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90mg)、74mg4-甲基-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥，得到80mg(52％)作为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.33(s,br,1H,NH-1’),10.84(s,br,1H,NH-1),7.54(s,1H,H-乙烯基)，7.12(d,J=2.0Hz,1H,H-2’),7.01(t,J=7.75Hz,1H,H-6),6.79(d,J=7.75Hz,H-5),6.74(d,J=7.75Hz,1H,H-7),2.64(t,J=7.65Hz,2H,CH2CH2COOH),2.57(s,3H,CH3),2.42(t,J=7.65Hz,2H,CH2CH2COOH),2.19(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)311([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.20(s,br,1H,NH-1),6.99(s,1H,H-4),6.94(d,J=8.11Hz,1H,H-6),6.68(d,J=8.11Hz,1H,H-7),3.39(s,2H,CH2-3)和2.22(s,3H,CH3-5)。
在95℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90mg)、74mg5-甲基-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥，得到65mg(42％)为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.30(s,br,1H,NH-1’),12.05(s,br,1H,COOH),10.67(s,br,1H,NH-1),7.57(s,2H,H-乙烯基，H-4),7.12(d,J=2.65 Hz,1H,H-2’),6.91(d,J=7.82Hz,1H,H-6),6.74(d,J=7.82Hz,1H,H-7),2.65(t,J=6.94Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=6.94Hz,2H,CH2CH2COOH),2.30(s,3H,CH3),2.25(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)311([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.19(s,br,1H,NH-1’),12.05(s,br,1H,COOH),10.53(s,br,1H,NH-1),7.46(s,1H),7.41(s,1H),7.02(s,1H,H-2’),6.45(s,1H),3.74(s,3H,OCH3),3.70(s,3H,OCH3),2.59(t,J=7.43Hz,2H,CH2CH2COOH),2.44(t,J=7.43Hz,2H,CH2CH2COOH),2.22(s,3H,CH3)；MSm/z357[M+1]+。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.22(s,br,1H,NH-1’),12.09(s,br,1H,COOH),10.95(s,br,1H,NH-1),7.78(d,J=7.95 Hz,1H,H-4),7.66(s,1H,H-乙烯基)，7.18(d,J=2.64 Hz,1H,H-2'),7.01(dd,J=1.90,7.95Hz,1H,H-5),6.86(d,J=1.90Hz,1H,H-7),2.65(t,J=7.14Hz,2H,CH2CH2COOH),2.45(t,J=7.14 Hz,2H,CH2CH2COOH),2.26(s,3H,CH3)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ10.70(s,br,1H,NH-1),7.83(dd,J=1.77,8.29Hz,1H,H-6),7.77(s,br,1H,H-4),6.89(d,J=8.29Hz,1H,H-7),3.80(s,3H,COOCH3-5),3.51(s,2H,CH2-3)。
在95℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90.6mg)、88.6mg 5-甲氧基羰基-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH 6并在真空烘箱中干燥，得到123mg(69％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.27(s,br,1H,NH-1’),12.0(s,vbr,1H,COOH),11.16(s,br,1H,NH-1),8.36(s,br,1H,H-4),7.80(s,1H,H-乙烯基)，7.40(dd,J=1.80,8.14 Hz,1H,H-6),7.20(d,J=2.91Hz,1H,H-5’),6.96(d,J=8.14Hz,1H,H-7),3.84(s,3H,COOCH3),2.66(t,J=7.55Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.55Hz,2H,CH2CH2COOH),2.30(s,3H,CH3)；MS m/z(相对强度，％)，355([M+1]+,100)。实施例133-[4-(2-羧基-乙基)-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-5-羧酸在冰浴上，将2-羟基吲哚(6.7g)加入到搅拌着的23g三氯化铝在30mL二氯乙烷中的悬浮液中。缓慢加入氯乙酰氯(11.3g)并放出氯化氢气体。搅拌10分钟后，将反应物温热至40-50℃反应1.5小时。薄层层析法(乙酸乙酯，硅胶)显示未剩余原料。将混合物冷却至室温并倾入到冰水中。通过真空过滤收集沉淀，用水洗涤并真空下干燥，得到10.3g(98％)为灰白色固体的5-氯乙酰基-2-羟基吲哚。
在80-90℃下，将9.3g 5-氯乙酰基-2-羟基吲哚在90mL吡啶中的悬浮液搅拌3小时然后冷却至室温。通过真空过滤收集沉淀并用20mL乙醇洗涤。将固体溶于90mL2.5 N氢氧化钠中并在70-80℃下搅拌3小时。将混合物冷却至室温并用0.5N盐酸酸化至pH2。通过真空过滤收集沉淀并用水彻底洗涤，得到为深棕色固体的粗品5-羧基-2-羟基吲哚。在放置过夜后，滤液中得到为黄色固体的2g 5-羧基-2-羟基吲哚。将粗品深棕色产物溶于热甲醇中，通过过滤除去不溶的物料并浓缩滤液，得到5.6g为棕色固体的5-羧基-2-羟基吲哚。合并收率为97％。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ12.56(s,br,1H,COOH-5),10.70(s,1H,NH-1),7.82(dd,J=1.57,7.79 Hz,1H,H-6),7.74(s,br,1H,H-4),6.87(d,J=7.79Hz,1H,H-7)，和3.53(s,2H,CH2-3)。MSm/z(相对强度，％)，178([M+1]+,100)。
在95℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90.6mg)、88.6mg5-羧基-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6 N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH 6并在真空烘箱中干燥。将粗品产物经硅胶柱上的层析法纯化，使用乙酸乙酯-己烷-乙酸作为洗脱液，得到51mg(30％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.27(s,br,1H,NH-1),12.28(s,vbr,2H,2xCOOH),11.11(s,br,1H,NH-1),8.34(d,J=1.36Hz,1H,H-4),7.78(s,1H,H-乙烯基)，7.40(dd,J=1.36,8.20Hz,1H,H-6),7.19(d,J=3.07Hz,1H,H-5’),6.93(d,J=8.20Hz,1H,H-7),2.65(t,J=7.56Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.56Hz,2H,CH2CH2COOH),2.29(s,3H,CH3)；MSm/z 341.0[M+1]+。
将5-氯磺酰基-2-羟基吲哚(2.1g)加入到在10mL乙醇中的10mL氢氧化铵中并在室温下搅拌过夜。浓缩混合物并经真空过滤收集固体，得到0.4g(20％收率)为灰白色固体的5-氨基磺酰基-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.67(s,1H,NH-1),7.63-7.66(m,2H,H-4,6),7.13(s,2H,5-SO2NH2),6.91(d,J=8.04Hz,1H,H-7)和3.56(s,2H,CH2-3)；MSm/z(相对强度，％)，211([M-1]+,100)。
在95℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90.6mg)、106mg 5-氨基磺酰基-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥，得到132mg(70％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.28(s,br,1H,NH-1’),12.0(s,vbr,1H,COOH),11.15(s,br,1H,NH-1),8.20(d,J=1.60Hz,1H,H-4),7.73(s,1H,H-乙烯基)，7.59(dd,J=1.60,8.17Hz,1H,H-6),7.22(d,J=2.85Hz,1H,H-2’),7.10(s,2H,NH2),6.98(d,J=8.17Hz,1H,H-7),2.67(t,J=7.41Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.41Hz,2H,CH2CH2COOH)，和2.29(s,3H,CH3)。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ10.87(s,br,1H,NH-1),7.86(s,br,1H,5-SO2NHCH3),7.61(d,J=7.80Hz,1H,H-6),7.32(d,J=4.67Hz,1H,H-4),6.97(d,J=7.80Hz,1H,H-7),2.53(s,2H,CH2-3)，和2.36(s,3H,5-SO2NHCH3)；MS m/z(相对强度，％)，226(M+,100)。
在95℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90.6mg)、113mg5-甲基氨基磺酰基-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥，得到163mg(83％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.30(s,br,1H,NH-1’),12.0(s,vbr,1H,COOH),11.19(s,br,1H,NH-1),8.18(d,J=1.64Hz,1H,H-4),7.80(s,1H,H-乙烯基)，7.53(dd,J=1.64,8.17Hz,1H,H-6),7.23(d,J=2.80Hz,1H,H-2’),7.13(q,J=5.15 Hz,1H,NHCH3),7.02(d,J=8.17Hz,1H,H-7),3.84(s,3H,COOCH3),2.66(t,J=7.54Hz,2H,CH2CH2COOH),2.47(t,J=7.54Hz,2H,CH2CH2COOH),2.41(d,J=5.15Hz,3H,NCH3),2.30(s,3H,CH3)；MSm/z 390[M+1]+。
将氰化钾(2.0g)加入到15mL二甲基亚砜中并加热至90℃。伴随搅拌下，缓慢加入溶于5mL二甲基亚砜中的5-氯乙基-2-羟基吲哚(3.0g)，并将反应物加热至150℃反应2小时。将混合物冷却，倾入到冰水中并通过真空过滤收集沉淀，用水洗涤并干燥，得到粗品产物。使用在氯仿中的5％甲醇将粗品物料在硅胶上层析化，得到1.2g(42％收率)的标题化合物。
将在含有25mL浓盐酸的10mL水中的5-氰基乙基-2-羟基吲哚(4.02g)回流4小时。将混合物冷却，加入水并通过真空过滤收集生成的固体，用水洗涤并干燥，得到1.9g(44％收率)为黄色固体的5-羧基乙基-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ12.00(s,br,1H,5-CH2CH2COOH),10.21(s,1H,NH-1),7.05(s,1H,H-4),6.99(d,J=8.68Hz,1H,H-6),6.69(d,J=8.68Hz,1H,H-7),3.40(s,2H,CH2-3),2.74(t,J=7.44Hz,2H,5-CH2CH2COOH)和2.46(t,J=7.44Hz,2H,-CH2CH2COOH)。
在95℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90.6mg)、102.6mg 5-羧基乙基-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜。将粗品固体经硅胶柱上的层析法纯化，用乙酸乙酯-己烷-乙酸洗脱，得到121mg(66％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.30(d,J=2.38Hz,1H,NH-1’),12.03(s,vbr,2H,2xCOOH),10.68(s,br,1H,NH-1),7.63(s,1H,H-4),7.59(s,1H,H-乙烯基)，7.12(d,J=2.64Hz,1H,H-2’),6.96(dd,J=1.22,7.93 Hz,1H,H-6),6.75(d,J=7.93Hz,1H,H-7),2.81(t,J=7.75Hz,2H,CH2CH2COOH),2.65(t,J=7.75Hz,2H,CH2CH2COOH),2.55(t,J=7.75Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.42Hz,CH2CH2COOH)和2.26(s,3H,CH3)。
在冰浴上，将在15mL三氟乙酸中的5-乙酰基-2-羟基吲哚(2g)用1.8g三乙基硅烷缓慢处理并然后在室温下搅拌5小时。加入1mL三乙基硅烷并继续搅拌过夜。将反应混合物倾入到冰水中并通过真空过滤收集生成的沉淀，用水大量洗涤并真空下干燥，得到1.3g(71％收率)作为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.25(s,br,NH-1),7.03(s,1H,H-4),6.97(d,J=8.05Hz,1H,H-6),6.69(d,J=8.05Hz,1H,H-7),3.40(s,2H,CH2-3),2.51(q,J=7.69Hz,2H,CH2CH3-5)和1.12(t,J=7.42Hz,3H,CH2CH3-5)。
在95℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90.6mg)、80.5mg 5-乙基-2-羟基吲哚和75μL哌啶在2mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀,用水洗涤至pH 6并在真空烘箱中干燥过夜。将粗品固体经硅胶柱上的层析法纯化,用乙酸乙酯-己烷-乙酸洗脱,得到52mg(32％)标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.31(s,br,1H,NH-1’),12.04(s,vbr,1H,COOH),10.66(s,1H,NH-1),7.59(s,2H,H-4和H-乙烯基),7.11(d,J=3.29Hz,1H,H-2’),6.94(d,J=7.85Hz,1H,H-6),6.75(d,J=7.85Hz,1H,H-7),2.65(t,J=7.66Hz,2H,CH2CH2COOH),2.57(q,J=7.83Hz,2H,CH3CH2),2.46(t,J=7.66Hz,CH2CH2COOH),1.20(t,J=7.83,3H,CH3CH2),2.26(s,3H,CH3)；MSm/z325[M+1]+。
将含有5mL水的浓硫酸(45mL)温热至60℃并一次性加入8.6gN-(2-肟基乙酰基)甲氧基苯胺。在93℃下，将搅拌着的混合物加热10分钟并然后使之冷却至室温。将混合物倾入到500g冰中并用乙酸乙酯提取3次。经无水硫酸钠干燥合并的提取液并浓缩，得到5.1g(65％收率)为深红色固体的5-甲氧基靛红。
将5-甲氧基靛红(5.0g)和30mL水合肼加热至回流15分钟。将反应混合物冷却至室温并加入50mL水。用25mL乙酸乙酯将混合物提取3次，合并有机层，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到黄色固体。将固体在乙酸乙酯中搅拌并通过真空过滤除去不溶的物料且保留。该物料证明是2-肼基-羰基甲基-4-甲氧基苯胺。浓缩滤液并在硅胶上层析化，用乙酸乙酯∶己烷1∶1洗脱得到0.7g作为深黄色固体的5-甲氧基-2-羟基吲哚。将1.1g 2-肼基羰基甲基-4-甲氧基苯胺在20mL1N氢氧化钠中回流1小时。将混合物冷却，用浓盐酸酸化至pH2并用25mL乙酸乙酯提取3次。合并有机提取液，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到0.8g作为深黄色固体的5-甲氧基-2-羟基吲哚。合并收率为1.5g或33％。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.13(s,1H,NH-1),6.84(s,1H,H-4),6.72(d,J=8.68Hz,1H,H-6),6.69(d,J=8.68Hz,1H,H-7),3.68(s,3H,OCH3-5),3.41(s,2H,CH2-3)。MSm/z(相对强度，％)163([M+1]+,100)。
将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90mg)、82mg 5-甲氧基-2-羟基吲哚和2滴哌啶在2mL乙醇中加热至95℃过夜。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到110mg(67％)为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.38(s,br,1H,NH-1’),12.03(s,vbr,1H,COOH),10.57(s,1H,NH-1),7.63(s,1H,H-乙烯基)，7.42(d,J=2.46Hz,1H,H-4),7.12(d,J=3.08Hz,1H,H-2’),6.74(d,J=8.26Hz,1H,H-6),6.75(dd,J=2.46,8.26Hz,1H,H-7),3.77(s,3H,OCH3),2.65(t,J=7.40 Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.40Hz,CH2CH2COOH),2.27(s,3H,CH3)；MS m/z(相对强度，％)327([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ12.04(s,vbr,1H,COOH),10.80(s,br,1H,NH-1),8.0(d,J=2.06 Hz,1H,H-4),7.67(s,1H,H-乙烯基)，7.19(dd,J=2.06,8.40 Hz,1H,H-6),6.79(d,J=8.40 Hz,1H,H-7),2.65(t,J=7.63Hz,2H,CH2CH2COOH),2.35(t,J=7.63Hz,2H,CH2CH2COOH),2.29(s,3H,CH3),2.27(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)389([M+1]+,100)。
3-[5-(5-碘代-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸在95℃下，将3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯(97.5mg)、130mg 5-碘代-2-羟基吲哚和75μL哌啶在3mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到155mg(71％)为橙色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.41(s,br,1H,NH-1’),12.03(s,br,1H,COOH),10.79(s,br,1H,NH-1),8.12(d,J=1.70Hz,1H,H-4),7.65(s,1H,H-乙烯基)，7.36(dd,J=1.70,7.93Hz,1H,H-6),6.79(d,J=7.93Hz,1H,H-7),2.64(t,J=7.76Hz,2H,CH2CH2COOH),2.34(t,J=7.76Hz,2H,CH2CH2COOH),2.29(s,3H,CH3),2.27(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)437([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ13.41(s,br,1H,NH-1’),12.03(s,br,1H,COOH),10.79(s,br,1H,NH-1),8.12(d,J=1.70Hz,1H,H-4),7.65(s,1H,H-乙烯基)，7.36(dd,J=1.70,7.93Hz,1H,H-6),6.79(d,J=7.93Hz,1H,H-7),2.64(t,J=7.76Hz,2H,CH2CH2COOH),2.34(t,J=7.76Hz,2H,CH2CH2COOH),2.29(s,3H,CH3),2.27(s,3H,CH3)。
MS m/z(相对强度，％)437([M+1]+,100)。实施例213-[2,4-二甲基-5-(4-甲基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基-甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸在95℃下，将3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯(97.5mg)、74mg4-甲基-2-羟基吲哚和75μL哌啶在3mL乙醇中加热5小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到60mg(37％)为绿色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.41(s,br,1H,NH-1'),12.03(s,br,1H,COOH),10.72(s,br,1H,NH-1),7.50(s,1H,H-乙烯基)，7.01(t,J=7.82Hz,1H,H-6),6.79(d,J=7.82Hz,H-5),6.74(d,J=7.82Hz,1H,H-7),2.64(t,J=7.76Hz,2H,CH2CH2COOH),2.56(s,3H,CH3),2.34(t,J=7.76Hz,2H,CH2CH2COOH),2.29(s,3H,CH3),2.18(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)325([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.38(s,br,1H,NH-1’),12.02(s,br,1H,COOH),10.57(s,br,1H,NH-1),7.52(s,br,1H,H-4),7.50(s,1H,H-乙烯基)，6.87(d,J=7.86Hz,1H,H-6),6.73(d,J=7.86Hz,1H,H-7),2.63(t,J=7.49Hz,2H,CH2CH2COOH),2.34(t,J=7.49Hz,2H,CH2CH2COOH),2.29(s,3H,CH3),2.28(s,3H,CH3)和2.24(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)325([M+1]+,66)。实施例233-[5-(6-羟基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸将在60mL二氯甲烷中的3.26g6-甲氧基-2-羟基吲哚冷却至-2℃并滴加40mL在二氯甲烷中的1M三溴化硼溶液。在冰浴上，将反应混合物搅拌1小时并然后在室温下搅拌1小时。然后将其倾入到冰水中并用乙酸乙酯提取。用水和盐水洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥，浓缩，过滤形成的沉淀并然后在真空烘箱中干燥过夜，得到2.56g 6-羟基-2-羟基吲哚(86％收率)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.13(s,1H,NH-1),9.22(s,1H,OH-6),6.93(d,J=7.76Hz,1H,H-4),6.27-6.31(m,2H,H-5,7)和3.29(s,2H,CH2-3)；MSm/z150[M+1]+。
在90℃下，将3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯(82mg)、63mg 6-羟基-2-羟基吲哚和48μL哌啶在2mL乙醇中加热2天。将反应混合物冷却，浓缩，并经硅胶柱上的层析法纯化，用乙酸乙酯-己烷-乙酸洗脱，得到55mg(40％)作为深棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.10(s,br,1H,NH-1’),12.0(s,vbr,1H,COOH),10.51(s,br,1H,NH-1),9.41(s,1H,OH),7.44(d,J=7.83,1H,H-4),7.29(s,1H,H-乙烯基)，6.37(dd,J=2.16,7.83Hz,1H,H-5),6.33(d,J=2.16Hz,1H,H-7),2.62(t,J=7.75Hz,2H,CH2CH2COOH),2.32(t,J=7.75Hz,2H,CH2CH2COOH),2.25(s,3H,CH3),2.20(s,3H,CH3)；MSm/z325([M+1]+)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.15(s,br,1H,NH-1’),11.75(s,vbr,1H,COOH),10.65(s,br,1H,NH-1),7.58(d,J=8.27,1H,H-4),7.29(s,1H,H-乙烯基)，6.37(dd,J=2.26,8.27Hz,1H,H-5),6.33(d,J=2.26Hz,1H,H-7),3.74(s,3H,OCH3),2.62(t,J=7.67Hz,2H,CH2CH2COOH),2.33(t,J=7.67Hz,2H,CH2CH2COOH),2.26(s,3H,CH3)和2.22(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)341([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.05(s,br,1H,NH-1’),10.60(s,br,1H,NH-1),9.4(s,1H,OH),7.49(d,J=8.08,1H,H-4),7.35(s,1H,H-乙烯基)，7.02(d,J=3.22Hz,1H,H-2’),6.38(dd,J=2.28,8.08Hz,1H,H-5),6.32(d,J=2.28Hz,1H,H-7),2.62(t,J=7.67Hz,2H,CH2CH2COOH),2.44(t,J=7.67Hz,2H,CH2CH2COOH)，和2.21(s,3H,CH3)；MS m/z(相对强度，％)313([M+1]+,60)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.06(s,br,1H,NH-1’),10.60(s,br,1H,NH-1),9.4(s,br,1H,OH),7.49(d,J=8.03,1H,H-4),7.35(s,1H,H-乙烯基)，7.01(d,J=3.08Hz,1H,H-2’),6.47(d,J=2.29Hz,2H，芳香的)，6.42(t,J=2.29Hz,1H，芳香的)，6.38(dd,J=2.1 5,8.03Hz,1H,H-5),6.33(d,J=2.15Hz,1H,H-7),5.01(s,2H,CH2-ph),3.70(s,6H,2xOCH3),2.59-2.72(m,4H,CH2CH2COOH)，和2.20(s,3H,CH3)。
将丙二酸二甲酯(9.7mL)滴加入到悬浮于50mL二甲基亚砜中的2.0g氢化钠中。在100℃下，将混合物加热35分钟并然后冷却至室温。加入在50mL二甲基亚砜中的4-氟-2’-甲氧基-3-硝基联苯(4.2g)并将混合物加热至100℃反应1小时。将反应混合物冷却并用300mL饱和氯化铵溶液骤冷且用乙酸乙酯提取两次。合并提取液，用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到为浅黄色固体的粗品3’-甲氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
在110℃下，将粗品3’-甲氧基-3-硝基-联苯-4-丙二酸酯在45mL 6N盐酸中加热4天并冷却。通过过滤收集沉淀，用水和已烷洗涤并干燥，得到5.3g为浅褐色固体的3’-甲氧基-2-硝基联苯-4-乙酸。
将3’-甲氧基-3-硝基联苯-4-乙酸(5.2g)溶于甲醇中并在室温下经0.8g 10％钯炭氢化3小时。通过过滤除去催化剂，用甲醇洗涤并合并滤液且浓缩，得到棕色固体。用乙酸乙酯∶己烷∶乙酸33∶66∶1将该固体在硅胶上层析，得到3.0g(基于4-氟-3’-甲氧基-3-硝基联苯75％收率)为桃红色固体的6-(3-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.39(s,br,1H,NH),7.35(t,J=7.85Hz,1H),7.26(d,J=7.78Hz,1H),7.19(dd,J=1.22,7.8Hz,1H),7.13-7.16(m,1H),7.09-7.1(m,1H),7.01(d,J=1.48Hz,1H),6.90-6.93(m,1H),3.8(s,3H,OCH3),3.49(s,2H,CH2)；MS m/z(相对强度，％)240.0([M+1]+,100)。
在90℃下，将3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯(117mg)、120mg 6-(3-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚和3滴哌啶在3mL乙醇中加热过夜。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到190mg(91％)为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.38(s,br,1H,NH-1’),12.04(s,br,1H,COOH),10.79(s,br,1H,NH-1),7.77(d,J=8.05,1H,H-4),7.58(s,1H,H-乙烯基)，7.27(dd,J=1.49,8.05Hz,1H,H-5),7.09(d,J=1.49Hz,1H,H-7),6.89-7.59(m,4H),3.81(s,3H,OCH3),2.65(t,J=7.62Hz,2H,CH2CH2COOH),2.35(t,J=7.62Hz,2H,CH2CH2COOH),2.30(s,3H,CH3)和2.27(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)417([M+1]+,75)。
在110℃下，将粗品4-溴-2-硝基苯基丙二酸二甲酯在40mL 6N盐酸中加热24小时并冷却。通过过滤收集沉淀，用水洗涤并干燥，得到5.3g(89％收率)为灰白色固体的4-溴-2-硝基苯基乙酸。
在100℃下，将在5mL乙醇中的4-溴-2-硝基苯基乙酸(0.26g)、0.26g锌粉和3mL 50％硫酸加热过夜。过滤反应混合物，用少量乙酸稀释，浓缩除去乙醇，用水稀释并用乙酸乙酯提取两次。用盐水洗涤合并的提取液，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到0.19g(90％收率)为黄色固体的6-溴-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.45(s,br,1H,NH-1),7.14(d,J=7.89Hz,1H,H-4),7.09(dd,J=1.53,7.89Hz,1H,H-5),6.93(d,J=1.53Hz,1H,H-7)和3.43(s,2H,CH2-3)；MSm/z(相对强度，％)210([M-2]+,100)和212(M+,100)。
在90℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90mg)、106mg 6-溴-2-羟基吲哚和3滴哌啶在3mL乙醇中加热4小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到172mg(92％)为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.22(s,br,1H,NH-1’),12.04(s,br,1H,COOH),10.92(s,br,1H,NH-1),7.73(d,J=8.37,1H,H-4),7.67(s,1H,H-乙烯基)，7.18(d,J=3.22Hz,1H,H-2’),7.14(dd,J=1.33,8.37Hz,1H,H-5),6.99(d,J=1.33Hz,1H,H-7),2.64(t,J=7.39Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.39Hz,2H,CH2CH2COOH),2.25(s,3H,CH3)；MS(APCI)m/z375.0[M+1]+。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.29(s,br,1H,NH-1’),12.07(s,br,1H,COOH),10.88(s,br,1H,NH-1),7.82(d,J=7.77,1H,H-4),7.65(s,1H,H-乙烯基)，7.27(dd,J=1.41,7.77Hz,1H,H-5),7.09(d,J=1.41Hz,1H,H-7),6.89-7.36(m,5H),3.82(s,3H,OCH3),2.65(t,J=7.55Hz,2H,CH2CH2COOH),2.47(t,J=7.55Hz,2H,CH2CH2COOH),2.27(s,3H,CH3)；MS(APCI)m/z 401[M-1]+。
将丙二酸二甲酯(11.4mL)滴加入到悬浮于20mL二甲基亚砜中的4.0g氢化钠中。将混合物加热至100℃反应10分钟并冷却至室温。加入在25mL二甲基亚砜中的粗品4-氟-3’-乙氧基-3-硝基联苯(5.3g)并在100℃下将混合物加热2小时。将反应混合物冷却并用300mL饱和氯化铵溶液骤冷且用乙酸乙酯提取三次。合并提取液，用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到为黄色油的粗品3’-乙氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
在100℃下，将粗品3’-乙氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯在60mL 6N盐酸中加热总共4天并冷却。通过过滤收集沉淀，用水和己烷洗涤并干燥，得到4.7g(基于5-溴-2-氟硝基苯77％收率)为淡褐色固体的粗品3’-乙氧基-3-硝基联苯-4-乙酸。
将铁屑(2.4g)一次性加入到在40mL冰乙酸中的4.6g 3’-乙氧基-3-硝基联苯-4-乙酸中并将混合物回流2小时。将反应混合物浓缩至干，用乙酸乙酯重复处理并过滤除去不溶的物料。将滤液用1N盐酸和盐水先后洗涤两次，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到3.5g(91％收率)为淡棕色固体的6-(3-乙氧基苯基)-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.4(s,br,1H,NH),7.33(t,J=8.4Hz,1H,H-3’),7.35(d,J=7.77Hz,1H),7.19(dd,J=1.3,7.66Hz,1H),7.13(d,J=7.69Hz,1H),7.07-7.08(m,1H),7.0(s,br,1H),6.9(dd,J=2.82,8.08Hz,1H),4.08(q,J=7Hz,2H,OEt),3.49(s,2H,CH2),1.34(t,J=7Hz,3H,OEt)；MS m/z(相对强度，％)254.2([M+1]+,100)。
在90℃下，将3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯(97.6mg)、127mg 6-(3-乙氧基苯基)-2-羟基吲哚和2滴哌啶在2mL乙醇中加热过夜。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到227mg为棕色固体的标题化合物(～100％)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.38(s,br,1H,NH-1’),12.06(s,br,1H,COOH),10.81(s,br,1H,NH-1),7.77(d,J=7.97,1H,H-4),7.58(s,1H,H-乙烯基)，7.26(dd,J=1.35,7.97Hz,1H,H-5),7.08(d,J=1.35Hz,1H,H-7),6.87-7.36(m,4H),4.09(q,J=7.0Hz,2H,CH3CH2),2.65(t,J=7.54Hz,2H,CH2CH2COOH),2.47(t,J=7.54Hz,2H,CH2CH2COOH),2.30(s,3H,CH3),2.26(s,3H,CH3),1.34(t,J=7.0Hz,3H,CH3CH2)；MSm/z(相对强度，％)431([M+1]+,21)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.29(s,br,1H,NH-1'),12.07(s,vbr,1H,COOH),10.88(s,br,1H,NH-1),7.82(d,J=7.97,1H,H-4),7.65(s,1H,H-乙烯基)，7.28(dd,J=1.20,7.97Hz,1H,H-5),7.08(d,J=1.20Hz,1H,H-7),6.87-7.36(m,5H),4.09(q,J=6.98Hz,2H,CH3CH2),2.65(t,J=7.47Hz,2H,CH2CH2COOH),2.47(t,J=7.47Hz,2H,CH2CH2COOH),2.27(s,3H,CH3),1.34(t,J=6.98Hz,3H,CH3CH2)。
将在25mL二甲基亚砜中的丙二酸二甲酯(10mL)滴加入到悬浮于25mL二甲基亚砜中的3.5g氢化钠中并在100℃下将混合物加热10分钟。将混合物冷却至室温并加入在25mL二甲基亚砜中的4.7g4-氟-3-硝基联苯。在100℃下，将混合物加热2小时，冷却并用300mL饱和氯化铵溶液骤冷。将混合物用乙酸乙酯提取三次并用水和盐水洗涤合并的有机层且蒸发，得到黄色油的粗品3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
将粗品3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯在30mL 6N盐酸中回流24小时。通过过滤收集沉淀，用水洗涤并干燥，得到4.5g(80％基于4-氟-3-硝基联苯计)为乳色固体的3-硝基联苯-4-乙酸。
将铁屑(2.6g)一次性加入到在40mL乙酸中的4.5g 3-硝基联苯-4-乙酸中。将混合物回流2小时，浓缩至干并用乙酸乙酯处理。通过过滤除去固体并将滤液用1N盐酸和盐水洗涤两次且经无水硫酸钠干燥。浓缩滤液，得到3.4g(93％收率)为淡棕色固体的6-苯基-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.4(s,br,1H,NH-1),7.57-7.6(m,2H),7.42-7.46(m,2H),7.32-7.37(m,1H),7.27(d,J=7.7,1H,H-4),7.19(dd,J=1.6,7.7Hz,1H,H-5),7.01(d,J=1.6Hz,1H,H-7),3.49(s,2H,CH2)；MS m/z(相对强度，％)210([M+1]+,100)。
在90℃下，将3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯(97.6mg)、105mg 6-苯基-2-羟基吲哚和2滴哌啶在2mL乙醇中加热过夜。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到138mg(71％)为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.38(s,br,1H,NH-1’),12.05(s,br,1H,COOH),10.81(s,br,1H,NH-1),7.78(d,J=7.84,1H,H-4),7.58(s,1H,H-乙烯基)，7.25-7.63(m,6H),7.09(s,br,1H,H-7),2.64(t,J=7.71Hz,2H,CH2CH2COOH),2.35(t,J=7.71Hz,2H,CH2CH2COOH),2.30(s,3H,CH3)和2.26(s,3H,CH3)；MS m/z(相对强度，％)387([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.29(s,br,1H,NH-1’),12.01(s,vbr,1H,COOH),10.89(s,br,1H,NH-1),7.83(d,J=7.92,1H,H-4),7.65(s,1H,H-乙烯基)，7.30-7.65(m,5H),7.16(d,J=2.83Hz,1H,H-2'),7.28(dd,J=1.58,7.92Hz,1H,H-5),7.09(d,J=1.58Hz,1H,H-7),2.66(t,J=7.76Hz,2H,CH2CH2COOH),2.45(t,J=7.76Hz,2H,CH2CH2COOH)和2.27(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)373([M+1]+,100)。实施例343-{5-[6-(4-甲氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸将四(三苯基膦)钯(1g)加入到在50mL甲苯和50mL乙醇中的5g4-甲氧基苯基硼酸、6.6g 5-溴-2-氟硝基苯和30mL 2M碳酸钠溶液的混合物中。将混合物回流2小时，浓缩，并将残余物用乙酸乙酯提取两次。用水和盐水洗涤乙酸乙酯层，干燥并浓缩，得到棕色油状固体。使用在己烷中的5％乙酸乙酯将固体在硅胶上层析，得到为浅黄色固体的粗品4-氟-4’-甲氧基-3-硝基联苯。
将丙二酸二甲酯(10mL)滴加入到悬浮于60mL二甲基亚砜中的2.0g氢化钠中。将混合物加热至100℃反应10分钟并冷却至室温。加入在50mL二甲基亚砜中的粗品4-氟-2’-甲氧基-3-硝基联苯(5.2g)并在100℃下将混合物加热2小时。将反应混合物冷却并用300mL饱和氯化铵溶液骤冷且用乙酸乙酯提取三次。合并提取液，用饱和氯化铵、水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到为黄色油的粗品4’-甲氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
在100℃下，将粗品4’-甲氧基-3-硝基-联苯-4-丙二酸酯在60mL 6N盐酸中加热15小时并冷却。通过过滤收集形成的沉淀，用水和己烷洗涤并干燥，得到7.2g为淡褐色固体的粗品4’-甲氧基-3-硝基联苯-4-乙酸。
将铁屑(3.6g)一次性加入到在50mL冰乙酸中的7.2g 4’-甲氧基-3-硝基联苯-4-乙酸中并在100℃下加热过夜。将反应混合物浓缩至干，在乙酸乙酯中进行超声处理并过滤除去不溶物。将滤液用1N盐酸和盐水先后洗涤两次，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到2.7g(基于5-溴-2-氟硝基苯计54％收率)为玫瑰红色固体的6-(4-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.38(s,br,1H,NH-1),7.52(d,J=9Hz,2H,),7.23(d,J=7.3Hz,1H,H-4),7.14(d,d,J=1.38,7.3Hz,1H,H-5),7.0(d,J=9Hz,2H),6.96(d,J=1.38Hz,1H,H-7),3.78(s,3H,OCH3),3.47(s,2H,CH2)；MSm/z(相对强度，％)214.0([M+1]+,100)。
在90℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(90.5 mg)、120mg 6-(4-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚和3滴哌啶在2mL乙醇中加热过夜。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到118mg(59％)为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.26(s,br,1H,NH-1’),10.83(s,br,1H,NH-1),7.78(d,J=8.07Hz,1H,H-4),7.61(s,1H,H-乙烯基)，7.56(d,J=8.97Hz,2H),7.22(dd,J=1.44,8.07Hz,1H,H-5),7.13(d,J=3.09Hz,1H,H-2’),7.04(d,J=1.44Hz,1H,H-7),7.0(d,J=8.97Hz,2H),3.79(s,3H,OCH3),2.65(t,J=7.54Hz,2H,CH2CH2COOH),2.44(t,J=7.54Hz,2H,CH2CH2COOH)和2.27(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)404([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.35(s,br,1H,NH-1’),12.02(s,br,1H,COOH),10.75(s,br,1H,NH-1),7.73(d,J=6.75Hz,1H,H-4),7.56(d,J=9.01Hz,2H),7.54(s,1H,H-乙烯基)，7.21(dd,J=1.59,6.75Hz,1H,H-5),7.04(d,J=1.59Hz,1H,H-7),7.01(d,J=9.01Hz,2H),3.79(s,3H,OCH3),2.65(t,J=7.54Hz,2H,CH2CH2COOH),2.35(t,J=7.54Hz,2H,CH2CH2COOH),2.29(s,3H,CH3)和2.26(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)417([M+1]+,100)。实施例363-{5-[6-(2-甲氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸将四(三苯基膦)钯(1g)加入到在50mL甲苯和50mL乙醇中的5g2-甲氧基苯基硼酸、6.6g 5-溴-2-氟硝基苯和30mL 2M碳酸钠溶液的混合物中。将混合物回流2小时，浓缩，并将残余物用乙酸乙酯提取两次。用水和盐水洗涤合并的乙酸乙酯层，干燥并浓缩，得到深绿色的油，其放置固化，得到粗品4-氟-2’-甲氧基-3-硝基联苯。
将丙二酸二甲酯(14mL)滴加入到悬浮于50mL二甲基亚砜中的2.9g氢化钠中。在100℃下，将混合物加热15分钟并冷却至室温。
加入在60mL二甲基亚砜中的粗品4-氟-2’-甲氧基-3-硝基联苯并在100℃下将混合物加热2小时。将反应混合物冷却并用300mL饱和氯化铵溶液骤冷且用乙酸乙酯提取两次。合并提取液，用饱和氯化铵、水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到为黄色油的粗品2’-甲氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸二甲酯。
在100℃下，将粗品2’-甲氧基-3-硝基联苯-4-丙二酸酯在50mL 6N盐酸中加热24小时并冷却。通过过滤收集沉淀，用水和己烷洗涤并干燥，得到9.8g作为淡褐色固体的2’-甲氧基-2-硝基联苯-4-乙酸。
将铁屑(5g)一次性加入到在50mL冰乙酸中的9.8g 2’-甲氧基-3-硝基联苯-4-乙酸中并将混合物加热至100℃反应3小时。将反应混合物浓缩至干，在乙酸乙酯中进行超声处理并过滤除去不溶物。将滤液用1N盐酸、水和盐水洗涤两次，经无水硫酸钠干燥并浓缩。使用乙酸乙酯∶己烷1∶2将残余物在硅胶上层析，得到5.4g(基于5-溴-2-氟硝基苯计69％收率)为玫瑰红色固体的6-(2-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.32(s,br,1H,NH),7.29-7.34(m,1H),7.19-7.25(m,2H),7.08(d,J=8Hz,1H,H-4),6.97-7.02(m,2H),6.91(d,J=1.05Hz,1H,H-7),3.8(s,3H,OCH3),3.47(s,2H,CH2)；MSm/z(相对强度，％)239.8(100,[M+1]+)。
在90℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(217mg)、239mg 6-(2-甲氧基苯基)-2-羟基吲哚和3滴哌啶在2mL乙醇中加热过夜。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到348mg(86％)为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.29(s,br,1H,NH-1’),11.59(s,br,1H,COOH),10.78(s,br,1H,NH-1),7.75(d,J=8.13Hz,1H,H-4),7.62(s,1H,H-乙烯基)，7.0-7.34(m,7H),3.76(s,3H,OCH3),2.66(t,J=7.46Hz,2H,CH2CH2COOH),2.46(t,J=7.46Hz,2H,CH2CH2COOH)和2.27(s,3H,CH3)；MS m/z(相对强度，％)401([M+1]+,100)。
将粗品固体经硅胶柱上的层析纯化，用含有0.1％乙酸的乙酸乙酯∶己烷1∶1洗脱，得到182mg(44％)为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.38(s,br,1H,NH-1'),12.0(s,br,1H,COOH),10.7(s,br,1H,NH-1),7.71(d,J=7.74Hz,1H,H-4),7.55(s,1H,H-乙烯基)，7.0-7.33(m,6H),3.76(s,3H,OCH3),2.65(t,J=7.6 Hz,2H,CH2CH2COOH),2.35(t,J=7.6Hz,2H,CH2CH2COOH),2.3(s,3H,CH3)和2.26(s,3H,CH3)；MS(APCI neg)m/z(相对强度，％)415([M-1],100)。实施例383-[2,4-二甲基-5-(6-吗啉-4-基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸将氯化锡二水合物(225g)加入到2,4-二硝基苯基乙酸(22.6g)在乙醇(450mL)中的溶液中。在90℃下，将混合物加热10小时。将反应混合物冷却并用12M氢氧化钠碱化至pH11。通过过滤除去固体并浓缩滤液。用乙醇(300mL)处理残余物。过滤不溶物并用乙醇(5×60mL)洗涤。蒸发合并的乙醇洗液并真空下干燥，得到15g为棕色粉末的6-氨基-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.03(s,br,NH),6.78(d,J=8.55Hz,1H,H-4),6.09-6.11(m,2H),4.95(s,br,2H,NH2),3.22(s,2H,H-3)；MS(+APCI)m/z(相对强度，％)147([M-1]+,100)。
将6-氨基-2-羟基吲哚(2.2g)、4.0g 2,2’-二溴乙醚和7.9g碳酸钠在20mL乙醇中回流过夜，浓缩并用50mL水稀释。将混合物用50mL乙酸乙酯提取3次，合并有机提取液，用20mL盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩至干。将固体在硅胶柱上层析，用含有0.7％乙酸的乙酸乙酯∶己烷1∶1洗脱，得到1.2g(37％收率)为米色固体的6-(吗啉-4-基)-2-羟基吲哚。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.2(s,br,1H,NH-1),7.02(d,J=7.87Hz,1H,H-4),6.47(dd,J=2.11,7.87Hz,1H,H-5),6.37(d,J=2.11Hz,1H,H-7),3.69-3.72(m,4H),3.32(s,2H,CH2),3.01-3.04(m,4H)；MSm/z(相对强度，％)219([M+1]+,100)。
在90℃下，将3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯(3.3g)、4g 6-(吗啉-4-基)-2-羟基吲哚和1.8mL哌啶在60mL乙醇中加热7小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜。将生成的固体经硅胶柱上的层析法纯化，用乙酸乙酯-己烷-乙酸洗脱，得到2.78g(38％收率)为棕色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.13(s,br,1H,NH-1’),12.02(s,br,1H,COOH),10.57(s,br,1H,NH-1),7.52(d,J=8.46Hz,1H,H-4),7.32(s,1H,H-乙烯基)，6.58(dd,J=1.99,8.46Hz,1H,H-5),6.41(d,J=1.99Hz,1H,H-7),3.71-3.74(m,4H),3.06-3.09(m,4H),2.62(t,J=7.57Hz,2H,CH2CH2COOH),2.33(t,J=7.57Hz,2H,CH2CH2COOH),2.26(s,3H,CH3)和2.21(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)396([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ10.38(s,br,1H,NH),7.19(d,J=8Hz,1H，芳香的)，6.64(d,J=8Hz,1H，芳香的)，3.46(s,2H,H-3),2.19(s,2H,CH3)。
在90℃下，将3-(2-羧基乙基)-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯(98mg)、91mg 5-氯-4-甲基-2-羟基吲哚和2滴哌啶在2mL乙醇中加热4小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到100mg的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.47(s,br,1H,NH-1’),12.03(s,br,1H,COOH),10.83(s,br,1H,NH-1),7.61(s,1H,H-乙烯基)，7.14(d,J=8.17Hz,1H，芳香的)，6.74(d,J=8.17Hz,1H，芳香的)，2.64(s,3H,CH3),2.64(t,J=7.62Hz,2H,CH2CH2COOH),2.34(t,J=7.62Hz,2H,CH2CH2COOH),2.3(s,3H,CH3)和2.20(s,3H,CH3)。实施例403-[5-(5-氯-4-甲基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸在90℃下，将4-(2-羧基乙基)-2-甲酰基-3-甲基吡咯(91mg)、91mg5-氯-4-甲基-2-羟基吲哚和2滴哌啶在2mL乙醇中加热4小时。将反应混合物冷却并浓缩。将残余物悬浮于6N盐酸水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤至pH6并在真空烘箱中干燥过夜，得到95mg的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.36(s,br,1H,NH-1’),11.98(s,br,1H,COOH),10.92(s,br,1H,NH-1),7.68(s,1H),7.19(d,J=7.14Hz,1H，芳香的)，7.17(s,1H),6.75(d,J=7.14Hz,1H，芳香的)，2.66(s,3H,CH3-4),2.66(t,J=7.51Hz,2H,CH2CH2COOH),2.45(t,J=7.51Hz,2H,CH2CH2COOH),2.21(s,3H,CH3)；MSm/z(相对强度，％)345([M+1]+,100)。
或者，将117g 318-005在470mL水中的悬浮液加入到在74mL水中的16.47g氢氧化钠中。在室温下，将混合物搅拌15分钟并过滤。将滤液加入到210mL乙醇中并通过抽吸过滤收集形成的生成的沉淀。干燥后，得到总共106g标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.34(s,br,1H,NH-1’),10.82(s,br,1H,NH-1),7.65(d,J=7.52Hz,1H,H-4),7.5(s,1H,H-乙烯基)，7.04(t,J=7.52Hz,1H,H-6),6.93(t,J=7.52Hz,1H,H-5),6.85(d,J=7.52Hz,1H,H-7),2.55(t,J=6.95Hz,2H,CH2CH2COOH),2.28(s,3H,CH3),2.24(s,3H,CH3)和1.99(t,J=6.95Hz,2H,CH2CH2COOH)。
步骤2向氢化铝锂(2.67g,70mmol)在四氢呋喃(100ml)中的悬浮液中滴加入3-(2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)-1-吗啉-4-基-丙-1-酮(13.84g,59mmol)在四氢呋喃(50ml)中的溶液。在80℃下，将反应混合物搅拌1小时并在冰浴中冷却。将冰缓慢加入到反应混合物中直到放出气体终止。加入几滴2N氢氧化钠并在室温下将反应混合物搅拌30分钟。然后用乙酸乙酯提取反应混合物，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到10.37g(79％)为淡棕色油的4-[3-(2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基)-丙基]-吗啉，其无须进一步纯化即可使用。
步骤3向冰冷却的N,N-二甲基甲酰胺(5.5ml,70mmol)在二氯甲烷(30ml)中的溶液中滴加入磷酰氯(6.5ml,70mmol)。当加入完成时，在室温下，将反应混合物搅拌15分钟，之后，在0℃下，滴加3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛(10.37g,46.6mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液。在60℃下，将最终的反应混合物回流4小时并然后在冰浴中冷却。将冰缓慢加入到反应混合物中，随后加入2N氢氧化钠直到达到pH12。在室温下，将反应混合物搅拌30分钟，并然后用乙酸乙酯提取。用盐水洗涤有机层，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到粗品，将其在硅胶柱上纯化，用二氯甲烷-甲醇-氢氧化铵(9.5∶0.5)洗脱，得到4.57g(39％)为深红色油的3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ11.34(s,br,1H,NH-1),9.40(s,1H,CHO-2),3.55(t,J=4.68Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4),2.28-2.34(m,6H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4),2.21(t,2H,J=7.10Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4)CH3-3),2.19(s,3H,CH3-5),2.14(s,3H,CH3-3),1.51(五重峰，J=7.10Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4),MS m/z(相对强度，％)251([M+1]+,100)。
步骤4在90℃下，将1,3-二氢吲哚满-2-酮(133mg,1.0mmol)、3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基-丙基)-1H-吡咯-2-甲醛(250mg,1.0mmol)和3滴哌啶的混合物在2.0ml乙醇中回流4小时并然后冷却至室温。过滤沉淀，用冷的乙醇和己烷洗涤，并在真空烘箱中干燥过夜，得到308.9mg(85％)为黄色固体的3-[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基-丙基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-1,3-二氢吲哚满-2-酮。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.37(s,1H,NH-1’),10.71(s,1H,NH-1),7.68(d,J=7.47Hz,1H,H-4),7.53(s,1H,H-乙烯基)，7.06(dt,J=7.47Hz,1H,H-6),6.94(dt,J=7.74 Hz,1H,H-5),6.84(d,J=7.47Hz,1H,H-7),3.55(t,J=4.37Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.40(t,J=7.31Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.31(t,J=4.37Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.28(s,3H,CH3-3’),2.23(s,3H,CH3-5’),2.23(t,J=7.31Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),1.56(五重峰，J=7.31Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/e(相对强度，％)365(M+,100)。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ13.43(s,1H,NH-1’),10.81(s,1H,NH-1),7.99(d,J=2.07Hz,1H,H-4),7.66(s,1H,H-乙烯基)，7.18(dd,J=2.07,7.58Hz,1H,H-6),6.79(d,J=7.58Hz,1H,H-7),3.55(t,J=4.39Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.40(t,J=7.32Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.31(t,J=4.39Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.29(s,3H,CH3-3’),2.26(s,3H,CH3-5’),2.23(t,J=7.32Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),1.56(五重峰，J=7.32Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/e(相对强度，％)443(M+,100),445([M+2]+,100)。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.37(s,1H,NH-1’),10.81(s,1H,NH-1),7.77(d,J=8.20Hz,1H,H-4),7.62(d,J=7.39Hz,2H,H-2”,6”),7.58(s,1H,H-乙烯基)，7.44(t,J=7.39Hz,2H,H-3”,5”),7.32(t,br,J=7.39Hz,1H,H-4”),7.26(dd,J=1.49,8.29Hz,1H,H-5),7.09(d,J=1.49Hz,1H,H-7),3.56(t,J=4.48Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.41(t,J=7.18Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.31(t,J=4.48Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.29(s,3H,CH3-3’),2.26(s,3H,CH3-5’),2.24(t,J=7.18Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),1.56(五重峰，J=7.18Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/e(相对强度，％)441(M+,100)。实施例453-[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基-丙基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-(2-甲氧基苯基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮使用实施例2的方法，得到86％收率的为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.37(s,1H,NH-1'),10.72(s,1H,NH-1),7.71(d,J=7.79Hz,1H,H-4),7.55(s,1H,H-乙烯基)，7.27-7.34(m,2H),6.98-7.10(m,4H),3.76(s,3H,OCH3-2”),3.56(t,J=4.50Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.41(t,J=7.12Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.21-2.31(m,6H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.29(s,3H,CH3-3’),2.25(s,3H,CH3-5’),1.57(五重峰，J=7.12Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/e(相对强度，％)471(M+,100)。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.38(s,1H,NH-1'),10.80(s,1H,NH-1),7.76(d,J=7.93Hz,1H,H-4),7.57(s,1H,H-乙烯基)，7.35(t,J=8.08Hz,1H,H-5”),7.26(dd,J=1.73,7.93Hz,1H,H-5),7.18(d,br,J=8.08Hz,1H,H-4”),7.13(t,br,J=1.94Hz,1H,H-2”),7.08(d,J=1.73Hz,1H,H-7),6.90(dd,J=1.94,8.08Hz,1H,H-6”),3.81(s,3H,OCH3-3”),3.56(t,J=4.38Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.41(t,J=7.19Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.31(t,J=4.38Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.29(s,3H,CH3-3’),2.26(s,3H,CH3-5’),2.24(t,J=7.19Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),1.56(五重峰，J=7.19Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/e(相对强度，％)471(M+,100)。实施例473-[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基-丙基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮使用实施例2的方法，得到52％收率的为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(300MHz,DMS0-d6)δ13.35(s,1H,NH-1’),10.77(s,1H,NH-1),7.72(d,J=7.97Hz,1H,H-4),7.55(d,J=8.57Hz,2H,H-2”,6”),7.54(s,1H,H-乙烯基)，7.20(dd,J=1.35,7.97Hz,1H,H-5),7.04(d,J=1.35Hz,1H,H-7),6.99(d,J=8.57Hz,1H,H-3”,5”),3.78(s,3H,OCH3-4”),3.55(t,J=4.57Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.40(t,J=6.97Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.30(t,J=4.57Hz,4H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),2.28(s,3H,CH3-3’),2.24(s,3H,CH3-5’),2.23(t,J=6.97Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),1.55(五重峰，J=6.97Hz,2H,O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/e(相对强度，％)471(M+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ11.33(s,br,1H,NH-1),9.40(s,1H,CHO-2),2.30(t,J=7.42Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4),2.18(s,3H,CH3-3),2.15(t,J=7.42Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4),2.14(s,3H,CH3-5),2.10(s,6H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4),1.47(五重峰，J=7.42Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/z(相对强度，％)208([M+1]+,100)。
使用实施例1步骤4，得到52％收率的为黄色固体的标题化合物。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6):δ13.38(s,1H,NH-1’),10.70(s,1H,NH-1),7.68(d,J=7.54Hz,1H,H-4),7.53(s,1H,H-乙烯基)，7.06(t,J=7.54Hz,1H,H-6),6.94(t,J=7.54Hz,1H,H-5),6.85(d,J=7.54Hz,1H,H-7),2.38(t,J=7.25Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.27(s,3H,CH3-3’),2.23(s,3H,CH3-5’),2.17(t,J=7.25Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.11(s,6H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),1.52(五重峰，J=7.25Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/z(相对强度，％)323(M+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ13.42(s,1H,NH-1'),10.81(s,1H,NH-1),7.98(d,J=1.89Hz,1H,H-4),7.66(s,1H,H-乙烯基)，7.17(dd,J=1.89,8.23Hz,1H,H-6),6.79(d,J=8.23Hz,1H,H-7),2.38(t,J=7.23Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.27(s,3H,CH3-3’),2.25(s,3H,CH3-5’),2.16(t,J=7.23Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.10(s,6H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),1.51(五重峰，J=7.23Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),MS m/z(相对强度，％)401([M-1]+,100)和403([M+1]+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ13.38(s,1H,NH-1’),10.81(s,1H,NH-1),7.77(d,J=7.82Hz,1H,H-4),7.62(d,J=7.59Hz,2H,H-2”,6”),7.58(s,1H,H-乙烯基)，7.44(t,J=7.59Hz,2H,H-3”,5”),7.32(t,J=7.59Hz,1H,H-4”),7.27(dd,J=1.11,7.82Hz,1H,H-5),7.09(d,J=1.11Hz,1H,H-7),2.39(t,J=7.18Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.29(s,3H,CH3-3’),2.25(s,3H,CH3-5’),2.17(t,J=7.18Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.11(s,6H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),1.53(五重峰，J=7.18Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/z(相对强度，％)399(M+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ13.38(s,1H,NH-1’),10.72(s,1H,NH-1),7.70(d,J=8.06Hz,1H,H-4),7.55(s,1H,H-乙烯基)，7.28-7.36(m,2H,H-4”,5”),7.14(d,J=8.32Hz,1H,H-6”),7.04(dd,J=1.21,8.06Hz,1H,H-5),6.99(d,J=7.42Hz,1H,H-3”),6.99(d,J=1.21Hz,1H,H-7),3.76(s,3H,OCH3-2”),2.39(t,J=7.24Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.28(s,3H,CH3-3’),2.25(s,3H,CH3-5’),2.18(t,J=7.24Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.11(s,6H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),1.53(五重峰，J=7.24Hz，2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/z(相对强度，％)429(M+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ13.38(s,1H,NH-1’),10.80(s,1H,NH-1),7.60(d,J=8.06Hz,1H,H-4),7.57(s,1H,H-乙烯基),7.35(t,J=8.15Hz,1H,H-5”),7.26(dd,J=1.39,8.06Hz,1H,H-5),7.19(d,br,J=8.15Hz,H-6”),7.13(m,1H,H-2”),7.09(d,J=1.39Hz,1H,H-7),6.90(dd,J=2.57,8.15Hz,1H,H-4”),3.81(s,3H,OCH3-3”),2.39(t,J=7.17Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.29(s,3H,CH3-3’),2.25(s,3H,CH3-5’),2.17(t,J=7.17Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.11(s,6H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),1.53(五重峰，J=7.17Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/z(相对强度，％)429(M+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H,NH-1'),10.77(s,1H,NH-1),7.73(d,J=7.82Hz,1H,H-4),7.56(d,J=8.83Hz,2H,H-2”,6”),7.54(s,1H,H-乙烯基)，7.20(dd,J=1.64,7.82Hz,1H,H-5),7.04(d,J=1.64Hz,H-7),7.00(d,J=8.83Hz,2H,H-3”,5),3.78(s,3H,OCH3-4”),2.39(t,J=7.24Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.28(s,3H,CH3-3’),2.25(s,3H,CH3-5’),2.17(t,J=7.24Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.11(s,6H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),1.52(五重峰，J=7.24Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),MSm/z(相对强度，％)429(M+,100)。
1HNMR(360MHz,DMSO-d6)δ13.43(s,1H,NH-1’),10.84(s,1H,NH-1),7.87(d,J=1.85Hz,1H,H-4),7.66(s,1H,H-乙烯基)，7.05(dd,J=1.85,8.15Hz,1H,H-6),6.83(d,J=8.15Hz,1H,H-7),2.36-2.45(m,4H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.30(s,6H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.28(s,3H,CH3-3’),2.26(s,3H,CH3-5’),1.58(五重峰，J=7.52Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),MS m/z(相对强度，％)357([M-1]+,100)。实施例556-氯-3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-1,3-二氢吲哚满-2-酮使用实施例2的方法，得到77％收率的标题化合物。
MS EI 357[M-1]+。
MS EI 353[M]+。
MS EI 337[M]+。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.45(s,br,1H,NH),10.78(s,br,1H,NH),7.50(s,1H,H-乙烯基)，6.98(t,J=8.1Hz,1H,H-6),6.76(t,J=8.1Hz,2H,H-5和H-7),2.88(m,2H,CH2),2.64(s,6H,2xCH3),2.56(s,3H,CH3),2.43(t,J=7.4Hz,2H,CH2),2.29(s,3H,CH3),2.19(s,3H,CH3),1.65-1.75(m,2H,CH2),MS EI 337[M]+。实施例603-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-4-(2-羟基-乙基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮使用实施例2的方法，得到98％收率的标题化合物。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.41(s,1H,NH-1'),11.12(s,1H,NH-1),8.16(d,J=1.78Hz,1H,H-4),7.66(s,1H,H-乙烯基)，7.55(dd,J=1.78,8.18Hz,1H,H-6),7.11(s,br,2H,H2NSO2-5),6.98(d,J=8.18Hz,1H,H-7),2.47-2.50(m,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.41(t,J=7.37Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.36(s,6H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’),2.30(s,3H,CH3-3’),2.28(s,3H,CH3-5’),1.61(五重峰，J=7.37Hz,2H,(CH3)2NCH2CH2CH2-4’)。
MS EI 444[M]+。
MS EI 472[M]+。
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.5(s,br,1H,NH),12.21(s,br,1H,NH),8.18(d,J=1.8Hz,1H,H-4),7.84(s,1H,H-乙烯基),7.44(dd,J=1.8,8.4Hz,1H,H-6),7.05(d,J=8.4Hz,1H,H-7),2.59(s,6H,2xCH3),2.59-2.64(m,2H,CH2),2.44(s,6H,2xCH3),2.38-2.44(m,2H,CH2),2.31(s,6H,2xCH3),1.59-1.69(m,2H,CH2),MS EI 430[M]+。7．生物评价人们将意识到在任何给出的系列化合物中，将提供广泛的生物活性。在它的优选实施方案中，本发明涉及证实有调控RTK、CTK和STK活性能力的新的吡咯取代的2-吲哚满酮。以下测定法用于选择那些证实有最适程度要求的活性的化合物。A．测定方法以下体外试验可用于测定本发明不同化合物对一种或多种PKs上的活性和作用的水平。使用本领域熟知的技术，根据相同系的任何PKs能够设计相似的试验。
以ELISA形式进行在此描述的细胞/催化测定。一般方法如下将化合物引入天然或重组表达受试激酶的细胞，在一个选择的时间期间之后，如果受试激酶为受体，则加入已知激活所述受体的配体。将细胞溶解并把溶胞产物转移至预先用识别酶磷酸化反应的底物的特异性抗体包被的ELISA板的孔中。将细胞溶胞产物的非底物成分洗去并用特异性识别与不接触受试化合物的对照组细胞相比较的磷酸酪氨酸的抗体检测底物上磷酸化的量。在此描述的细胞/生物测定可测量应答于受试激酶中活化作用的DNA的量，该方法为增殖应答的通用测量方法。用于该测定的通用方法如下将化合物引入天然或重组表达受试激酶的细胞，在一个选择的时间期间之后，如果受试激酶为受体，则加入已知活化所述受体的配体。孵育至少过夜后，加入DNA标记的试剂如溴代脱氧尿苷(BrdU)或3H-胸腺嘧啶脱氧核苷。用抗BrdU抗体或通过测量放射活性来检测标记DNA的量并与不和受试化合物接触的对照组细胞相比较。细胞/催化测定酶联动免疫吸附测定法(ELISA)可用于检测和测量PK活性的存在。按照已知方法，可进行ELISA，该方法在例如Voller，等，1980，“酶联动免疫吸附测定法”，在临床免疫学操作指南(第2版，由Rose和Friedman编辑，第359-371页，美国微生物学学会，华盛顿特区)中有描述。
公开的方法可适于测定与特异性PK有关的活性。即如下提供进行用于特异性PKs的ELISA实验的优选方案。然而，适合用于测定化合物对其它的RTK族成员以及CTKs和STKs活性的这些方法都在本领域技术人员知识的范围内。
FLK-1测定进行ELISA测定以测量FLK-1受体的激酶活性，更详细地讲，是抑制或活化在FLK-1受体上的TK活性。具体地说，进行以下测定用于测量在基因工程表达Flk-1的细胞中FLK-1受体的激酶活性。
材料与试剂a．Corning 96孔ELISA板(Coming目录25805-96号)，b．Cappel山羊抗兔IgG(目录55641号)，c．PBS缓冲液(Gibco目录450-1300EB号)，d．TBSW缓冲液(50 mM Tris(pH 7.2)、150 mMNaCl和0.1％吐温-20)，e．乙醇胺贮存液(10％乙醇胺(pH 7.0)，在4℃下贮存)f．HNTG缓冲液(20 mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、150 mM NaCl和0.2％Triton X-100和10％甘油)，g．EDTA(0.5 M(pH7.0)，为100X贮存液)，h．正钒酸钠(0.5M，为100X贮存液)，i．焦磷酸盐(0.2M，为100X贮存液)，j．NUNC 96孔V形底聚丙烯板(Applied Scientific目录AS-72092号)，k．NIH3T3 C7#3细胞(FLK-1表达细胞)，l．含有1X的高葡萄糖L-谷氨酰胺的DMEM(目录11965-050号)，m．FBS,Gibco(目录16000-028号)，n．L-谷氨酰胺，Gibco(目录25030-016号)，o．VEGF,PeproTech公司(目录100-20号)，(作为在Milli-Q dH2O中的1μg/100μl贮存液保持，并在-20℃下贮存，p．亲和纯化的抗FLK-1抗血清，q．特异性用于磷酸酪氨酸的UB40单克隆抗体(参见Fendly，等，1990,CancerResearch 50∶1550-1558),r．EIA级山羊抗小鼠IgG-POD(BioRad目录172-1011号)，s．2,2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)溶液(100mM枸橼酸(无水)，250mM Na2HPO4(pH 4.0),0.5mg/ml ABTS(Sigma目录A-1888号))，溶液应在4℃下贮存于暗处直到备用。
t．H2O2(30％溶液)(Fisher目录H325号)，u．ABTS/H2O2(15ml ABTS溶液，2μl H2O2)临用前5分钟制备并在室温下放置，v．在H2O中0.2M HCl贮存液，w．二甲基亚砜(100％)(Sigma目录D-8418号)，和y．胰蛋白酶-EDTA(Gibco BRL目录25200-049号)。
方案。
1．用在0.1M Na2CO3(pH9.6)中的Cappel抗兔IgG抗体每孔1.0μg包被Corning 96孔ELISA板。加至最终体积每孔150μl。在4℃下包被板过夜。当在4℃下贮存时，使板能够保持至2周。
2．在适宜的培养基盘上，于生长培养基(DMEM，用2.0mM的L-谷氨酰胺、10％FBS补充)中生长细胞直到在37℃、5％CO2下汇合。
3．经胰蛋白酶消化收获细胞并在Corning 25850聚苯乙烯96孔圆底细胞板上，在200μl生长培养基中以25,000个细胞/孔接种。
4．在37℃和5％CO2下，将细胞生长至少一天。
5．用D-PBS 1X洗涤细胞。
6．加入200μl/孔的饥饿培养基(DMEM,2.0mM1-谷氨酰胺，0.1％FBS)。在37℃和5％CO2下，孵育过夜。
7．使用饥饿培养基(starvation media)，在聚苯乙烯96孔板上按1∶20稀释化合物。稀释二甲基亚砜1∶20用于对照孔中。
8．从96孔细胞培养板上除去饥饿培养基并将162μl新鲜饥饿培养基加入到每孔中。
9．将18μl按1∶20稀释的化合物稀释液(来自步骤7)加入到每孔中并把1∶20二甲基亚砜稀释液加入到对照组的孔(+/-VEGF)中，在细胞刺激后最后的稀释比为1∶200。最后的二甲基亚砜为0.5％。在37℃和5％CO2下，将板孵育2小时。
10．通过把板翻转除去液体以从ELISA板上除去未结合的抗体。用TBSW+0.5％乙醇胺(pH 7.0)洗涤3次。在纸巾上板轻拍板以除去过量的液体和气泡。
11．用每孔150μl的TBSW+0.5％乙醇胺(pH7.0)阻断板。孵育板30分钟，其间在微滴定板振摇器上振摇。
12．如同在步骤10中描述的那样，将板洗涤3次。
13．加入0.5μg/孔亲和纯化抗FLU-1多克隆兔抗血清。用每孔150μl的TBSW+0.5％乙醇胺(pH 7.0)加至最后的体积。孵育板30分钟，其间振摇。
14．将180μl饥饿培养基加入到细胞中并在37℃和5％CO2下用20μl/孔的10.0mM正钒酸钠和500ng/ml VEGF(生成最后浓度为每孔1.0 mM正钒酸钠和50 ng/ml VEGF)刺激细胞8分钟。阴性对照组孔仅接受饥饿培养基。
15．8分钟后，去除细胞的培养基并用200μl/孔PBS洗涤一次。
16．在室温下振摇5分钟期间，在150μl/孔HNTG中溶解细胞。HNTG的配方包括正钒酸钠、焦磷酸钠和EDTA。
17．如同在步骤10中描述的那样，将ELISA板洗涤3次。
18．将细胞溶胞产物从细胞板转移至ELISA板并伴随振摇下孵育2小时。为转移细胞溶胞产物，在刮孔期间上下吸取。
19．如同在步骤10中描述的那样，将板洗涤3次。
20．用在TBSW+0.5％乙醇胺中的0.02μg/孔UB40孵育ELISA板。加至最后体积150μl/孔。伴随振摇下孵育30分钟。
21．如同在步骤10中描述的那样，将板洗涤3次。
22．用1∶10,000稀释的接合有TBSW+0.5％乙醇胺(pH7.0)中的辣根过氧化酶的EIA级山羊抗小鼠IgG孵育ELISA板。加至最后体积150μl/孔。伴随振摇下孵育30分钟。
23．如同在步骤10中描述的那样，将板洗涤。
24．将100μl的ABTS/H2O2溶液加入到孔中。伴随振摇下孵育10分钟。
25．将100μl的0.2M HCl加至最后浓度0.1M HCl以停止显色反应。在室温下，振摇1分钟。用缓慢的气流除去气泡并以ELISA板读出器于410nm下读取ELISA板。
在全细胞上的EGF受体-HER2嵌合受体测定如同以下描述的那样，测量在全EGFR-NIH3T3细胞中的HER2激酶活性材料与试剂.
a．EGF贮存液浓度16.5 ILM,EGF 201,TOYOBO有限公司，日本。
b．05-101(UBI)(识别EGFR细胞外结构域的单克隆抗体)。
c．抗磷酸酪氨酸抗体(抗Ptyr)(多克隆)(参见Fendley，等，上述)。
d．检测抗体山羊抗兔IgG辣根过氧化酶结合物，TAGO公司，Burlingame,CA。
e．TBST缓冲液Tris-HCl,pH 7.2 50mMNaCl 150mMTriton X-100 0.1f．HNTG 5X贮存液HEPES 0.1MNaCl 0.75M甘油 50％Triton X-100 1.0％g．ABTS贮存液枸橼酸100mMNa2HPO4250mMHCl，浓 0.5mMABTS*0.5mg/ml*(2,2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)，在4℃下将溶液贮存于暗处直到备用。
h．贮存液试剂EDTA 100 mM pH 7.0Na3VO40.5MNa4(P2O7)0.2M方法。
预包被的ELISA板1．用在PBS中的05-101抗体以每孔0.5μg包被ELISA板(Corning,96孔，目录25805-96号)、最后体积为100μl/孔，并在4℃下过夜贮存。当在4℃贮存时，将包被的板维持妥当达到10天。
2．使用当天，除去包被缓冲液并用100μl阻断缓冲液(在PBS中的5％淡红色速溶非脂肪干牛奶)替代。在室温(大约23-25℃)下，孵育板30分钟，振摇。临用前，除去阻断缓冲液并用TBST缓冲液将板洗涤4次。
接种细胞1．可将过度表达含有EGFR细胞外域和细胞内HER2激酶域的嵌合受体的NIH3T3细胞系用于该测定。
2．选择具有80-90％汇合的盘用于实验。通过加入10％小牛血清使细胞经胰蛋白酶消化并终止反应。在DMEM培养基(10％CSDMEM培养基)上悬浮细胞并在室温下于1500rpm下离心5分钟一次。
3．在接种培养基(DMEM,0.5％牛血清)上重悬浮细胞，并使用台盼蓝计数细胞。大于90％的生存力为可接受的。在96孔微滴定板上，以每孔10,000细胞，每孔100μl的密度，在DMEM培养基(0.5％牛血清)上接种细胞。在37℃下，5％CO2中，将接种的细胞孵育40小时。
测定方法1．使用倒置显微镜，用于检查接种细胞的污染情况。在DMEM培养基中，按1∶10稀释药物贮存液(10mg/ml在DMSO)，然后将5μl转移至TBST孔中使最终药物稀释液为1∶200和最终DMSO浓度1％。对照组孔单独接受DMSO。在37℃下，于5％CO2中孵育2小时。
2．制备EGF配体在DMEM中，稀释贮存液EGF以便得到10μl稀释的EGF转移液(1∶12稀释)，最终浓度100nM。
3．制备足以得到每孔100μl新鲜的HNTG*，并放置在冰上。
HNTG*(10ml):
HNTG贮存液 2.0mlMilli-Q H2O 7.3mlEDTA,100 mM,pH 7.0 0.5mlNa3VO4(0.5M) 0.1mlNa4(P2O7)(0.2M) 0.1ml
4．在用药物孵育120分钟后，将已制备的SGF配体每孔10μl加入到细胞中，直到最终浓度为100nM。对照组孔单独接受DMEM。在室温下，伴随振摇下孵育5分钟。
5．除去药物、EGF和DMEM。用PBS洗涤细胞两次。将HNTG*转移至细胞，每孔100μl。在冰上放置5分钟。同时，从其它的ELISA板上除去阻断缓冲液并如同以上描述的那样用TBST洗涤。
6．将吸移管管尖小心安装到微量移液管上，从板上刮下细胞并通过重复搅拌使细胞材料搅匀并悬浮于HNTG*溶解缓冲液。将溶胞产物转移至包被的、阻断的和洗涤后的ELISA板。在室温、振摇下孵育1小时。
7．除去溶胞产物并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜稀释的抗Ptyr抗体转移至ELISA板中。在抗Ptyr抗血清(在TBST中1∶3000稀释)存在下，于室温下振摇孵育30分钟。
8．除去抗Ptyr抗体并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜稀释的TAGO抗兔IgG抗体转移至ELISA板。在室温下，振摇孵育30分钟(抗兔IgG抗体在TBST中1∶3000稀释)。
9．除去TAGO检测抗体并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜制备的ABTS/H2O2溶液转移至ELISA板。在室温下，振摇孵育20分钟。(ABTS/H2O2溶液在10ml ABTS贮存液中1.0μl 30％H2O2)。
10．通过加入50μl的5N H2SO4(任选)终止反应，并在410nm下测定O.D.。
11．通过从阳性对照组中减去阴性对照组的值，确定最大磷酸酪氨酸信号。然后在减去阴性对照组后，计算对含有提取液的孔的磷酸酪氨酸内容物的百分比抑制率。
PDGF-R测定除非另外指明，所有的细胞培养基、谷氨酰胺和小牛血清能够从Gibco Life Technologies(长岛，NY)购买。在37℃下，所有的细胞在90-95％空气的潮湿气氛和5-10％CO2中生长。每周所有细胞系常规传代培养两次并如同Mycotect方法(Gibco)测定那样对支原体呈阴性。
对ELISA测定，在生长培养基(含有10％FBS的MEM,NEAA,1mM NaPyr和2mM GLN)中，细胞(U1242，从Joseph Schlessinger,NYU得到)生长至80-90％汇合，并在0.5％血清中的96孔组织培养板上以每孔25,000-30,000细胞接种。在含有0.5％血清的培养基中孵育过夜后，将细胞更换至无血清的培养基中并在5％CO2,37℃下的孵育器中用受试化合物处理2小时。然后用配体刺激细胞5-10分钟随后用HNTG(20 mM,HEPES,150mM NaCl和10％甘油，5mM EDTA,5mMNa3VO4,0.2％Triton X-100,2mM NaPyr)溶解。将细胞溶胞产物(0.5mg/孔在PBS中)转移至预先用受体特异性抗体包被并已在室温下用在TBST(50mM,Tris-HCl,pH7.2,150mM NaCl和0.1％Triton X-100)中的5％牛奶阻断ELISA板30分钟。在室温下，伴随振摇将溶胞产物孵育1小时。用TBST将板洗涤四次并然后在室温下与多克隆抗磷酸酪氨酸抗体一起孵育30分钟。通过用TBST冲洗板四次除去过量抗磷酸酪氨酸抗体。在室温下，将山羊抗兔IgG抗体加入到ELISA板上30分钟随后用TBST冲洗另外四次。将ABTS(100mM枸橼酸，250mM的Na2HPO4和0.5mg/mL的2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)+H2O2(1.2mL 30％H2O2至10ml ABTS)加入到ELISA板上以开始显颜色。在加入ABTS后，用630nm的参照物波长，在410nm下记录吸收大约15-30分钟。
IGF-1受体测定以下方案用于测量在IGF-1受体上的磷酸酪氨酸水平，该方案表明IGF-1受体酪氨酸激酶活性。
材料与试剂a．用于该测定的细胞系为3T3/IGF-1R，其为一种基因工程过度表达IGF-1受体的细胞系。
b．在37℃下，NIH3T3/IGF-1R在含有5％CO2的孵育器中生长。该生长培养基为DMEM+10％FBS(热灭活的)+2mM L-谷氨酰胺。
c．亲和纯化的抗IGF-1R抗体17-69。
d．D-PBSKH2PO40.20g/lKH2PO42.16g/lKCl 0.20g/lNaCl8.00g/l(pH7.2)e．阻断缓冲液TBST+5％牛奶(淡红色速溶无脂肪干牛奶)。
f．TBST缓冲液Tris-HCl 50mMNaCl 150mM(pH7.2/HCl 10N)Triton X-100 0.1％制备TBS贮存液(10X)，并在稀释期间将Triton X-100加入到该缓冲液中。
g．HNTG缓冲液HEPES 20mMNaCl 150mM(pH 7.2/HCl 1N)甘油 10％Triton X-100 0.2％制备贮存液(5X)，并在4℃下保存。
h．EDTA/HCl:0.5M pH 7.0(NaOH)作为100X贮存液。
i．Na3VO4:0.5M作为100X贮存液并在80℃下保存等分试样。
j．Na4P2O7:0.2M作为100X贮存液。
k．来自Promega的胰岛素样生长因子-1(目录G5111号)l．兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗血清。
m．山羊抗兔IgG POD结合物(检测抗体)，Tago(目录4520号，批号1802):Tago公司，Burlingame,CA。
n．ABTS(2,2’-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸))溶液
枸橼酸 100mMNa2HPO4250mM(pH4.0/1N HCl)ABTS0.5mg/mlABTS溶液应保存在暗处和4℃下。当其转变为绿色时该溶液应丢弃。
o．过氧化氢30％溶液保存在暗处和4℃下。
方法。
除非另外特别指明，所有以下步骤在室温下进行。通过将该板用自来水冲洗三次随后TBST冲洗一次来进行所有ELISA板的洗涤。用纸巾轻拍板进行干燥。
细胞接种1．用酪氨酸-EDTA(0.25％,0.5ml/D-100,GIBCO)收获在组织培养基盘(Corning 25020-100)中生长至80-90％汇合的细胞。
2．在新鲜的DMEM+10％FBS+2 mM L-谷氨酰胺中重悬浮细胞，并以20,000个细胞/孔(100μl/孔)转移至96孔组织培养板(Corning25806-96)。孵育一天并然后将培养基替换为无血清培养基(90/μl)并在5％CO2和37℃下孵育过夜。
ELISA板的包被和阻断1．用在100μl PBS中的抗IGF-1R抗体以0.5μg/孔将ELISA板(Corning 25805-96)包被至少2小时。
2．除去包被溶液，用100μl阻断缓冲液替代，且振摇30分钟。除去阻断缓冲液并在加入溶胞产物前洗涤板。
测定方法1．在无血清条件下，测定药物。
2．在96孔聚丙烯板上，用DMEM稀释药物贮存液(在100％DMSO中)1∶10，并将10μl/孔的溶液转移至细胞以得到最终药物稀释浓度1∶100，及最终DMSO浓度1.0％。在37℃下于5％CO2中，将细胞孵育2小时。
3．制备新鲜的细胞溶解缓冲液(HNTG*)
HNTG2mlEDTA0.1mlNa3VO40.1mlNa4(P2O7) 0.1mlH2O 7.3ml4．在药物孵育2小时后，将在PBS中的200nMIGF-1配体10μl/孔转移至细胞(最终浓度为20nM)，并在37℃下于5％CO2中，孵育10分钟。
5．除去培养基并加入100μl/孔HNTG*并振摇10分钟。在显微镜下观察细胞以观察它们是否充分溶解。
6．使用12通道移液器从板上刮取细胞，并通过反复搅拌和分散来搅匀所述溶胞产物。将所有的溶胞产物转移至抗体包被的ELISA板，并振摇1小时。
7．移出溶胞产物，洗涤板，转移抗pTyr(1∶3,000含有TBST)100μl/孔，并振摇30分钟。
8．除去抗pTyr，洗涤板，转移TAGO(1∶3,000含有TBST)100μl/孔，并振摇30分钟。
9．除去检测抗体，洗涤板，并转移新鲜的ABTS/H2O2(加1.2μl H2O2至10 ml ABTS)100μl/孔到板上并开始显色。
于Dynatec MR5000上，在410nm下用630nm的参照波长测量OD。
EGFR测定如同以下描述的那样，能够测量在细胞上基因工程表达人EGF-R的EGF受体激酶活性材料与试剂a．EGF配体贮存液浓度=16.5μM,EGF 201,TOYOBO有限公司，日本b．05-101(UBI)(识别EGFR细胞外域的单克隆抗体)。
c．抗磷酸酪氨酸抗体(抗Ptyr)(多克隆)。
d．检测抗体山羊抗兔1gG辣根过氧化酶结合物，TAGO公司，Burlingame,CA。
e．TBST缓冲液Tris-HCl,pH 7 50mMNaCl 150mMTriton X-100 0.1f．HNTG 5X贮存液HEPES 0.1MNaCl 0.75M甘油 50Triton X-100 1.0％g．ABTS贮存液枸橼酸 100mMNa3VO4250mMHCl2浓4.0pHABTS*0.5mg/ml将溶液在4℃下保存于暗处直到使用。
h．贮存试剂EDTA100 mMpH7.0Na2VO40.5MNa4(P2O7)0.2M方法。
预先包被的ELISA板1．用在PBS中的05-101抗体以每孔0.5μg包被ELISA板(Corning,96孔，目录25805-96号)、最终体积为150μl/孔，并在4℃下过夜贮存。当在4℃贮存时，将包被的板维持妥当达到10天。
2．使用当天，除去包被缓冲液并用阻断缓冲液(在PBS中的5％淡红色速溶非脂肪干牛奶)替代。在室温(大约23-25℃)下，伴随振摇下孵育板30分钟。临用前，除去阻断缓冲液并用TBST缓冲液将板洗涤4次。
接种细胞1．可将MH 3T3/C7细胞系(Honegger，等，细胞51:199-209,1987)用于该试验。
2．选择具有80-90％汇合的盘用于实验。通过加入10％CS DMEM培养基使细胞经胰蛋白酶消化并终止反应。在DMEM培养基(10％CSDMEM培养基)中悬浮细胞并在室温下于1000rpm下离心5分钟一次。
3．在接种培养基(DMEM,0.5％牛血清)上重悬浮细胞，并使用台盼蓝计数细胞。大于90％的生存力为可接受的。在96孔微滴定板上，以每孔100μl，每孔10,000个细胞的密度，在DMEM培养基(0.5％牛血清)上接种细胞。在37℃下，在5％CO2中，将接种的细胞孵育大约40小时。
测定方法1．使用倒置显微镜，用于检查接种细胞的污染情况。在DMEM培养基中，将受试化合物贮存液(10mg/ml在DMSO中)稀释至1∶10，然后将5μl转移至试验组孔，使受试化合物药物稀释至1∶200并达到最终DMSO浓度1％。对照组孔仅接受DMSO。在37℃下，于5％CO2中孵育1小时。
2．制备EGF配体将在DMEM中的贮存液EGF稀释以便得到10μl稀释的EGF转移液(1∶12稀释)，得到25nM最终浓度。
3．制备足以用于每孔100μl的新鲜的10ml HNTG*，其中HNTG*包括HNTG贮存液(2.0ml),milli-Q H2O(7.3 ml),EDTA,100mM,pH7.0(0.5ml),Na3VO40.5M(0.1ml)和Na4(P2O7),0.2M(0.1ml)。
4．置于冰上。
5．用药物孵育2小时后，将已制备的EGF配体加至细胞，每孔10μl，得到最终浓度25nM。对照孔仅接受DMEM。在室温下，伴随振摇下孵育5分钟。
6．除去受试化合物、EGF和DMEM。用PBS洗涤细胞2次。将HNTG*转移至细胞，每孔100μl。放置于冰上5分钟。同时，从其它ELISA板上除去阻断缓冲液并如同以上描述的那样用TBST洗涤。
7．将吸移管管尖小心安装到微量移液管上，从板上刮下细胞并通过重复搅拌使细胞材料搅匀并悬浮于HNTG*溶解缓冲液上。将溶胞产物转移至包被的、阻断的和洗涤后的ELISA板。在室温、振摇下孵育1小时。
8．除去溶胞产物并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜稀释的抗Ptyr抗体转移至ELISA板。在抗Ptyr抗血清(在TBST中1∶3000稀释)存在下，于室温下振摇孵育30分钟。
9．除去抗Ptyr抗体并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜稀释的TAGO 30抗兔IgG抗体转移至ELISA板。在室温下，振摇孵育30分钟(抗兔IgG抗体在TBST中1∶3000稀释)。
10．除去检测抗体并用TBST洗涤四次。以每孔100μl将新鲜制备的ABTS/H2O2溶液转移至ELISA板。在室温下，孵育20分钟。(ABTS/H2O2溶液在10ml ABTS贮存液中1.2μl 30％H2O2)。
11．通过加入50μl的5N H2SO4(任选)终止反应，并在410nm下测定O.D.。
12．通过从阳性对照组中减去阴性对照组的值，确定最大磷酸酪氨酸信号。然后在减去阴性对照组后，计算对含有提取液的孔的磷酸酪氨酸内容物的百分比抑制率。
Met自动磷酸化测定通过在Met受体上分析Met蛋白酪氨酸激酶水平，该测定法测定Met酪氨酸激酶活性。
试剂a．HNTG(5X贮存液)将23.83g HEPES和43.83g NaCl溶于大约350ml dH2O中。用HCl或NaOH调节pH至7.2，加入500ml甘油和10ml Triton X-100，混合，将dH2O加至1L总体积。为制备1L的1X工作液，将200ml的5X贮存液加至800ml dH2O中，检查并必要时调节pH，在4℃下贮存。
b．PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)，Gibco目录450-1300EB号(1X溶液)。
c．阻断缓冲液在500ml的dH2O中放入100g BSA、12.1gTris-pH7.5、58.44g NaCl和10ml吐温-20，稀释至总体积1L。
d．激酶缓冲液向500ml的dH2O中加入12.1g Tris(pH 7.2)、58.4g NaCl、40.7g MgCl2和1.9g EGTA，用dH2O加至1L总体积。
e．PMSF(苯基甲基磺酰氟)，Sigma目录P-7626号，至435.5mg，用100％乙醇加至25ml总体积，涡流。
f．ATP(细菌来源)，Sigma目录A-7699号，在-20℃下贮存粉末，制备溶液备用，将3.31mg溶于1mldH2O中。
g．RC-20H HRPO结合的抗磷酸酪氨酸，Transduction实验室目录E120H号。
h．Pierce 1-StepTMTurbo TMB-ELISA(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，Pierce目录34022号。
i．将1ml浓H2SO4(18N)加入到35ml dH2O中。
i．将TRIS HCL,Fischer目录BP152-5号加入到121.14g物料中，加入600ml MilliQ H2O，用HCl将pH调至7.5(或7.2)，用MilliQ H2O加至体积为1L。
k．NaCl,Fischer目录S271-10号，组成5M溶液。
l．吐温-20,Fischer目录S337-500号。
m．Na3VO4,Fischer目录S454-50号。向1.8g物料中加入80mlMilliQ H2O，用HCl或NaOH将pH调至10.0，用微波煮沸，冷却，检查pH，重复过程直到pH稳定在10.0，将MilliQ H2O加至100ml总体积，制备1ml等分试样并在-80℃下贮存。
n．MgCl2,Fischer目录M33-500号，制备1M溶液。
o．HEPES,Fischer目录BP310-500号，向200ml MilliQ H2Q加入59.6g物料，将pH调至7.5，总体积加至250ml，灭菌过滤。
p．白蛋白，牛(BSA),Sigma目录A-4503号，向30克物料中加入灭菌蒸馏水以使总体积至300ml，在4℃下贮存。
q．TBST缓冲液向在1L刻度量筒中的大约900mldH2O加入6.057g TRIS和8.766gNaCl，当溶解时，用HCl将pH调至7.2，加入1.0ml Triton X-100并用dH2O加至1L总体积。
r．山羊亲和纯化抗体兔IgG(总分子)，Cappel目录55641号。
s．抗h-Met(C-28)兔多克隆IgG抗体，Santa Cruz Chemical目录SC-161号。
t．瞬时转染EGFR/Met嵌合细胞(EMR)(Komada，等，癌基因，8∶2381-2390(1993)。
u．碳酸钠缓冲液，(Na2CO4,Fischer目录S495号)向10.6g物料加入800ml MilliQ H2O，当溶解时，用NaOH将pH调至9.6，用MilliQ H2O加至1L总体积，过滤，在4℃下贮存。
方法除非另外特别指明，所有以下步骤在室温下进行。通过用TBST将所有ELISA板冲洗4次。
EMR溶胞作用开始受体捕集之前，前一天夜间或者立即进行该操作。
1．迅速将溶胞产物投入到37℃下进行涡流运动的水浴中，直到最后结晶消失。
2．使用每15cm盘细胞的3ml HNTG，用含有1mM PMSF的1X HNTG溶解细胞碎片。加入1/2计算体积的HNTG，使试管涡流1分钟，加入剩余量的HNTG，涡流另外1分钟。
3．平衡试管，在4℃下，将其在10,000xg下离心10分钟。
4．收集上清液，移出等分试样用于蛋白质测定。
5．在干冰/乙醇浴上快速冷冻收集的样品。无论是溶胞产物贮存过夜还是按照蛋白质测定立即使用，都要进行该步骤。
6．使用标准bicinchoninic酸(BCA)方法(来自Pierce Chemical目录23225号的BCA测定试剂盒)，进行蛋白质测定。
ELISA测定1．用每孔5μg山羊抗兔抗体包被在总孔体积50μl的碳酸盐缓冲液中的Corning 96孔ELISA板。在4℃下贮存过夜。
2．通过翻转板以倒出液体以除去未结合的山羊抗兔抗体3．将150μl的阻断缓冲液加入到每孔中。伴随振摇孵育30分钟。
4．用TBST洗涤4X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。
5．每孔加入在TBST中稀释的1μg兔抗Met抗体以使总体积达到100μl。
6．在HNTG中稀释溶胞产物(90μg溶胞产物/100μl)。
7．将100μl稀释的溶胞产物加入到每孔中．振摇60分钟。
8．用TBST洗涤4X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。
9．每孔加入50μl的1X溶胞产物缓冲液。
10．在聚丙烯96孔板上，于1X激酶缓冲液中稀释化合物/提取液1∶10。
11．将5.5μl稀释的化合物转移至ELISA板孔中。在室温下，伴随振摇下孵育20分钟。
12．每孔加入5.5μl的60μM ATP溶液．阴性对照组不接受任何ATP。伴随振摇下孵育90分钟。
13．用TBST洗涤4X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。
14．每孔加入100μl的RC20(在阻断缓冲液中1∶3000稀释)。伴随振摇下孵育30分钟。
15．用TBST洗涤4X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。
16．每孔加入100μl的Turbo-TMB。伴随振摇下孵育30-60分钟。
17．每孔加入100μl的1M H2SO4以终止反应。
18．在Dynatech MR7000 ELISA读出器上进行读取测定值。试验滤波器=450nm，参比滤波器=410nm。
生物化学src测定值如同读出的那样，该测定值用于测定src蛋白激酶活性来测量磷酸化生物素化肽。
材料与试剂a．用src转化酵母(Sugen公司，Redwood城，加里福尼亚)。
b．细胞溶胞产物将表达src的酵母细胞沉淀，用水洗涤一次，再次沉淀并在-80℃下贮存直到使用。
c．按照本领域技术人员熟知的标准方法，制备N-端基生物素化EEEYEEYEEEYEEEYEEEY。
d．DMSO:Sigma,St.Louis,MO。
e．96孔ELISA板Corning 96孔Easy Wash，修饰平底板，Coming目录25805-96号。
f．用于稀释化合物的NUNC 96孔V形底聚丙烯板AppliedScientific目录A-72092号。
g．Vecastain ELITE ABC试剂Vector,Burlingame,CA。
h．抗src(327)单克隆抗体非洲粟酒裂殖酵母菌用于表达重组Src(Superti-Furga，等，EMBO J.,12:2625-2634,Superti-Furga，等，Nature Biochem.,14:600-605)。如同描述的那样，使裂殖酵母非洲粟酒株SP200(h-s leul.32 ura4 ade210)生长并且通过乙酸锂方法(Superti-Furga，上述)，用pRSP表达的质粒进行转化。在1μM维生素B1存在下，使细胞生长以阻遏表达nmtl启动子或者在维生素B1不存在下诱导表达。
i．单克隆抗磷酸酪氨酸，UBI 05-321(可被UB40替代)。
j．Turbo TMB-ELISA过氧化酶底物Pierce Chemical。
缓冲液a．PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)GIBCO PBS,GIBCO目录450-1300EB号。
b．阻断缓冲液在PBS中的5％非脂肪牛奶(Carnation)。
c．碳酸盐缓冲液来自Fischer目录S495号的Na2CO4，制备100mM贮存液。
d．激酶缓冲液1.0ml(来自1M贮存液)MgCl2、0.2ml(来自1M贮存液)MnCl2、0.2ml(来自1M贮存液)DTT、5.0ml(来自1M贮存液)HEPES、0.1ml TX-100，用MilliQ H2O加至10ml总体积。
e．溶解缓冲液5.0HEPES(来自1M贮存液)、2.74ml NaCl(来自5M贮存液)、10ml甘油、1.0ml TX-100、0.4ml EDTA(来自100mM贮存液)、1.0ml PMSF(来自100 mM贮存液)、0.1ml Na3VO4(来自0.1M贮存液)，用MilliQ H2O加至100mL总体积。
f．ATP:Sigma目录A-7699号，制备10mM贮存溶液(5.51mg/ml)。
g．TRIS-HCl:Fischer目录BP 152-5号，向600ml MilliQ H2O中加入121.14g物料，用HCl调pH至7.5，用MilliQ H2O制备1L总体积。
h．NaCl:Fischer目录S271-10号，用MilliQ H2O制备5M贮存液。
i．Na3VO4:Fischer目录S454-50号，向80ml的MilliQ H2O中加入1.8g物料，用HCl或NaOH调pH至10.0，在微波上煮沸，冷却，检查pH，反复调节pH直到pH在加热/冷却循环后保持稳定，用MilliQ H2O加至100ml总体积，制备1ml等分试样并在-80℃下贮存。
j．MgCl2:Fischer目录M33-500号，用MilliQ H2O加至1M贮存液。
k．HEPES:Fischer目录BP 310-500号，向200ml的MilliQ H2O中加入59.6g物料，将pH调至7.5，用MilliQ H2O加至250ml总体积。灭菌过滤(1M贮存液)。
l．TBST缓冲液TBST缓冲液向900 ml的dH2O中加入6.057gTRIS和8.766gNaCl，用HCl调pH至7.2，加入1.0ml Triton-X 100，用dH2O加至1L总体积。
m．MnCl2:Fischer目录M87-100号，用MilliQ H2O加至1M贮存液。
n．DTT:Fischer目录BP172-5号。
o．TBS(TRIS缓冲盐水)向900ml的MilliQ H2O中加入6.057gTRIS和8.777gNaCl，用MilliQ H2O加至1L总体积。
p．激酶反应混合物每测定板的量(100孔)1.0ml激酶缓冲液、200μgGST-ζ、用MilliQ H2O加至最终体积8.0ml。
q．生物素标记的EEEYEEYEEEYEEEYEEEY临用前在水中新鲜制备肽贮存液。
r．VectastainELITEABC试剂为制备14ml的工作试剂，将1滴试剂A加入到15ml TBST中并倒转试管几次以混合。然后加入1滴试剂B。在室温下，将试管放入轨道振摇器上并混合30分钟。
方法制备src包被的ELISA板1．用在100μl的pH 9.6的碳酸钠缓冲液中的0.5μg/孔抗src单克隆抗体包被ELISA板，在4℃下保持过夜。
2．用PBS将孔洗涤一次。
3．在室温下，用在PBS中的0.15ml的5％牛奶阻断板30分钟。
4．用PBS将板洗涤5X。
5．以10μg/孔加入溶解缓冲液(每孔0.1ml总体积)中稀释的src转化的酵母溶胞产物。(溶胞产物的量可在这些批号之间变化)。在室温下，振摇板20分钟。
制备磷酸酪氨酸抗体包被的ELISA板。
1．4G10板在4℃下，将0.5μg/孔的4G10在100μl的PBS中包被过夜并在室温下用在PBS中150μl的5％牛奶阻断30分钟激酶测定方法。
1．从板上除去未结合的蛋白并用PBS洗涤板5X。
2．每孔加入0.08ml激酶反应混合物(含有10μl的10X激酶缓冲液和在水中稀释的每孔10μM(最终浓度)生物素-EEEYEEYEEEYEEEYEEEY。
3．加入在含有10％DMSO的水中稀释的10μl化合物并在室温下预先孵育15分钟。
4．通过加入10μl/孔的在水中0.05mMATP(5μMATP最终)，开始激酶反应。
5．在室温下，振摇ELISA板15分钟。
6．通过每孔加入10μl的0.5MEDTA终止激酶反应。
7．将90μl上清液转移以阻断4G10包被的ELISA板。
8．孵育30分钟，这期间在室温下振摇。
9．用TBST洗涤板5X。
10．在室温下，用Vectastain ELITE ABC试剂(100μl/孔)孵育30分钟。
11．用TBST洗涤孔5X。
12．用Turbo TMB显色。
生物化学lck测定通过测量作为示值读数的GST-ζ的磷酸化，该测定用于测定lck蛋白激酶活性。
材料和试剂a．用lck转化的酵母。非洲粟酒裂殖酵母菌用于表达重组Lek(Superti-Furga，等，EMBO J,12:2625-2634,Superti-Furga，等，Nature Biotech.,14:600-605)。通过乙酸锂方法(Superti-Furga，上述)，如同描述的那样，使裂殖酵母非洲粟酒株SP200(h-s leul.32 ura4ade210)生长并用pRSP表达的质粒进行转化。在1μM维生素B1存在下，使细胞生长以诱导表达。
b．细胞溶胞产物将酵母细胞表达的lck沉淀，以水洗涤一次，再次沉淀并在-80℃下冷冻贮存直到使用。
c．GST-ζ在从旧金山加利福尼亚大学的Howard HugHes医学研究所的Arthur Weiss得到的细菌上表达对GST-ζ融合蛋白的DNA编码。在25℃下振摇期间，转化的细菌生长过夜。经谷胱甘肽亲和层析法(Pharmacia,Alameda,CA)纯化GST-ζ。
d．DMSO:Sigma,St.Louis,MO。
e．96孔ELISA板Corning 96孔Easy Wash，修饰平底板，Corning目录25805-96号。
f．用于稀释化合物的NUNC 96孔V形底聚丙烯板AppliedScientific目录AS-72092号。
g．纯化兔抗GST抗血清Amrad公司(澳大利亚)目录90001605号。
h．山羊抗兔-IgG-HRP:Amersham目录V010301号。
i．羊抗小鼠IgG(H+L):Jackson实验室目录5215-005-003号。
j．抗Lck(3A5)单克隆抗体Santa Cruz Biotechnology目录sc-433号。
k．单克隆抗磷酸酪氨酸UBI 05-321(可用UB40替代)。
缓冲液a．PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)1X溶液GIBCO PBS,GIBCO目录450-1300EB号。
b．阻断缓冲液100g BSA、12.1g TRIS(pH7.5)、58.44gNaCl、10ml吐温-20，用MilliQ H2O加至1L总体积。
c．碳酸盐缓冲液来自Fischer目录S495号的Na2CO4，用MilliQH2O加至100mM溶液。
d．激酶缓冲液1.0ml(来自1M贮存液)MgCl2、0.2ml(来自1M贮存液)MnCl2、0.2ml(来自1M贮存液)DTT、5.0ml(来自1M贮存液)HEPES、0.1ml TX-100，用MilliQ H2O加至10mL总体积。
e．溶解缓冲液5.0HEPES(来自1M贮存液)、2.74ml NaCl(来自5M贮存液)、10ml甘油、1.0ml TX-100、0.4ml EDTA(来自100mM贮存液)、1.0ml PMSF(来自100 mM贮存液)、0.1ml Na3VO4(来自0.1M贮存液)，用MilliQ H2O加至100mL总体积。
f．ATP:Sigma目录A-7699号，制备10mM贮存溶液(5.51mg/ml)。
g．TRIS-HCl:Fischer目录152-5号，向600ml MilliQ H2O中加入121.14g物料，用HCl调pH至7.5，用MilliQ H2O加至1L总体积。
h．NaCl:Fischer目录S271-10号，用MilliQ H2O制备5M贮存液。
i．Na3VO4:Fischer目录S454-50号，向80 ml的MilliQ H2O中加入1.8g物料，用HCl或NaOH调pH至10.0，在微波上煮沸，冷却，检查pH，反复调节pH直到pH在加热/冷却循环后保持稳定，用MilliQ H2O加至100ml总体积，制备1ml等分试样并在-80℃下贮存。
j．MgCl2:Fischer目录M33-500号，用MilliQ H2O加至1M贮存液。
k．HEPES:Fischer目录BP310-500号，向200ml的MilliQ H2O中加入59.6g物料，将pH调至7.5，用MilliQ H2O加至250ml总体积。灭菌过滤(1M贮存液)。
l．清蛋白，牛(BSA),Sigma目录A4503号，向150ml的MilliQH2O中加入30g物料，用MilliQ H2O加至300ml总体积，经0.22μm滤膜过滤，在4℃下贮存。
m．TBST缓冲液向900ml的dH2O中加入6.057g TRIS和8.766g NaCl，用HCl调pH至7.2，加入1.0ml Triton-X 100，用dH2O加至1L总体积。
n．MnCl2:Fischer目录M87-100号，用MilliQ H2O制备1M贮存液。
o．DTT:Fischer目录BP172-5号。
p．TBS(TRIS缓冲盐水)向900ml的MilliQ H2O中加入6.057gTRIS和8.777g NaCl，用MilliQ H2O加至1L总体积。
q．激酶反应混合物每测定板的量(100孔)1.0ml激酶缓冲液、200μgGST-ζ、用MilliQ H2O加至最终体积8.0ml。
方法制备lck包被的ELISA板。
1．在4℃下，将在100μl碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中用2.0μg/孔羊抗小鼠IgG包被过夜。
2．用PBS洗涤孔一次。
3．在室温下，用0.15ml的阻断缓冲液阻断板30分钟。
4．用PBS洗涤板5X。
5．在室温下，于1-2小时内加入在0.1ml PBS中的0.5μg/孔的抗lck(单克隆抗体3A5)。
6．用PBS洗涤板5X。
7．加入在溶解缓冲液(每孔0.1ml总体积)中稀释的20μg/孔的lck转化的酵母溶胞产物。在4℃下，振摇板过夜以阻止活性丧失。
制备磷酸酪氨酸抗体包被的ELISA板1．UB40板在4℃下，将在100μl PBS中的1.0μg/孔UB40过夜并用150μl阻断缓冲液阻断至少1小时。
激酶测定方法1．从板上除去未结合的蛋白并用PBS洗涤板5X。
2．每孔加入0.08ml激酶反应混合物(含有10μl的10X激酶缓冲液和每孔用水稀释的2μg GST-ζ)。
3．加入在含有10％DMSO的水中稀释的10μl化合物并在室温下预先孵育15分钟。
4．通过加入在水中10μl/孔的0.1mM ATP开始激酶反应(10μM ATP最终)。
5．在室温下，将ELISA板振摇60分钟。
6．通过每孔加入10μl的0.5 MEDTA终止激酶反应。
7．将90μl上清液转移至来自以上B部分的阻断的4G10包被的ELISA板。
8．在室温下，伴随振摇下孵育30分钟。
9．用TBST洗涤板5X。
10．在室温下，用在100μl TBST中稀释1∶5000的兔抗GST抗体孵育30分钟。
11．用TBST洗涤孔5X。
12．在室温下，将在100μl TBST中稀释1∶20,000的山羊抗兔-IgG-HRP孵育30分钟。
13．用TBST洗涤孔5X。
14．用Turbo TMB显色。
测量RAF磷酸化作用功能的测定。
以下测定报道RAF催化其靶蛋白MEK以及MEK靶MAPK的磷酸化的量。RAF基因序列在Bonner等，1985,Molec.Cell.Biol.,5:1400-1407中描述并易于在多基因序列数据库中得到。用于本发明该部分的核酸载体的结构和细胞系在Morrison等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8855-8859中充分描述。
材料与试剂1．Sf9(草地夜蛾(spodoptera frugiperda))细胞，GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD。
2．RIPA缓冲液20mM Tris/HCl pH7.4、137mM NaCl、10％甘油、1 mMPMSF、5 mg/L抑酶肽、0.5％TritonX-100。
3．硫氧环蛋白-MEK融合蛋白(T-MEK)按照制造商的方法，进行T-MEK的表达并经亲和层析法纯化。目录K350-01号和R350-40号，Invitrogen公司，San Diego,CA。
4．His-MAPK(ERK2)，在用pUC18载体编码的His-MAPK转化的XL1蓝细胞中表达His标记的MAPK。经Ni-亲和层析法纯化His-MAPK。如同在此描述的那样，目录27-4949-01号，Pharmacia,Alameda,CA。
5．绵羊抗小鼠IgG:Jackson实验室，West Grove,PA。目录515-006-008号，批号28563。
6．RAF-1蛋白激酶特异性抗体来自UBI的URP2653。
7．包被缓冲液PBS，磷酸盐缓冲盐水，GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD。
8．洗涤缓冲液TBST(50mM Tris/HCL pH 7.2,150mM NaCl,0.1％Triton X-100)。
9．阻断缓冲液TBST,0.1％乙醇胺(pH 7.4)。
10．DMSO,Sigma,St.Louis,MO。
11．激酶缓冲液(KB):20mM HEPES/HCl(pH7.2)、150mM NaCl、0.1％TritonX-100、1mMPMSF、5mg/L抑酶肽、75mM正钒酸钠、0.5MMDTT和10mM MgCl2。
12．ATP混合物100mM MgCl2、300mM ATP、10mCiγ33PATP(杜邦-NEN)/mL。
13．终止溶液1％磷酸，Fisher，匹兹堡，PA。
14．Wallac纤维素磷酸盐滤垫，Wallac,Turku，芬兰。
15．滤膜洗液1％磷酸，Fisher，匹兹堡，PA。
16．Tomtec板收获器，Wallac,Turku，芬兰。
17．Wallacβ板读出器1205号，Wallac,Turku，芬兰。
18．用于化合物的NUNC 96孔V形底聚丙烯板AppliedScientific目录A-72092号。
方法除非另外特别指明，所有以下步骤在室温下进行。
1．ELISA板包被在4℃下，用100ml绵羊抗小鼠亲和纯化抗血清(1mg/100 mL包被缓冲液)将ELISA孔包被过夜。当在4℃下贮存时，ELISA板能够使用2用。
2．翻转板并除去液体。加入100mL阻断溶液并孵育30分钟。
3．除去阻断溶液并用洗涤缓冲液洗涤4次。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。
4．向每孔中加入1mg的RAF-1特异性抗体并孵育1小时。如同在步骤3中描述的那样洗涤。
5．从RAS/RAF感染的Sf9细胞解冻溶胞产物并用TBST稀释至10mg/100 mL。向这些孔中加入10mg稀释的溶胞产物并孵育1小时。孵育期间，将板振摇。阴性对照组不接受溶胞产物。在对每种病毒的MOI为5时，用重组杆状病毒感染细胞后，从RAS/RAF感染的Sf9昆虫细胞制备溶胞产物，并于48小时后收获。用PBS洗涤细胞一次并在RIPA缓冲液中溶解。经离心(在10,000xg下5分钟)除去不溶的物料。在干冰/乙醇中冷冻溶胞产物的等分试样并在-80℃下贮存直到使用。
6．除去未结合的物料并如同以上概述的那样(步骤3)洗涤。
7．每孔加入2mg的T-MEK和2mg的His-MAEPK并用激酶缓冲液将体积调至40ml。通过实施例在此提供从细胞提取液中纯化T-MEK和MAPK的方法。
8．在TBST+I％DMSO中预先将化合物(贮存液10mg/ml DMSO)或提取液稀释20倍。向在步骤6中描述的孔中加入5 ml预先稀释的化合物/提取液。孵育20分钟。对照组不接受药物。
9．通过加入5ml ATP混合物开始激酶反应。在孵育期间，在ELISA板振摇器上振摇板10．60分钟后，通过向每孔加入30 mL终止溶液来终止激酶反应。
11．放入磷酸纤维素垫并把ELISA板放入Tomtec板收获器中。按照制造商的介绍收获并用滤膜洗涤溶液洗涤滤膜。干燥滤垫。密封滤垫并将它们置于固定器中。将该固定器插进放射活性检测仪器上并测定在滤垫上放射活性的磷的量。
或者，能够将来自测定板的各自孔的40 mL等分试样转移到磷酸纤维素滤垫上的相应位置。空气干燥滤膜后，将滤膜放于盘中。温和摇动该盘，以15分钟间隔变换洗涤溶液达1小时。空气干燥滤垫。密封滤垫并将它们置于适宜于测量样品中放射活性的磷的固定器上。将该固定器插进检测仪器中并测定在滤垫上放射活性的磷的量。
CDK2/细胞周期蛋白A-抑制测定该测定分析在内源性底物中的CDK2的蛋白激酶活性。
试剂A．缓冲液A:(80 mM Tris(pH 7.2),40 mM MgCl2),4.84g.Tris(F.W.=121.1g/mol),4.07g.MgCl2(F.W.=203.31g/mol)溶于500ml H2O中。用HCl调pH至7.2。
B．组蛋白H1溶液(0.45mg/ml组蛋白H1和20mMHEPES pH7.2:5mg组蛋白H1(Boehringer Mannheim)在11.111ml的20mM HEPESpH7.2(477mg HEPES(F.W.=238.3B/mol)溶于100ml ddH2O中，在-80℃下贮存1ml的等分试样。
C．ATP溶液(60μMATP,300μg/ml BSA,3 mMDTT):120μl10mM ATP,600μl10mg/ml BSA至20ml，在-80℃下贮存1ml的等分试样。
D．CDK2溶液cdk2/细胞周期蛋白A在10mM HEPES pH7.2、25mM NaCl、0.5mM DTT、10％甘油中，在-80℃下以9μl等分试样贮存。
方案1．制备要求的最终测定浓度为ddH2O/15％DMSO(体积)的抑制剂溶液三次。
2．将20μl抑制剂分散在聚丙烯96孔板的孔中(或20μl的15％DMSO中用于阳性和阴性对照组)。
3．解冻组蛋白H1溶液(1 ml/板)、ATP溶液(1ml/板+用于阴性对照组的1等分试样)和CDK2溶液(9μl/板)。将CDK2保持在冰上直到使用。将CDK2溶液适当等分以避免重复冷冻-解冻循环。
4．将9μlCDK2溶液稀释到2.1ml缓冲液A(每板)中。混合。将20μl分散进入每孔。
5．将1ml组蛋白H1溶液与1ml ATP溶液(每板)混合进入10ml旋转盖的管中。加入γ33P ATP以达到浓度0.15μCi/20μl(在测定中0.15μCi/孔)。小心混合以避免BSA泡沫。向适当的孔中加入20μl。在板振摇器上混合这些板。对阴性对照组，将ATP溶液与等量的20mM HEPES pH7.2混合并将γ33P ATP加入到浓度为0.15μCi/20μl的溶液中。向适当孔中加入20μl。
6．使反应进行60分钟。
7．向每孔中加入35μl的10％TCA。在板振摇器上混合板。
8．在P30方型滤垫(filter mat squares)上每一个样品点样40μl。使滤垫干燥(大约10-20分钟)。
9．用250ml的1％磷酸(每升 ddH2O 10ml磷酸)洗涤滤垫4X10分钟。
10．用β板读出器计算滤垫。
细胞/生物测定PDGF诱导的BrdU掺入测定材料与试剂(1)PDGF人PEGF B/B,1276-956,Boehringer Mannheim，德国。
(2)BrdU标记试剂10mM，在PBS(pH7.4)中，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(3)FixDenat固定溶液(现成使用的)，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(4)抗BrdU-POD与过氧化酶缀合的小鼠单克隆抗体，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(5)TMB底物溶液四甲基联苯胺(TMB)，现成可用，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(6)PBS洗涤液1X PBS,pH7.4,(Sugen公司，Redwood市，加利福尼亚)。
(7)清蛋白，牛(BSA)分级V粉末，A-8551,Sigma化学公司，USA。
(8)基因工程表达人PDGF-R的3T3细胞系。
方案(1)在96孔板上，在DMEM、10％CS、2mM Gln中以8000细胞/孔接种细胞。在5％CO2中，在37℃下，孵育细胞过夜。
(2)24小时后，用PBS洗涤细胞，并然后在无血清的培养基(含有0.1％BSA的0％CS DMEM)中进行血清饥饿(serum starved)24小时。
(3)在第3天，向细胞中同时加入配体(PDGF,3,8nM，在DMEM中用0.1％BSA制备)和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照细胞接受配体(PDGF)但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释7个试验浓度。
(4)在配体活化20小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)并用BrdU(最终浓度=10μM)孵育细胞1.5小时。
(5)在用标记试剂孵育后，通过倾析除去培养基并在纸巾上轻拍翻转的板。加入FixDenat溶液(50μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板45分钟。
(6)通过倾析来彻底除去FixDenat溶液并在纸巾上轻拍翻转的板。加入作为阻断溶液的牛奶(在PBS中5％脱水牛奶，200μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板30分钟。
(7)通过倾析除去阻断溶液并用PBS洗涤这些孔一次。加入(100μl/孔)抗BrdU-POD溶液(在PBS中1∶100稀释，1％BSA)并在室温下于板振摇器上孵育板90分钟。
(8)通过倾析彻底除去抗体结合物并用PBS冲洗孔5次，并通过翻转板和在纸巾上轻拍干燥板。
(9)加入TMB底物溶液(100μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板20分钟直到显色足以用于光度检测。
(10)在Dynatech ELISA板读出器上，在410nm(以具有作为参比波长的490nm下的滤波器的“双波长”模式读出)下测量样品的吸光度。
EGF诱导的BrdU掺入测定材料与试剂(1)EGF小鼠EGF,201,Toyobo有限公司，日本。
(2)BrdU标记试剂10mM，在PBS(pH7.4)中，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(3)FixDenat固定溶液(现成可用)，目录1647229号，BoehringerMannheim，德国。
(4)抗BrdU-POD与过氧化酶结合的小鼠单克隆抗体，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(5)TMB底物溶液四甲基联苯胺(TMB)，现成可用，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(6)PBS洗涤液1X PBS,pH 7.4,(Sugen公司，Redwood市，加利福尼亚)。
(7)清蛋白，牛(BSA)分级V粉末，A-8551,Sigma化学公司，USA。
(8)基因工程表达人EGF-R的3T3细胞系。
方案(1)在96孔板上，在DMEM、10％CS、2mM Gln中以8000细胞/孔接种细胞。在5％CO2中，在37℃下孵育细胞过夜。
(2)24小时后，用PBS洗涤细胞，并然后在无血清的培养基(含有0.1％BSA的0％CS DMEM)中进行血清饥饿24小时。
(3)在第3天，向细胞中同时加入配体(EGF,2nM，在DMEM中用0.1％BSA制备)和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照组细胞接受配体(EGF)但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释7个试验浓度。
(4)在配体活化20小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)并用BrdU(最终浓度=10μM)孵育细胞1.5小时。
(5)在用标记试剂孵育后，通过倾析除去培养基并在纸巾上轻拍翻转的板。加入FixDenat溶液(50μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板45分钟。
(6)通过倾析彻底除去FixDenat溶液并在纸巾上轻拍翻转的板。加入作为阻断溶液的牛奶(在PBS中的5％脱水牛奶，200μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板30分钟。
(7)通过倾析除去阻断溶液并用PBS洗涤这些孔一次。加入(100μl/孔)抗BrdU-POD溶液(在PBS中1∶100稀释，1％BSA)并在室温下于板振摇器上孵育板90分钟。
(8)通过倾析彻底除去抗体结合物并用PBS冲洗孔5次，并通过翻转和在纸巾上轻拍干燥板。
(9)加入TMB底物溶液(100μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板20分钟直到显色足以用于光度检测。
(10)在Dynatech ELISA板读出器上，在410nm(以具有作为参比波长的490nm下的滤波器的“双波长”模式读出)下测量样品的吸光度。
EGF诱导的Her2-驱动BrdU的掺入材料与试剂(1)EGF小鼠EGF,201,Toyobo有限公司，日本。
(2)BrdU标记试剂10mM，在PBS(pH7.4)中，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(3)FixDenat固定溶液(现成待用)，目录1647229号，BoehringerMannheim，德国。
(4)抗BrdU-POD与过氧化酶缀合的小鼠单克隆抗体，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(5)TMB底物溶液四甲基联苯胺(TMB)，现成待用，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(6)PBS洗涤液1X PBS,pH7.4，本室制备。
(7)清蛋白，牛(BSA)分级V粉末，A-8551,Sigma化学公司，USA。
(8)工程表达具有EGF-R细胞外域和Her2细胞内域的嵌合受体的3T3细胞系。
方案(1)在96孔板上，在DMEM、10％CS、2mM Gln中以8000细胞/孔接种细胞。在5％CO2中，在37℃下孵育细胞过夜。
(2)24小时后，用PBS洗涤细胞，并然后在无血清的培养基(含有0.1％BSA的0％CS DMEM)中进行血清饥饿24小时。
(3)在第3天，向细胞中同时加入配体(EGF=2 nM，在DMEM中用0.1％BSA制备)和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照组细胞接受配体(EGF)但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释7个试验浓度。
(4)在配体活化20小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)并用BrdU(最终浓度=10μM)孵育细胞1.5小时。
(5)在用标记试剂孵育后，通过倾析除去培养基并在纸巾上轻拍翻转的板。加入FixDenat溶液(50μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板45分钟。
(6)通过倾析彻底除去FixDenat溶液并在纸巾上轻拍翻转的板。加入作为阻断溶液的牛奶(在PBS中5％脱水牛奶，200μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板30分钟。
(7)通过倾析除去阻断溶液并用PBS洗涤这些孔一次。加入(100μl/孔)抗BrdU-POD溶液(在PBS中1∶100稀释，1％BSA)并在室温下于板振摇器上孵育板90分钟。
(8)通过倾析彻底除去抗体缀合物并用PBS冲洗孔5次，并通过翻转板和在纸巾上轻拍干燥板。
(9)加入TMB底物溶液(100μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板20分钟直到显色足以用于光度检测。
(10)在Dynatech ELISA板读出器上，在410nm(以具有作为参比波长的490nm下的滤波器的“双波长”模式读出)下测量样品的吸光度。
IGF1诱导的BrdU掺入测定材料与试剂(1)IGF1配体人重组G511,Promega公司，USA。
(2)BrdU标记试剂10mM，在PBS(pH7.4)中，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(3)FixDenat固定溶液(现成可用)，目录1647229号，BoehringerMannheim，德国。
(4)抗BrdU-POD与过氧化酶结合的小鼠单克隆抗体，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(5)TMB底物溶液四甲基联苯胺(TMB)，现成可用，目录1647229号，Boehringer Mannheim，德国。
(6)PBS洗涤溶液1X PBS,pH 7.4(Sugen公司，Redwood市，加利福尼亚)。
(7)清蛋白，牛(BSA)分级V粉末，A-8551,Sigma化学公司，USA。
(8)基因工程表达人IGF-1受体的3T3细胞系。
方案(1)在96孔板上，在DMEM、10％CS、2mM Gln中以8000细胞/孔接种细胞。在5％CO2中，在37℃下孵育细胞过夜。
(2)24小时后，用PBS洗涤细胞，并然后在无血清的培养基(含有0.1％BSA的0％CS DMEM)中进行血清饥饿24小时。
(3)在第3天，向细胞中同时加入配体(IGF1=3.3nM，在含有0.1％BSA的DMEM中制备)和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照组细胞接受配体(IGF1)但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释7个试验浓度。
(4)配体活化16小时后，加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100在DMEM中，0.1％BSA)并用BrdU(最终浓度=10μM)孵育细胞1.5小时。
(5)在用标记试剂孵育后，通过倾析除去培养基并在纸巾上轻拍翻转的板。加入FixDenat溶液(50μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板45分钟。
(6)通过倾析彻底除去FixDenat溶液并在纸巾上轻拍翻转的板。加入作为阻断溶液的牛奶(在PBS中5％脱水牛奶，200μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板30分钟。
(7)通过倾析除去阻断溶液并用PBS洗涤这些孔一次。加入(100μl/孔)抗BrdU-POD溶液(在PBS中1∶100稀释，1％BSA)并在室温下于板振摇器上孵育板90分钟。
(8)通过倾析彻底除去抗体结合物并用PBS冲洗孔5次，并通过翻转板和在纸巾上轻拍干燥板。
(9)加入TMB底物溶液(100μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育板20分钟直到显色足以用于光度检测。
(10)在Dynatech ELISA板读出器上，在410nm(以含有在490nm作为参比波长的滤波器的“双波长”模式读出)下测量样品的吸光度。
FGF诱导的BrdU掺入测定该测定法测量在表达内源性FGF受体的3Tc7/EGFr细胞中FGF诱导的DNA合成。
材料与试剂1．FGF人FGF2/bFGF2(Gibco BRL,13256-029号)。
2．BrdU标记试剂，(10mM PBS(pH7.4),Boehringer Mannheim目录1647229号)。
3．FixDenat固定溶液(Boehringer Mannheim目录1647229号)。
4．抗BrdU-POD(与过氧化酶结合的小鼠单克隆抗体，BoehringerMannheim目录1647229号)。
5．TMB(四甲基联苯胺，Boehringer Mannheim目录1647229号)。
6．PBS洗涤溶液，pH7.4(Sugen公司)。
7．清蛋白，牛(BSA)分级V粉末(Sigma化学公司目录A-8551号)。
方法1．3T3工程化细胞系3T3c7/EGFr。
2．在96孔板上，在DMEM、10％CS和2mM Gln中以8,000细胞/孔接种细胞。在5％CO2中，在37℃下孵育24小时。
3．在24小时后，用PBS洗涤细胞，并然后在无血清的培养基(0％DMEM,0.1％BSA)中进行血清饥饿24小时。
4．同时加入配体(在含有0.1％BSA的DMEM中FGF2(1.5nM))和受试化合物。阴性对照组孔仅接受含有0.1％BSA的无血清DMEM，阳性对照组孔接受FGF2配体但不含有受试化合物。在96孔板上，在含有配体的无血清DMEM中制备受试化合物，并连续稀释制备七(7)个试验浓度。
5．20小时后，向细胞中加入稀释的BrdU标记试剂(1∶100BrdU∶DMEM,0.1％BSA，最终浓度为10μM)并孵育1.5小时。
6．倾析培养基。用纸巾除去痕量物料。加入FixDenat(50μl/孔)并在室温下于板振摇器上孵育45分钟。
7．除去FixDenat溶液。加入阻断溶液(在PBS(200μl/孔)中的5％脱水牛奶)并在室温下于板振摇器上孵育板30分钟。
8．倾析阻断溶液，PBS洗涤孔一次。加入抗BrdU-POD溶液(在PBS中1∶100稀释，0.1％BSA)，在室温下于板振摇器上孵育90分钟。
9．倾析抗体结合物，用PBS冲洗孔5次。通过翻转板和在纸巾上轻拍干燥板。
10．加入TMB溶液(100μl/孔)，在室温下于板振摇器上孵育板20分钟直到显色足以用于光度检测。
11．使用具有490nm滤波器的“双波长”模式，在DynatechELISA板读出器上，于410nm下测量吸光度。
生物化学EGFR测定法使用ELISA，该测定法测量EGFR的体外激酶活性。
材料与试剂1．Corning 96孔Elisa板(Corning目录25805-96号)。
2．SUMO1单克隆抗EGFR抗体(生物化学实验室，SUGEN公司)。
3．PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)，Gibco目录450-1300EB号。
4．TBST缓冲液试剂 分子量 工作浓度 每L的量Tris121.14 50mM 6.057gNaCl58.44150mM8.766gTriton X-100NA 0.1％1.0ml5．阻断缓冲液试剂 分子量 工作浓度每100ml的量淡红色速溶非 5％ 5.0g脂肪牛奶PBSNA NA 100m6．A431细胞溶胞产物(筛选实验室，SUGEN公司)。
7．TBS缓冲液试剂分子量 工作浓度 每L的量Tris121.14 50mM 6.057gNaCl58.44150mM 8.766g8．TBS+10％DMSO试剂分子量 工作浓度 每L的量Tris121.14 50mM 1.514gNaCl58.44150mM 2.192gDMSONA 10％ 25ml9．腺苷酸-5′-三磷酸(ATP，来自马的肌肉，Sigma目录A-5394号)。
在dH2O中制备1.0mM溶液。临用前制备该试剂并保持在冰上。
10．MnCl2。
在dH2O中制备1.0M贮存液。
11．ATP/MnCl2磷酸混合物试剂贮存溶液 每10ml量 工作浓度ATP 1.0mM300μl30μMMnCl21.0M 500μl50mMdH2O 9.2ml
临用前制备该试剂并保持在冰上。
12．NUNC 96孔V形底聚丙烯板(Applied Scientific目录A-72092号)。
13．乙二胺四乙酸(EDTA)在dH2O中制备200mM工作溶液。用10N NaOH将pH调节至8.0。
14．兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(生物化学实验室，SUGEN公司)。
15．山羊抗兔IgG过氧化酶结合物(生物来源目录ALI0404号)。
16．ABTS(2,2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，Sigma目录A-1888号)。
试剂 分子量工作浓度 每L的量枸橼酸 192.12100mM 19.21gNa2HPO4141.96250mM 35.49gABTS NA0.5mg/ml 500mg首先在大约900ml dH2O中，用磷酸将pH调节至4.0。加入ABTS，盖上，放置大约0.5小时，过滤。溶液应在4℃下保持于暗处直到使用。
17．过氧化氢30％溶液(Fisher目录H325号)。
18．ABTS/H2O2将15ml ABTS溶液和2.0μl H2O2混合。使用前5分钟制备。
19．0.2M HCl。
方法1．在100μl PBS中，每孔用0.5μg SUMO1包被Corning 96孔ELISA板，在4℃下贮存过夜。
2．通过翻转板以除去液体，从这些孔中除去未结合的SUMO1。用dH2O洗涤1X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。
3．向每孔中加入150μl阻断缓冲液。在室温下，伴随振摇孵育30分钟。
4．用去离子水洗涤板3X，然后用TBST洗涤一次。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。
5．在PBS中稀释溶胞产物(7μg溶胞产物/100μl PBS)。
6．向每孔加入100μl稀释的溶胞产物。在室温下，振摇60分钟。
7．如以上在4中所述洗涤板。
8．向含有捕获EGFR的ELISA板加入120μl TBS。
9．在96孔聚丙烯板上以TBS稀释受试化合物1∶10(即10μl化合物+90μlTBS)。
10．向ELISA板加入13.5μl稀释的受试化合物。向对照组孔(这些孔不接受任何受试化合物)加入13.5μ1 TBS+10％DMSO。
11．在室温下，伴随振摇下孵育30分钟。
12．除了阴性对照组孔不接受ATP/MnCl2以外，直接向所有的孔加入15μl磷酸化混合物(最后孔体积应为大约在每孔中含有3μMATP/5mM MnCl2的150μl最终浓度)。伴随振摇下孵育5分钟。
13．5分钟后，通过向每孔中加入16.5μl的200mM EDTA(pH8.0)终止反应，持续振摇。在已加入EDTA后，振摇1分钟。
14．用去离子水洗涤4X，用TBST洗涤2次。
15．向每孔中加入100μl抗磷酸酪氨酸(在TBST中稀释1∶3000)。在室温下，伴随振摇下孵育30-45分钟。
16．如同以上在4中描述的那样洗涤。
17．向每孔中加入100μl生物来源的山羊抗兔IgG过氧化酶结合物(在TBST中稀释1∶2000)。在室温下，伴随振摇下孵育30分钟。
18．如同以上在4中描述的那样洗涤。
19．向每孔中加入100μl的ABTS/H2O2溶液。
20．伴随振摇下孵育5-10分钟。除去任何气泡。
21．如果必要，向每孔加入100μl的0.2M HCl终止反应。
22．在Dynatech MR 7000 ELISA读出器上读取试验。受试滤波器410nM，参比滤波器630Nm。
生物化学PDGFR测定法使用ELISA，该测定法测量PDGFR的体外激酶活性。
材料与试剂除非另外指明，与以上生物化学EGFR测定法一样，制备以下试剂的工作溶液。
1．Corning 96孔Elisa板(Coming目录25 805-96号)。
2．28D4C10单克隆抗PDGFR抗体(生物化学实验室，SUGEN公司)。
3．PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)，Gibco目录450-1300EB号。
4．TBST缓冲液。
5．阻断缓冲液。
6．表达NIH 3T3细胞溶胞产物的PDGFR-β(筛选实验室，SUGEN公司)。
7．TBS缓冲液。
8．TBS+10％DMSO。
9．腺苷酸-5′-三磷酸(ATP，来自马的肌肉，Sigma A-5394号)。
10．MnCl2。
11．激酶缓冲磷酸化混合物。
试剂贮存溶液每10ml的量工作浓度Tris 1M 250μl 25mMNaCl 5M 200μl 100mMMnCl21M 100μl 10mMTX-100100mM 50μl0.5mM12．NUNC 96孔V形底聚丙烯板Applied Scientific目录AS-72092号。
13．乙二胺四乙酸(EDTA)。
14．兔多克隆抗磷酸酪氨酸血清(生物化学实验室，SUGEN公司)。
15．山羊抗兔IgG过氧化酶结合物(生物来源目录ALI0404号)。
16．2,2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS,Sigma目录A-1888号)。
17．过氧化氢30％溶液(Fisher目录H325号)。
18．ABTS/H2O2。
19．0.2M HCl。
方法1．在100μl PBS中，用每孔0.5μg 28D4C10包被96孔ELISA板，在4℃下贮存过夜。
2．通过转移板以除去液体，从这些孔中除去未结合的28D4C10。用dH2O洗涤1X。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。
3．向每孔中加入150μl阻断缓冲液。在室温下，伴随振摇下孵育30分钟。
4．用去离子水洗涤板3X，然后用TBST洗涤一次。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。
5．在HNTG中稀释溶胞产物(10μg溶胞产物/100μl HNTG)。
6．向每孔加入100μl稀释的溶胞产物。在室温下，振摇60分钟。
7．如同以上在4中描述的那样洗涤板。
8．向含有捕集PDGFR的ELISA板加入80μl工作激酶缓冲液混合物。
9．在96孔聚丙烯板上以TBS稀释受试化合物1∶10(即10μl化合物+90μl TBS)。
10．向ELISA板加入10μl稀释的受试化合物。向对照组孔(这些孔不接受任何受试化合物)加入10μl TBS+10％DMSO。
11．在室温下，伴随振摇下孵育30分钟。
12．除了阴性对照组孔以外，直接向所有的孔加入10μl ATP(最后孔体积应为大约在每孔中含有20μM EDTA的100μl)。伴随振摇下孵育30分钟。
13．30分钟后，通过向每孔中加入10μl的200 mMEDTA(pH 8.0)终止反应。
14．用去离子水洗涤4X，用TBST洗涤2次。
15．向每孔中加入100μl抗磷酸酪氨酸(在TBST中稀释1∶3000)。在室温下，伴随振摇下孵育30-45分钟。
16．如同以上在4中描述的那样洗涤。
17．向每孔中加入100μl生物来源的山羊抗兔IgG过氧化酶结合物(在TBST中稀释1∶2000)。在室温下，伴随振摇下孵育30分钟。
18．如同以上在4中描述的那样洗涤。
19．向每孔中加入100μl ABTS/H2O2溶液。
20．伴随振摇下孵育10-30分钟。除去任何气泡。
21．如果必要，经向每孔加入100μl的0.2MHCl终止反应。
22．在Dynatech MR 7000 ELISA读出器上读取测定值。受试滤波器410nM，参比滤波器630nM。
生物化学FGFR测定该测定使用ELISA测量Myc-GyrB-FGFR融合蛋白的体外激酶活性。
材料和试剂1．HNTG试剂 分子量 5x存液浓度每L的量 1x工作浓度HEPES 238.3 100mM 23.83g 20mMNaCl 58.44 750mM 43.83g 150mM甘油 NA 50％ 500ml 10％Triton X-100 NA 5％ 10ml1.0％为制备1升5x贮存溶液，将HEPES和NaCl溶于大约350ml dH2O中，用HCl或NaOH(在所使用的HEPES中分散)把pH调至7.2，加入甘油、Triton X-100并然后以dH2O加至体积。
2．PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)，Gibco目录450-1300EB号)。
3．阻断缓冲液。
4．激酶缓冲液。
试剂分子量 10x贮存浓度 1x工作浓度HEPES(pH 7.2) 238.3 500mM 50mMMnCl220mM 2mMMgCl2203.32 200mM 10mMTriton-X-100 1％ 0.1％DTT 380.35 5mM 0.5mM5．苯基甲基磺酰氟(PMSF,Sigma目录P-7626号)工作溶液在乙醇中100mM。
6．ATP(细菌来源，Sigma目录A-7699号)。
使用每ml的MilliQ H2O3.31 mg用于贮存液浓度6mM。
7．生物素结合的抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(克隆4G10,Upstate生物技术公司目录16-103号，系列号14495)8．Vectastain Elite ABC试剂(抗生物素蛋白过氧化酶结合物，Vector实验室目录PK-6 100号)。
9．ABST溶液。
10．过氧化氢30％溶液(Fisher目录H325号)。
11．ABTS/H2O2。
12．0.2M HCl。
13．TRIS HCl(Fisher目录BP152-5号)。
在MilliQ H2O中制备1.0mM溶液，用HCl将pH调至7.2。
14．NaCl(Fisher目录S271-10号)。
在MilliQ H2O中制备5 M溶液。
15．MgCl2(Fisher目录M33-500号)。
在MilliQ H2O中制备1M溶液。
16．HEPES(Fisher目录BP310-500号)。
在MilliQ H2O中制备1M溶液，将pH调至7.5，灭菌过滤。
17．TBST缓冲液。
18．碳酸钠缓冲液(Eisher目录S495号)。
在MilliQ H2O中制备0.1M溶液，用NaOH将pH调至9.6，过滤。
19．二硫苏糖醇(DTT,Fisher目录BP172-25号)。
临用前在MilliQ H2O中制备0.5mM工作溶液。在-20℃下贮存直到使用，倾析任何剩余物。
20．MnCl2。
21．Triton X-100。
22．山羊α-兔IgG(Cappel)。
23．亲和纯化兔αGSTGyrB(生物化学实验室，SUGEN公司)。
方法除非另外指明，所有以下步骤在室温下进行。
1．在碳酸盐缓冲液中，用每孔2μg山羊α-兔抗体包被Corning96孔ELISA板，以达到总体积为100μl，在4℃下过夜贮存。
2．通过翻转板倒出液体来除去未结合的山羊α-兔抗体。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。
3．向每孔中加入150μl阻断缓冲液(在PBS中5％低脂肪牛奶)。孵育30分钟，其间在微滴定板振摇器上振摇。
4．用TBST洗涤4x。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体和气泡。
5．每孔加入0.5μg兔α-GyrB抗体。在DPBS中将抗体稀释至最终体积每孔100μl。在室温下，伴随在微滴定板振摇器上振摇孵育1小时。
6．如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4x。
7．向每孔中加入在HNTG中的2μg COS/FGFR细胞溶胞产物(Myc-GyrB-FGFR来源)，得到最终体积每孔100μl。在室温下，伴随在微滴定板振摇器上振摇孵育1小时。
8．如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4次。
9．每孔加入80μl的1x激酶缓冲液。
10．在聚丙烯96孔板上，在1x激酶缓冲液+1％DMSO中稀释受试化合物1∶10。
11．从聚丙烯板孔中将10μl稀释的受试化合物溶液和对照组孔转移至相应的ELISA板孔，伴随在微滴定板振摇器上振摇孵育20分钟。
12．向阳性对照组和试验组孔中加入在激酶缓冲液中稀释的10μl的70μM ATP(最终ATP浓度为7μl/孔)。向阴性对照组加入10μl的1x激酶缓冲液。伴随在微滴定板振摇器上振摇孵育15分钟。
13．通过向所有的孔中加入5μl的0.5M EDTA终止激酶反应。
14．如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4x。
15．向每孔中加入在TBST中稀释的100μl生物素结合α-磷酸酪氨酸单克隆抗体(b4G10)，伴随在微滴定板振摇器上振摇孵育30分钟。
16．制备Vectastain ABC试剂。向15ml TBST中加入1滴试剂A。通过倒转试管几次来混合。加入1滴试剂B并再次混合。
17．如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4次。
18．向每孔中加入100μl ABC HRP试剂。伴随在微滴定板振摇器上振摇孵育30分钟。
19．如同在步骤4中描述的那样，用TBST洗涤4次。
20．向每孔中加入100μl ABTS/H2O2溶液。
22．伴随振摇下孵育5-15分钟。除去任何气泡。
23．如果必要，通过加入100μl的0.2M HCl/孔终止反应。
24．在Dynatech MR 7000 ELISA板读出器上读取测定值。受试滤波器410nM，参比滤波器630nM。
生物化学FLK-1测定使用ELISA，该测定评价flk-1自动磷酸化体外活性。
材料和试剂1．15cm组织培养盘。
2．Flk-1/NIH细胞过度表达人flk-1克隆3的NIH成纤维细胞系(SUGEN公司，从MPI,Martinsried，德国得到)。
3．生长培养基DMEM+热灭活的10％FBS和2mM谷氨酰胺(Gibco-BRL)。
4．饥饿培养基DMEM+0.5％热灭活的FBS、2mM谷氨酰胺(Gibco-BRL)。
5．Corning 96孔ELISA板(Coming目录25805-96号)。
6．对flk-1特异性的L4或E38单克隆抗体，经蛋白质-A琼脂糖亲和层析法(SUGEN公司)纯化。
7．PBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)，Gibco目录450-1300EB号)。
8．HNTG(参见用于制备的BIOCHEMICAL FGFR)。
9．Pierce BCA蛋白质测定试剂盒。
10．阻断缓冲液。
11．TBST(pH7.0)。
12．激酶缓冲液。
13．激酶终止溶液200mM EDTA。
14．对磷酸酪氨酸特异性的生物素化4G10(UBI目录16-103号)。
15．AB试剂盒(Vector实验室目录PK4000号)。
16．DMSO。
17．NUNC96孔V形底聚丙烯板Applied Scientific目录AS-72092号。
18．Turbo-TMB(Pierce)。
19．Turbo-TMB终止溶液1M H2SO4。
20．ATP(Sigma目录A-7699号)。
21．在TBS中的20％DMSO(pH7.0)。
方法细胞生长和溶胞产物制备1．将细胞接种到生长培养基中并在37℃和5％CO2下生长2-3天以达到90-100％汇合。不超过传代20次。
2．除去培养基并用PBS洗涤细胞两次。用HNTG溶解缓冲液来溶解。收集所有溶胞产物并将它们进行涡流混合20-30秒。
3．经离心(在大约10,000xg下5-10分钟)除去不溶的物料。
4．使用BCA试剂盒，测定蛋白质浓度。
5．将溶胞产物分配成1mg等分试样，在-80℃下贮存。
测定方法1．在100μl PBS中，用2μg/孔纯化的L4(或E38)包被Coming96孔ELISA板，在4℃下贮存过夜。
2．通过倒转板以除去液体，从这些孔中除去未结合的蛋白。用dH2O洗涤一次。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。
3．用每孔150μl阻断缓冲液阻断板。在4℃下，伴随振摇下孵育45-60分钟。
4．除去阻断缓冲液并用dH2O洗涤ELISA板三次并用TBST洗涤一次。在纸巾上轻拍板以除去过量的液体。
5．在PBS中稀释溶胞产物以得到最终浓度50μg/100μl。向每孔中加入100μl稀释的溶胞产物。在4℃下，伴随振摇下孵育过夜。
6．通过倒转板，从这些孔中除去未结合的蛋白。如同在步骤4中那样洗涤。
7．向每孔中加入80μl激酶缓冲液(向阴性对照组孔加入90μl)。
8．将受试化合物(正常稀释10倍)稀释到在TBS中的含有20％DMSO聚丙烯板的孔中。
9．向含有固定化的flk-1的ELISA孔中加入10μl稀释的化合物并振摇。对照组孔不接受化合物。
10．从贮存液1mM ATP中，制备在dH2O中的0.3mM ATP溶液(或者可使用激酶缓冲液)。
11．除了阴性对照组以外，向所有孔加入10μl的0.3mMATP。在室温下，伴随振摇下孵育60分钟。
12．1小时后，通过加入11μl的200mMEDTA终止激酶反应。振摇1-2分钟。
13．用dH2O洗涤ELISA板4次并用TBST洗涤两次。
14．向所有孔中加入100μl的l∶5000生物素化的4G10:TBST。在室温下，伴随振摇下孵育45分钟。
15．在以上孵育期间，向10ml的TBST加入来自ABC试剂盒50μl的溶液A和B。临用前大约30分钟，必须合并这些溶液。
16．如同在步骤4中那样洗涤板。
17．向所有孔中加入100μl预先形成的A和B复合物。在室温下，伴随振摇下孵育30分钟。
18．如同在步骤4中那样，洗涤板。
19．加入100μlturbo-TMB。在室温下，振摇10-15分钟。
20．当在阳性对照组孔的颜色达到大约0.35-0.4的吸光度时，用100μl的turbo-TMB终止溶液来终止反应。
21．在Dynatech MR 7000 ELISA读出器上读取板。受试滤波器450nM，参比滤波器410nM。
HUV-EC-C测定以下方案也可用于测量化合物的抗PDGF-R、FGF-R、VEGF、aFGF或Flk-1/KDR的活性，所有这些经HUV-EC细胞天然表达。
第0天1．洗涤并经胰蛋白酶消化HUV-EC-C细胞(人脐静脉内皮细胞，(美国Type Culture Collection目录1730号CRL)。在大约1ml/10cm2的组织培养基烧瓶中，用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS，从Gibco BRL得到，目录14190-029号)洗涤两次。在非酶促细胞解离溶液(Sigma化学公司，目录C-1544号)中，用0.05％胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶消化。通过在细胞解离溶液中稀释0.25％胰蛋白酶/1mMEDTA(Gibco，目录25200-049号)，制备0.05％胰蛋白酶。在37℃下，用大约1ml/25-30cm2的组织培养基烧瓶胰蛋白酶消化大约5分钟。在细胞从烧瓶中脱离后，加入等体积的测定培养基并转移至50ml灭菌离心试管(Fisher Scientific，目录05-539-6号)。
2．在50ml灭菌离心试管中，通过加入测定培养基用大约35ml测定培养基洗涤细胞，在大约200xg下离心10分钟，抽出上清液，并用35ml D-PBS再悬浮。用D-PBS重复洗涤另外两次，在大约1ml测定培养基/15cm2的组织培养基烧瓶中重悬浮这些细胞。测定培养基含有F12K培养基(Gibco BRL，目录21127-014号)和0.5％热不活化小牛血清。用Coulter计数器(Coulter Electronics公司)计算细胞并向细胞中加入测定培养基，得到浓度0.8-1.0×105细胞/ml。
3．以100μl/孔或0.8-1.0×104细胞/孔向96孔平底板上加入细胞，在37℃,5％CO2下孵育～24小时。
第1天1．在另外一个96孔板上，制备两倍的受试化合物的滴定液，一般从50μM向下至0μM。如同在以下第0天步骤2中提及的那样，使用相同的测定培养基。通过向特殊板柱的顶端孔加入在200μM(4X最终孔浓度)下的90μl/孔的受试化合物来制备滴定液。因为贮存的受试化合物通常为在DMSO中的20mM，所以200μM药物浓度含有2％DMSO。
为稀释受试化合物，在测定培养基中含有多达2％DMSO的稀释液用作受试化合物滴定液的稀释液但保持DMSO的浓度恒定。在60μl/孔下，将该稀释液加入到在所述柱的剩余的孔中。在柱的顶端孔中，从120μl的200μM受试化合物稀释液中取60μl并与柱的第二个孔的60μl混合。从第二个孔中取60μl并与柱的第三个孔的60μl混合，并且如此进行下去直到完成两倍的滴定。当进行到倒数第一个孔的混合时，在该孔中的120μl取60μl并将它丢弃。留下最后一个含有60μl DMSO/培养基稀释液的孔作为不含有受试化合物的对照组。制备9个柱的滴定的受试化合物，使每孔足以重复三次，用于(1)VEGF(从 Pepro Tech公司得到，目录100-200号)，(2)内皮细胞生长因子(ECGF)(也称作酸性成纤维细胞生长因子或aFGF)(Boehringer MannheimBiochemica，目录1439600号)，或(3)人PDGF B/B(1276-956,Boehringer Mannheim，德国)和测定培养基对照组。ECGF成为含有肝素钠的制备液。
2．从第0天开始，将50μl/孔受试化合物的稀释液转移至含有0.8-1.0×104/细胞100μl/孔的HUV-EC-C细胞的96孔测定板，并在37℃,5％CO2下孵育～2小时。
3．重复三次，向每个受试化合物情况下加入50μl/孔的80μg/ml VEGF、20ng/ml ECGF或对照培养基。对受试化合物而言，生长因子浓度为4X是要求的最终浓度。使用来自第0天步骤2的测定培养基制备生长因子的浓度。在37℃,5％CO2下孵育大约24小时。每孔将含有50μl受试化合物稀释液、50μl生长因子或培养基和100μl细胞，其计数至200μl/孔总数。因此，受试化合物和生长因子的4X浓度一次性变成1X，将每一种物质加入到孔中。
第2天1．在1μCi/孔(在RPMI培养基+10％热不活化小牛血清中制备的10μl/孔的100μCi/溶液)中加入3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(Amersham，目录TRK-686号)并在37℃,5％CO2下孵育～24小时。从Gibco BRL，目录11875-051号得到RPMI。
第3天1．在-20℃下，将板冷冻过夜。
第4天解冻板并用96孔板收获器(Tomtec Harvester 96)收获至滤垫(Wallac，目录1205-401号)上，在Wallac BetaplateTM液体闪烁计数器上读数。
体内动物模型异种移植动物模型人肿瘤在无胸腺小鼠上作为异种移植的生长能力提供一个研究对用于人肿瘤疗法的生物应答的有用体内模型。因为人肿瘤首先成功异种移植到无胸腺小鼠中，(Rygaard和Povlsen,1969,Acta Pathol.Microbial.Scand.77:758-760)，许多不同的人肿瘤细胞系(例如，乳房、肺、泌尿生殖、胃-肠道、头和颈、成细胞胶质、骨和噁性黑素瘤)已被移植并且在裸小鼠上成功生长。以下测定可用于测定不同的本发明化合物的活性、特异性和作用水平。三个一般类型的测定用于评价化合物细胞/催化、细胞/生物学和体内类型。细胞/催化测定的目的是测定化合物对TK使细胞中已知底物上酪氨酸磷酸化的能力的作用。细胞/生物测定的目的是测定化合物在经细胞中的TK刺激的生物学应答中的作用。体内测定的目的是测定化合物在特殊疾病如癌症的动物模型中的作用。
用于皮下异种移植实验的适宜的细胞系包括基因工程过度表达EGFR、PDGFR、IGF-1R或任何其它的受试激酶的C6细胞(神经胶质瘤，ATCC#CCL 107)、A375细胞(黑素瘤，ATCC#CRL 1619)、A431细胞(表皮瘤，ATCC#CRL 1555)、Calu 6细胞(肺，ATCC#HTB 56)、PC3细胞(前列腺，ATCC#CRL 1435)、SKOV3TP5细胞和NIH 3T3成纤维细胞。以下方案能够用于进行异种移植实验从Simonsen实验室(Gilroy,CA)得到雌性无胸腺小鼠(BALB/c,nu/nu)。在具有α-dri床(bedding)的微隔离器笼子洁净房间条件下，维持所有动物。它们接受灭菌啮齿动物食物和自由饮水。
使细胞系在适宜的培养基(例如，MEM、DMEM、Ham氏F10或Ham氏F12加上5％-10％小牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺(GLN))中生长。除非另外指明，从Gibco Life Technologies(长岛，NY)购买所有细胞培养基、谷氨酰胺和小牛血清。在37℃下，于90-95％空气的潮湿气氛和5-10％CO2中生长所有细胞。每周所有细胞系常规传代培养两次并如同Mycotect方法(Gibco)测定那样对支原体呈阴性。
在或接近具有0.05％胰蛋白酶-EDTA的汇合下收获细胞并在450xg下沉淀10分钟。将沉淀重悬浮于灭菌PBS或培养基(不含有FBS)中，达到特定的浓度并将细胞植入小鼠(每组8-10只小鼠，2-10×106细胞/动物)的后胁腹。使用游标卡尺于3-6周内测量肿瘤生长。除非另外指明，用长×宽×高作为结果计算肿瘤体积。使用斯氏(students)t-检验计算P值。经在不同浓度下IP注射给予在50-100μL赋形剂(DMSO或VPD:D5W)中的受试化合物，一般在植入后第一天开始。
肿瘤侵袭模型已确立以下肿瘤侵袭模型并可用于评价已鉴定选择性抑制KDR/Flk-1受体的化合物的治疗值和效力。
方法8周龄裸鼠(雌性)(Simonsen公司)用作实验动物。在血液层流中可植入肿瘤细胞。腹膜内给予甲苯噻嗪/氯胺酮混合剂(100mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪)用于麻醉。做一正中切口(大约1.5cm长度)以暴露腹腔，注射在100μL培养基体积中的107肿瘤细胞。将细胞注射到胰的十二指肠叶(lobe)或结肠的浆膜中。用6-0丝线连续缝合来封闭腹膜和肌肉并经使用伤口夹封闭皮肤。每天观察动物。
分析2-6周后，依肉眼观察动物而定，处死小鼠，切除转移到多种器官(肺、肝、脑、胃、脾、心、肌肉)的局部肿瘤并进行分析测量肿瘤体积、侵袭等级、免疫化学，原位杂交测定等。
细胞毒性的测量治疗化合物在抑制受体酪氨酸激酶活性方面应比产生的细胞毒作用更有效。通过测定治疗指数即IC50/LD50，能得到化合物的有效性和细胞毒性的测量。使用标准技术例如那些在此描述的技术，可测量获得50％抑制率需要的剂量IC50，也通过使用标准技术(Mossman,1983,J.Immunol.Methods,65:55-63)、经测量释放LDH的量(Korzeniewski和Callewaert,1983,J.Immunol.Methods,64∶313,Decker和Lohmann-Matthes,1988,J.Immunol.Methods,115∶61)或测量动物模型的致死剂量，也能够测量导致50％毒性的剂量LD50。具有大的治疗指数的化合物为优选。所述治疗指数应大于2，优选至少为10，更优选至少为50。
B．实施例-生物学活性本发明化合物的体外效力的实施例显示在表1和2中。数据显示化合物一般在体外相当有效地抑制多种PTKs。当在体内试验时，化合物也维持优良的活性。例如当口服给药时，本发明几个化合物呈现显著减少皮下植入小鼠的C6神经胶质瘤肿瘤的平均体积。然而，化合物5显著地优于本发明其它化合物。在一个实验中，在第0天将C6人神经胶质瘤细胞(3×106细胞，n=10-20只动物/组)皮下植入到雌性BALB/c nu/nu小鼠的后胁腹。在植入后第一天，以200 mg/kg/天的剂量开始口服给予在labrasol水溶液中的化合物3、5、19和20。使用游标卡尺测量肿瘤生长并作为长×宽×高的结果计算肿瘤体积。 如同在下图中显示的那样，与仅有媒介物的对照组相比较，所有受试化合物显示明显的抑制作用。然而，化合物5明显地和令人惊奇地优于其它化合物(考虑到受试化合物的密切的结构相似性)。即在植入后第18天，当化合物3、19和21抑制肿瘤生长集中在大约40-45％的抑制率时，化合物5在此时抑制肿瘤生长达80-85％。
当它与化合物65比较时，化合物5在体内，特别是口服给药时的意想不到的效力被进一步证实。 化合物65在体外显示比化合物5(数据未显示)几乎高一个数量级的效力。然而，当在小鼠腹膜内试验抗两个不同的肿瘤细胞系SF763T和SF767T时，化合物5从稍微(在21天高5％抑制率)到显著地(在21天高14％抑制率)比化合物65更有效。
当两个化合物口服给药时，化合物5与化合物65之间的活性差异甚至更大。化合物65和它的几个类似物，化合物66-69的口服效力如下图所示 如同从图上能观察到的那样，口服给予200mg/kg/天的化合物65，小鼠皮下植入18天后，对C6人肿瘤显示大约65％的抑制率，该化合物明显优于其自身类似物，后者具有平均大约14-16％肿瘤生长的抑制率。然而，令人惊奇地是化合物65的口服效力仍然显著低于化合物5，在相同的肿瘤模型上，在相同时间内，化合物5如上提到的那样证实具有80-85％的抑制率。
当与化合物70相比较时，化合物5对FGF-R1(化合物5的1.2比化合物70的19.49)和PDGFR(数据未显示)显示明显更小(即更大的效力)的Ki′s(抑制常数)。 当化合物5的口服效果与密切的类似物，即化合物71的效果相比较时，进一步证实其意想不到的优越性。 不管结构相似性，当口服200 mg/kg/天抑制BALB/c nu/nu小鼠皮下植入C6人黑素瘤实验时，在植入后18天时，再次与化合物5证实的80-85％的抑制率相比较，化合物71仅显示肿瘤生长的57％的抑制率(数据未显示)。
基于以上化合物5口服给药时令人惊奇的效力，化合物5目前为本发明优选的实施方案。
结论因此，人们将意识到本发明的化合物、方法和药用组合物在调控PK活性中是有效的并因此被期待作为抗RTK、CTK和STK相关的疾病的有效治疗药物。
本领域技术人员将易于意识到，本发明非常适宜于实施所述目的并获得结果及所提到的优点以及那些在此固有的优点。在此描述的分子复合物和方法、步骤、治疗、分子、特殊化合物为目前优选实施方案的代表，是举例说明的，并不打算限制本发明的范围。对那些本领域技术人员而言，将出现其它的变化和用途，这些变化和用途包括在本发明精神范围内，其通过权利要求的范围定义。
对本领域技术人员显而易见的是对在此公开的发明可做变化的替代和改进而不背离本发明的范围和精神。
在本说明书中提及的所有专利和出版物处于与本发明相称的本领域的技术人员的水平范围内。在此所有专利和出版物通过引用结合到本文中，引用程度就好象每一个各自的出版物是特殊的和独立地通过引用结合到本文中。
在此适宜于举例说明的本发明可在不存在任何要素、在此未特别公开的限制的情况下实践。因此，例如，在此每一个例子中，术语“包括”、“基本包括”和“含有”中任何一个可由其它两个中的任何一个替代。已使用的术语和表达可用作描述而非限制的术语，并且不打算在使用这样的术语和表达中排除显示和描述特征的任何等价物或其部分，但是人们认识到各种修改可能处于本发明权利要求的范围之内。因此，人们应理解尽管已通过优选实施方案和任选的特征详细公开本发明，在此公开的改进和概念的变化形式可由本领域技术人员采用，并且认为如同所附的权利要求定义的那样，这样的改进和变化形式处于本发明范围内。
另外，按照Markush基团描述本发明特征或方面，本领域技术人员将意识到本发明也因此根据Marush基团的任何单个成员或亚基团成员来描述。例如，如果将X描述为选自溴、氯和碘，对X为溴的权利要求和对X为溴和氯的权利要求得以充分描述。
其它实施方案处于以下权利要求范围内。
权利要求
1．具有以下化学结构的吡咯取代的2-吲哚满酮 其中R1选自氢、烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、羟基、烷氧基、C-羧基、O-羧基、乙酰基、C-酰氨基、C-硫代酰氨基、磺酰基和三卤代甲磺酰基；R2选自氢、卤代、烷基、环烷基、芳基、杂芳基和杂脂环基。R3、R4、R5和R6独立选自氢、烷基、三卤代烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、亚硫酰基、磺酰基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、三卤代甲亚磺酰氨基、羰基、C-羧基、O-羧基、C-酰氨基、N-酰氨基、氰基、硝基、卤代、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、氨基和-NR11R12；R11和R12独立选自氢、烷基、环烷基、芳基、羰基、乙酰基、磺酰基、三氟甲磺酰基和结合为五-或六-元杂脂环；R2和R4、R4和R5或R4和R5可结合形成六-元芳环，亚甲二氧基或亚乙二氧基；R7选自氢、烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、羰基、乙酰基、C-酰氨基、C-硫代酰氨基、脒基、C-羧基、O-羧基、磺酰基和三卤代甲磺酰基；R8、R9和R10独立选自氢、烷基、三卤代烷基、环烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、亚硫酰基、磺酰基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、羰基、C-羧基、O-羧基、氰基、硝基、卤代、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、氨基和-NR11R12。然而条件是R8、R9或R10中至少一个为具有-(alk1)Z的基团，其中Alk1选自烷基、链烯基或炔基，Z为极性基团。
2．权利要求1的化合物，其中R1、R2和R7为氢。
3．权利要求2的化合物，其中R8、R9或R10中的一个为alk1Z，其中alk1选自未取代的低级烷基、未取代的低级链烯基和未取代的低级炔基；和Z为选自羟基、烷氧基、C-羧基、羰基、硝基、氰基、氨基、铵、-NR11R12、C-酰氨基、S-亚磺酰氨基、亚硫酰基、磺酰基、膦酰基、脲基、脒基、胍基、吗啉代、哌啶基和四唑并的极性基团。
4．权利要求1的化合物，其中R3、R4、R5和R6独立选自氢；卤代；未取代的低级烷基；用一个或多个选自以下基团取代的低级烷基羟基；卤代；用选自以下基团取代的C-羧基氢；或，未取代的低级烷基；氨基；或者，-NR11R12；未取代的低级烷基烷氧基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基烷氧基；未取代的芳氧基；用一个或多个独立选自以下基团取代的芳氧基，包括未取代的低级烷基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基；羟基；未取代的低级烷基烷氧基；卤代；氨基；或，-NR11R12；其中R11和R12独立选自氢和未取代的低级烷基的S-亚磺酰氨基；未取代的芳基；用一个或多个独立选自以下基团取代的芳基卤代；未取代的低级烷基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基；未取代的低级烷基烷氧基；氨基；或，-NR11R12；未取代的杂芳基；用一个或多个独立选自以下基团取代的杂芳基未取代的低级烷基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基；未取代的低级烷基烷氧基；羟基；卤代；氨基；或，-NR11R12；未取代的杂脂环基；用一个或多个独立选自以下基团取代的杂脂环基卤代；羟基；未取代的低级烷基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基；未取代的低级烷基烷氧基；氨基；或，R11R12；未取代的低级烷基O-羧基；其中R11和R12独立选自氢、未取代的低级烷基和未取代的芳基的C-酰氨基；和，其中R11和R12独立选自氢、未取代的低级烷基和未取代的芳基的N-酰氨基。
5．权利要求3的化合物，其中R3、R4、R5和R6选自氢；卤代；未取代的低级烷基；用一个或多个选自以下基团取代的低级烷基羟基；卤代；用选自以下基团取代的C-羧基，包括氢；或，未取代的低级烷基；氨基；或，-NR11R12；未取代的低级烷基烷氧基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基烷氧基；未取代的芳氧基；用一个或多个独立选自以下基团取代的芳氧基，包括未取代的低级烷基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基；羟基；未取代的低级烷基烷氧基；卤代；氨基；或，-NR11R12；S-亚磺酰氨基，其中R11和R12独立选自氢和未取代的低级烷基；未取代的芳基；用一个或多个独立选自以下基团取代的芳基卤代；未取代的低级烷基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基；未取代的低级烷基烷氧基；氨基；或，-NR11R12；未取代的杂芳基；用一个或多个独立选自以下基团取代的杂芳基未取代的低级烷基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基；未取代的低级烷基烷氧基；羟基；卤代；氨基；或，-NR11R12；未取代的杂脂环基；用一个或多个独立选自以下基团取代的杂脂环基卤代；羟基；未取代的低级烷基；用一个或多个卤代基团取代的低级烷基；未取代的低级烷基烷氧基；氨基；或，-NR11R12；未取代的低级烷基O-羧基；C-酰氨基，其中R11和R12独立选自氢、未取代的低级烷基和未取代的芳基；和，N-酰氨基，其中R11和R12独立选自氢、未取代的低级烷基和未取代的芳基。
6．权利要求1的化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7为氢；R8和R10为甲基；和，R9为-(CH2)(CH2)C(=O)OH。
7．药用组合物，包括权利要求6的所述化合物；和，生理学上可接受的载体或赋形剂。
8．权利要求1的化合物，其中R1、R2和R7为氢；R3、R4、R5和R6独立选自氢；羟基；卤代；未取代的低级烷基；用羧酸取代的低级烷基；未取代的低级烷氧基；羧酸；未取代的芳基；用一个或多个未取代的低级烷基烷氧基取代的芳基；或，吗啉代；R8选自氢和未取代的低级烷基；R9为-(CH2)(CH2)C(=O)OH；和R10为未取代的低级烷基。
9．权利要求2的化合物，其中R7选自氢；未取代的低级烷基，和，用选自以下基团取代的低级烷基未取代的环烷基，未取代的芳基，和，用选自羟基、未取代的低级烷基烷氧基和卤代的基团取代的芳基。
10．权利要求2的化合物，其中Z选自C(=O)NR13R14，其中R13和R14独立选自氢，未取代的低级烷基，用选自氨基和-NR11R12的基团取代的低级烷基，未取代的芳基，用一个或多个选自卤代、羟基、未取代的低级烷基烷氧基和三卤代甲基的基团取代的芳基，未取代的杂芳基，未取代的杂脂环基，和，合并的五-元或六-元未取代的杂脂环基，和，-NR11R12；其中，R11和R12独立选自未取代的低级烷基及结合为五-元或六-元未取代的杂脂环。
11．权利要求1的化合物，其中R7选自未取代的低级烷基，用一个或多个选自以下基团取代的低级烷基未取代的环烷基，未取代的芳基，用一个或多个独立选自卤代和未取代的低级烷基烷氧基和未取代的低级烷基羧基烷基的基团取代的芳基，和，Z选自未取代的C-羧基和未取代的低级烷基C-羧基。
12．权利要求1的化合物，其中R3、R4、R5和R6独立选自氢，卤代，未取代的低级烷基，用一个或多个羟基取代的低级烷基，未取代的低级烷氧基，未取代的芳基，用一个或多个未取代的低级烷氧基取代的芳基，和，S(O)2NR11R12，R5为氢R6为-NR11R12，和，R11和R12独立选自氢、未取代的低级烷基和结合为五-元或六-元未取代的杂脂环。
13．用于调控蛋白激酶催化活性的方法，包括使所述蛋白激酶与权利要求1的化合物、盐或前药接触。
14．权利要求13的方法，其中所述蛋白激酶选自受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶和丝氨酸-苏氨酸激酶。
15．药用组合物，包括权利要求1的化合物、盐或前药和生理学上可接受的载体或赋形剂。
16．用于治疗或预防有机体中蛋白激酶相关疾病的方法，包括将治疗有效量的权利要求1的化合物、盐或前药给予所述有机体。
17．权利要求16的方法，包括将治疗有效量的3-[2,4-二甲基-5-(2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸给予所述有机体。
18．权利要求16的方法，其中所述蛋白激酶相关疾病选自受体酪氨酸激酶相关的疾病、非受体酪氨酸激酶相关的疾病和丝氨酸-苏氨酸激酶相关的疾病。
19．权利要求16的方法，其中所述蛋白激酶相关疾病选自EGFR相关的疾病、PDGFR相关的疾病、IGFR相关的疾病和flk相关的疾病。
20．权利要求16的方法，其中所述蛋白激酶相关疾病为选自鳞状细胞癌、星形细胞瘤、卡波济氏肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、头和颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌、泌尿生殖道癌和胃肠癌的癌症。
21．权利要求16的方法，其中所述蛋白激酶相关疾病选自糖尿病、自身免疫性疾病、过度增殖性疾病、再狭窄、纤维变性、牛皮癣、骨关节炎、类风湿性关节炎、血管发生、炎性疾病、免疫性疾病和心血管疾病。
22．权利要求16的方法，其中所述有机体为人。
23．化合物选自3-[5-(5-氯-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(5-氯-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[4-甲基-5-(2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[2,4-二甲基-5-(2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(5-溴-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(5-碘-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[4-甲基-5-(4-甲基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[4-甲基-5-(5-甲基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(5,6-二甲氧基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(6-氯-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[4-(2-羧基乙基)-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-5-甲酸甲酯3-[4-(2-羧基-乙基)-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-5-甲酸3-[4-甲基-5-(2-氧代-5-氨磺酰-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[4-甲基-5-(5-甲基氨磺酰-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-{3-[4-(2-羧基-乙基)-3-甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-5-基}-丙酸3-[5-(5-乙基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(5-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(5-溴-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(5-碘-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[2,4-二甲基-5-(4-甲基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基-甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[2,4-二甲基-5-(5-甲基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(6-羟基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(6-甲氧基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(6-羟基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(6-羟基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3,5-二甲氧基-苄基酯3-{5-[6-(3-甲氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸3-[5-(6-溴-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-{5-[6-(3-甲氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸3-{5-[6-(3-乙氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸3-{5-[6-(3-乙氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸3-[2,4-二甲基-5-(2-氧代-6-苯基-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[4-甲基-5-(2-氧代-6-苯基-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-{5-[6-(4-甲氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸3-{5-[6-(4-甲氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸3-{5-[6-(2-甲氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-4-甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸3-{5-[6-(2-甲氧基-苯基)-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸3-[2,4-二甲基-5-(6-吗啉-4-基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(5-氯-4-甲基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基]-丙酸3-[5-(5-氯-4-甲基-2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-4-甲基-1H-吡咯-3-基}-丙酸3-[2,4-二甲基-5-(2-氧代-1,2-二氢亚吲哚-3-基甲基)-1H-吡咯-3-基]-丙酸，钠盐。
24．化合物选自3-[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-1,3-二氢吲哚满-2-酮5-溴-3-[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-苯基-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-(2-甲氧基苯基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-(3-甲氧基苯基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[3,5-二甲基-4-(3-吗啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-1,3-二氢吲哚满-2-酮5-溴-3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-苯基-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-(2-甲氧基苯基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-(3-甲氧基苯基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-(4-甲氧基苯基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮5-氯-3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-1,3-二氢吲哚满-2-酮6-氯-3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-5-甲氧基-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-6-甲氧基-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-5-甲基-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-4-甲基-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-4-(2-羟基乙基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-5-磺酰胺3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸异丙酰胺3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-5-(吗啉-4-磺酰基)-1,3-二氢吲哚满-2-酮3-[4-(3-二甲基氨基丙基)-3,5-二甲基-1H-吡咯-2-基亚甲基]-2-氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-5-磺酸二甲基酰胺。
全文摘要
本发明涉及新的吡咯取代的2－吲哚满酮化合物和它们的生理学上可接受的盐和前药,它们调控蛋白激酶活性并因此被期待用于预防和治疗与蛋白激酶相关的细胞失调例如癌症。
文档编号A61P29/00GK1311775SQ99809248
公开日2001年9月5日 申请日期1999年5月28日 优先权日1998年5月29日
发明者P·C·唐, L·孙, G·麦马洪 申请人:苏根公司