)的HaCaT细胞株 (HaCaT-hSIRTlp-EGFP 细胞）。
[0086] (2-1. HaCaT细胞中的基因导入）
[0087] 将HaCaT细胞9. OX IO5个接种到（p60mm培养皿中，在含有10% FBS的DMEM培 养基中培养。也同样准备作为对照的细胞。24小时后，将phSIRTlp-EGFP 8yg加入DMEM 培养基300 μ L中混合，向其中加入作为转染试剂的Hilymax (Hilymax，同仁化学）24 μ L，进 一步混合，在室温下鮮育15分钟。然后，将总量添加到HaCaT细胞中。3小时后，更换为含 有10% FBS的DMEM培养基。
[0088] (2-2.药剂选择）
[0089] 自基因导入24小时后，更换为包含G418(和光纯药）750 μ g/mL的含有10% FBS 的DMEM培养基。在显微镜下目视确认作为为对照的无处理HaCaT细胞全部死亡后，在将 G418设为150 μ g/mL的含有10% FBS的DMHM培养基中继续传代培养。
[0090] (2-3.利用流式细胞术测定EGFP荧光强度）
[0091] 通过流式细胞术确认PhSIRTlp-EGFP载体是否可靠地进入了上述传代培养后的 细胞中。将上述细胞和作为对照的无处理HaCaT细胞7. OX IO5个接种到（p60mm培养皿 中。24小时后，剥落细胞并在含有5% FBS的DMEM培养基2mL中很好地悬浮，过尼龙网（共 通理工，日本），以流式细胞仪（EPICS，BeckmanCoulter)进行EGFP荧光强度的测定。分析 软件使用FlowJo (Tree Star，Ashland 0R)，以直方图表示各细胞的EGFP荧光强度。
[0092] (实施例4 =SIRTl增强多酚或类萜的沉默调节蛋白基因 hSIRTl的启动子的增强 效果）
[0093] 将HaCaT-hSIRTlp-EGFP细胞1.7X106细胞（利用流式细胞术测定时）接种入 (p60mm培养皿中，或2. OX IO4细胞/孔（利用IN Cell Analyzer 1000测定时）接种入 96孔板，24小时后，添加溶解在DMSO(和光纯药）中的各种多酚或类萜ΙΟμΜ。需要说明 的是，作为阴性对照，多酚及类萜无处理的情况添加等量的DMS0,且添加白藜芦醇10 μ M作 为阳性对照。自各种多酚或类萜或对照添加24小时后，通过流式细胞术对荧光强度进行测 定。
[0094] 将该结果示于图4。图4是表示各种多酚或类萜添加后的HaCaT-hSIRTlp-EGFP细 胞中的EGFP荧光强度的图表。纵轴表示EGFP荧光强度，数值越高启动子活性越强。在横 轴示出使用的多酚或类萜。在安石榴林、安石榴甙、尿石素 A、特里马素、非瑟酮、咖啡醇（衍 生物）、咖啡豆醇中，在皮肤表皮细胞中也可观察到hSIRTl的表达效果。
[0095](制备例1 :石榴提取物的制备）
[0096] 在市售的干燥石榴粉末（果实及种子，中国产）300g中加入水700mL，在50°C下搅 拌放置24小时，放冷后离心分离，得到提取液900mL。将其提取液注入到填充了 Amberlite XAD4(0rgano公司制）100g的柱中，流通3000mL的水，然后，流通乙醇：水=8:1 (v:v)混合 液1500mL。在减压下浓缩所得到的级分后，在所得到的乙醇-水级分浓缩物中加入纤维素 (旭化成Avicel) 5g作为冻干助剂，进行冻干。这样制备了粉末状石榴提取物。
[0097] (鞣花鞣质量）
[0098] 按照文献（J. Agric. Food Chem.，2009 年，57 (16)，P. 7395)中记载的下述条件，以 HPLC(型号Inertsil 0DS-3, GL Sciences株式会社制）定量上述粉末状石榴提取物的鞣 花鞣质量。
[0099] < HPLC的分析条件>
[0100] 检测器：紫外吸光光度计（380nm)
[0101] 柱：InertsiI 0DS-3 (5 μ m，4. 6 X 250mm) (GL Sciences 株式会社制）
[0102] 柱温：40°C
[0103] 流量：1. OmL/分钟
[0104] 注入量：25 μ L
[0105] 流动相条件：将0. 5%磷酸㈧及乙腈⑶在以下的条件下进行线性渐变：
[0106] A B O分钟 95% 5% 10 分钟 85% 15% 30 分钟 75% 25%
[0107] 35 分钟 95% 5%
[0108] 将所得到的结果示于以下。
[0109] 安石榴林 25%
[0110] 安石榴甙 30%
[0111] 月见草素 B 0. 1%
[0112] (实施例5:片剂的制作）
[0113] 将制备例1的粉末状石榴提取物l〇mg、乳糖250g、玉米淀粉45g及羧甲基纤维素 钙20g放入旋转造粒机，预热混合，喷淋含有羟丙基纤维素 I. 7g的水溶液34g，得到造粒末。 在其中加入羧甲基纤维素钙100g及滑石40g，混合，通过压片机对该混合末进行压片，得到 裸片。（实施例6:饮料的制作）
[0114] 基于下述配方制作饮料。
[0115] 成分 配合比（质量比） 甘油 10.0 制备例1的粉末状石榴提取物 1.0 纤维素 0.1 柠檬酸 0 3 香料 0.1 精制水 余量
[0116] 通过对上述各成分同时进行混合、搅拌，制备了饮料。
[0117] (实施例7 :化妆水的制作）
[0118] 将以下的成分以以下的比例均匀地混合，得到化妆水。
[0119] 成分 配合比（质量比） 甘油 10.0 1，3-丁二醇 6.0 制备例1的粉末状石榴提取物 1.0 柠檬酸 0.1 柠檬酸钠 0.3 聚氧乙烯 1.0 乙醇 8 0 对轻苯甲酸酯 0.1
[0120] 香料 0.1 精制水 余量
[0121] 产业上的可利用性
[0122] 根据本发明，可以简单且大量地提供提高认为参与延寿及抗老化的沉默调节蛋白 基因的活性的功能性材料。本发明的沉默调节蛋白基因活性增强剂为由熟悉的材料得到的 物质，相对于人体的副作用等的担心也预先回避。这样的沉默调节蛋白基因活性增强剂作 为医药品、化妆品及食品领域中的新材料有用。
【主权项】
1. 一种沉默调节蛋白基因活性增强剂，其特征在于： 其含有多酚作为有效成分，该多酚是选自安石槽林、安石槽式、尿石素A、丁香英、特里 马素I及它们的类似物中的至少1种化合物。
2. -种沉默调节蛋白基因活性增强剂，其特征在于： 其含有类萜作为有效成分，该类萜是选自咖啡醇、咖啡豆醇、甘草甜素及它们的类似物 中的至少1种化合物。
3. 如权利要求1所述的沉默调节蛋白基因活性增强剂，其特征在于：以植物或植物提 取物的形态含有所述多酚。
4. 如权利要求3所述的沉默调节蛋白基因活性增强剂，其特征在于：所述植物或植物 提取物为石榴或石榴提取物。
5. 如权利要求2所述的沉默调节蛋白基因活性增强剂，其特征在于：以植物或植物提 取物的形态含有所述类萜。
6. -种含有权利要求1~5中任一项所述的沉默调节蛋白基因活性增强剂的医药组合 物。
7. -种含有权利要求1~5中任一项所述的沉默调节蛋白基因活性增强剂的化妆品组 合物。
8. -种食品组合物，其特征在于： 其含有被分离出来的多酚和/或类萜， 该多酚是选自安石榴林、安石榴甙、尿石素A、丁香英、特里马素I及它们的类似物中的 至少1种化合物， 该类萜是选自咖啡醇、咖啡豆醇、甘草甜素及它们的类似物中的至少1种化合物。
【专利摘要】本发明公开一种沉默调节蛋白基因活性增强剂以及使用其的医药品、化妆品及食品。本发明的沉默调节蛋白基因活性增强剂含有规定的多酚和/或类萜作为有效成分。能够以石榴等植物或植物提取物的形态含有多酚和/或类萜。本发明的沉默调节蛋白基因活性增强剂是由熟悉的材料得到的物质，可预先回避对人体的副作用等的担心。这样的沉默调节蛋白基因活性增强剂作为医药品、化妆品及食品领域中的新材料有用。
【IPC分类】A61K36-18, A61K31-7034, A61K36-899, A61K36-48, A61K8-60, A61K8-97, A23L1-30, A61K8-63, A61Q19-08, A61K31-704, A61K31-58, A61P43-00, A61K31-7048, A61K8-49, A61K36-53, A61K31-352, A61K36-23, A61K36-73
【公开号】CN104703615
【申请号】CN201380047811
【发明人】西田典永, 须山建, 片仓喜范
【申请人】森下仁丹株式会社, 国立大学法人九州大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年9月13日
【公告号】US20150231164, WO2014042261A1