人每 日常规用量计算，以大鼠体重折算每日灌服右归丸生药量5. 2g/kg/d。用右归丸连续灌胃 5周。大鼠末次给药Ih后1 %戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，股动脉取血，血液静置2h后离 心（3000Xg，15min)，取上层血清，分组混匀，所有血清均用0. 22ym的微孔滤膜过滤除菌 后，一80°C保存备用。空白组灌服0. 5%CMC-Na，同法制备空白血清。
[0041] L2实验动物
[0042]SD大鼠，SPF级，由四川大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证 号：Il-13scxk(川）-10-2006。选择8~10周龄健康性成熟大鼠64只，体重（237. 3 ± 15. 8) g，随机分成8组，每组8只。实验大鼠腹腔注射10 %水合氯醛（0. 3~0. 4mL/100g)，75 % 乙醇消毒，下腹部正中切口，逐层进入腹腔，暴露并切除双侧卵巢组织，立即放入备好的PBS 缓冲液中，在解剖显微镜下分离卵巢组织并切成Imm3左右的小块备用。
[0043] 1. 3主要试剂和设备
[0044] PBS、蔗糖、乙二醇为美国Sigma公司产品；TUNEL试剂盒为德国宝灵曼公司产品； 程序降温仪（澳大利亚，CryologicPL);光学显微镜（日本，0LYMPUSCh20);透射电镜（德 国，ZEISSLibra120)。
[0045] 1. 4卵巢组织慢速程序冷冻保存技术
[0046] 采用慢速冷冻-快速融解的方法冷冻保存卵巢组织，将Imm3的卵巢组织块放入 预冷的PBS缓冲夜（1.5mol/L乙二醇，0?lmol/L蔗糖，分别加入5%、10%、15%的右归丸 含药血清和空白血清）中平衡30min;将组织块置于冷冻瓶里放入程序冷冻仪中冷冻；从 0°C开始，以_2°C/min的速度降至-7°C/min，平衡lOmin，植冰；再以-0. 3°C/min速度降 至-40°C/min，然后以-10°C/min速度降至-140°C/min，投入液氮中保存。采用快速融解法 解冻卵巢组织，即将盛有卵巢组织的冷冻瓶从液氮中取出，室温空气中停留lmin，置37°C 的水浴中2~3min，再按浓度梯度培养液置换冷冻保护剂。
[0047] I. 5卵巢组织的组织学特性和超微结构分析
[0048] 采用10%甲醛固定，石蜡包埋，3ym切片，苏木素一伊红（HE)染色，光学显微镜 下观察卵巢组织结构、卵泡形态，计数正常卵泡和形态改变卵泡的比例。卵泡分级按照 Gougeon的分级标准进行分级。卵巢组织超微结构观察采用戊二醛固定，按照电镜标本制备 切片，透射电镜下观察卵母细胞、卵泡细胞、间质腺细胞、卵泡膜细胞及透明带、基底膜细胞 的结构和形态，观察线粒体、内质网等各种细胞器的变化情况。
[0049] 1. 6冻融卵巢组织内卵母细胞DNA损伤情况观察
[0050] 采用细胞凋亡检测方法一TUNEL法来观察卵巢组织中卵母细胞的DNA损伤情况， 石蜡切片，常规脱蜡，实验步骤按照TUNEL试剂盒的说明书操作，切片在光学显微镜下观 察，凋亡卵泡为卵母细胞核呈棕黄色或棕褐色，背景呈紫蓝色。按常规方法进行卵泡计数， 为避免重复计数，以卵母细胞核为标记，计录卵泡数及卵泡凋亡率。
[0051] 1.7统计学分析
[0052] 采用SPSSlI. 0统计软件进行分析，各组率的比较采用X2检验，P<0. 05为差异 有统计学意义。
[0053] 2 结果
[0054] 2. 1冷冻对卵巢组织结构的影响
[0055] 将冷冻后解冻卵巢组织与新鲜卵巢组织相比可以发现，冷冻后解冻会导致各级卵 泡受损情况，这些卵泡与周围间质细胞分离，但原始卵泡受损影响较小，冷冻卵巢组织与新 鲜卵巢组织相比间质细胞排裂紊乱、连接疏松，有裂隙形成。
[0056]2. 2右归丸对冷冻卵巢组织的组织学特性的影响
[0057] 结果如表1所示：
[0058] 表1各组卵巢组织卵泡形态正常率％(n)
[0059]
【主权项】
1. 含有下述重量配比的原料药在制备预防和/或治疗卵巢损伤和/或者卵巢衰退的药 物或者培养液中的用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝 子8-16份、鹿角胶8-16份、杜仲1-16份、肉桂1-9份、当归1-16份、制附子1-16份。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述原料药的重量配比如下：熟地24份、 山茱萸9-12份、山药12份、枸杞子9-12份、菟丝子12份、鹿角胶12份、杜仲12份、肉桂6 份、当归9份、制附子6份。
3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述原料药的重量配比如下：熟地24份、 山茱萸12份、山药12份、枸杞子12份、菟丝子12份、鹿角胶12份、杜仲12份、肉桂6份、 当归9份、制附子6份。
4. 根据权利要求1~3任意一项所述的用途，其特征在于：所述卵巢损伤是冻融引起 的卵巢损伤。
5. -种离体卵巢组织的培养液，其特征在于：它以常用细胞培养基为基础培养基，添 加有2~20% (v/v)的含药血清； 所述含药血清按照如下方法制备： (1) 按照权利要求1~3任意一项所述配比取原料药，制备成为超细粉，以5. Og/kg的 剂量施用于鼠，施用方式为口服给药； (2) 给药30min、60min、90min后，眼底静脉丛取血，分别静置、离心得上清液，混匀，即 为含药血清。
6. 根据权利要求5所述的诱导液，其特征在于：所述常用细胞培养基为a -MEM培养 基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基或M-199培 养基。
7. 根据权利要求5所述的诱导液，其特征在于：所述含药血清的浓度为3~5% (v/v)。
8. 根据权利要求5所述的诱导液，其特征在于：所述诱导液中还添加有10~20% (v/ ￥)的？85、0.5~1.5%的青链霉素和/或50~150叨/1的腿6。
9. 根据权利要求8所述的诱导液，其特征在于：所述FBS的添加量为10% (v/v);青链 霉素的添加量为1% ;HMG的添加量为100IU/L。
10. -种离体卵巢组织的冻存液，其特征在于：它是添加有I. 5mol/L乙二醇、0? lmol/L 蔗糖以及10%~15%的含药血清的PBS溶液；所述含药血清按照如下方法制备： (1) 按照权利要求1~3任意一项所述配比取原料药，制成口服液，按照生药量5. 2g/ kg/d的剂量施用于鼠，施用方式为口服给药，连续施用5周； (2) 股动脉取血，静置、离心得上清液，即为含药血清。
【专利摘要】本发明公开了含有下述重量配比的原料药在制备预防和/或治疗卵巢损伤和/或者卵巢衰退的药物或者培养液中的用途：熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份、杜仲1-16份、肉桂1-9份、当归1-16份、制附子1-16份。本发明右归丸可以有效预防和治疗卵巢组织损伤/衰退，尤其是冻融导致的卵巢组织损伤/衰退的效果确切，可以制备成为预防和治疗卵巢组织损伤/衰退的药物，使得癌症患者的卵巢移植成为可能，应用前景非常优良。
【IPC分类】C12N5-071, A61K35-32, A61K36-8945, A61P15-00
【公开号】CN104800485
【申请号】CN201510038613
【发明人】陆华, 李启佳, 刘志斌, 刘芊辰
【申请人】成都中医药大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年1月26日