脑海马区齿 状回（DG)呈现高表达量；
[0025] 图3为BrdU+成体神经干细胞、神经祖细胞的增殖结果图；图中，敲除miR-17-92 造成小鼠大脑海马区齿状回中成体神经发生显著减少。（A-D)与对照组（Ctrl)相比， miR-17-92条件敲除小鼠（miR-17-92KO)的BrdU+和PH3+成体神经干细胞、神经祖细胞显 著降低。（E)miR-17-92条件敲除小鼠Dcx+新生神经元数量也显著降低（n>3, **:p〈0. 03)。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条 件，例如萨姆布鲁克等分子克隆：实验手册第三版（科学出版社，2002)中所述的条件，或者 按照各制造商所建议的条件。
[0027] 实施例1
[0028] 为筛选在小鼠成年海马区高表达的miRNAs，申请人采用了微阵列（microarray) 分析，并测定了miR-17-92的高表达。申请人提取了 12周龄成年C57/BL6小鼠的海马区 RNA，与事先标记了miR-17、miR-19、miR-92探针的芯片进行了吸附杂交，并测定了相对焚 光强度。结果显示：相当于其他微型RNA，miR-17、miR-19、miR-92呈现了很强的荧光，标示 miR-17-92在成年海马区的高表达。
[0029] 为确定miR-17-92在成年海马区表达形式，申请人采用原位杂交法（insitu hybridization)检测miR-17-92在第12周龄成年小鼠大脑中的表达状态。申请人收取了 12周龄成年C57/BL6小鼠的大脑组织，用4%的多聚甲醛（PFA)固定后，进行冷冻切片，收 集了成年海马区组织切片。利用锁核酸（Lockednucleicacid，LNA)做探针，申请人标记 了miR-17，miR-106，miR-19探针。这些探针与海马区组织切片进行杂交。经过洗脱非特异 性信号后，显色指示出miR-17,miR-106,miR-19的表达状况。申请人发现miR-17-92基因 簇中的miR-17，miR-106，miR-19在成体大脑海马区齿状回（dentategyrus,DG)表达量很 高（图2)。由于成体神经干细胞分布在齿状回，结果表明miR-17-92可能调控海马区的成 体神经发生。
[0030] 实施例2
[0031] 为研宄miR-17-92对成年海马区神经发生的作用，申请人繁育miR-17-92条件性 敲除小鼠（knockout，KO)。在Nestin-CreERtm小鼠和fIoxed的miR-17-92转基因小鼠交 配后，只有在注射他莫昔芬（Tamoxifen)条件下，才能诱导Cre活性，以敲除miR-17-92在 成年大脑海马区的表达。这个条件性敲除小鼠，称作miR-17-92K0(图.3)。
[0032] 在小鼠第五周龄时，对其连续5天注射了Tamoxifen。在小鼠第九周龄时，连续六 天给小鼠注射了BrdU(50mg/kg体重），然后取脑。
[0033] 分析BrdU+成体神经干细胞、神经祖细胞的增殖。与对照组相比，miR-17-92敲除 鼠（KO)海马区齿状回中BrdU阳性细胞数量显著降低（图.3A，B)。有丝分裂M期的标记 物磷酸化组蛋白（PH3)阳性细胞也显著降低（图.3C，D)。新生神经元的标志物双皮质素 (Dcx)阳性细胞也减少（图.3E)。所以，敲除miR-17-92表达引起成体神经干细胞数量减 少，并对海马区齿状回的成体神经发生造成降低。这些结果显示了miR-17-92基因的两个 重要功能：1)当miR-17-92在成年大脑中的表达量减少时，成体神经干细胞、神经祖细胞的 数量也相应降低。这说明miR-17-92基因的用途是促进成体神经干细胞的扩增；2)申请人 还发现，降低miR-17-92基因的表达量，导致新生神经元数量的减少。这说明miR-17-92基 因的另一个用途是增进新生神经元的产生，对神经再生起促进作用。
[0034] 本领域技术人员知晓以下技术术语：成体神经干细胞：在成年大脑中依然有分裂 扩增能力并生成新神经元和其他细胞的干细胞。神经再生：通过神经干细胞生成新的神经 元的生物过程。神经退化性疾病：神经系统中因神经元凋亡而导致的疾病，症状表现为记忆 力和运动协调能力的丧失。微型RNA:不编码蛋白质但在体内存在的小RNA。
[0035] 综上所述，本发明涉及的miR-17-92基因，能够促进神经再生的新基因，对相关领 域的基础研宄和进一步的临床应用具有现实意义；在正常生理条件下，新生神经元是有限 的，一旦发生损伤，神经元发生将大幅度增加，积极参与到修复过程中。动员内源性的神经 干细胞不需要进行手术，可以规避手术带来的创伤风险。但与外源细胞移植不同，如何诱导 这些细胞迀移到需要它们的病灶部位是一个难题。同时，要诱导出机体需要的特异的神经 元类型也是一个挑战。本申请的发明人证实，miR-17-92能够有效促进体内神经干细胞扩 增的新基因，为利用神经干细胞进行神经再生提供了有力的工具。从临床应用的角度，由 于miRNA是小分子，极易体外合成和导入细胞内，操纵体内miRNA表达量具有非常高的可行 性，进而高效地利用miRNA改变基因在神经干细胞中的表达，诱导神经干细胞分化成特异 的细胞，为干细胞替代治疗策略提供一个崭新的调节靶点，推动神经干细胞在未来的临床 应用。
[0036] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种miR-17-92基因簇在制备促进神经细胞增殖药物中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-17-92基因簇包括以下组合中的一 种或多种：miR-17, miR-19, miR-92, miR-106。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miR-17的序列为 caaagugcuuacagugcaggua〇
4. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miR-19的序列为 ugugcaaaucuaugcaaaacuga〇
5. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述miR-92的序列为 agguugggauuugucgcaaugcu 〇
6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经细胞为神经干细胞或神经祖细胞。
7. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：提高miR-17-92基因簇的 表达量后，成体神经细胞的数量会相应提升，进而促进神经细胞的增殖。
8. -种miR-17-92基因簇在制备促进神经再生药物中的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述miR-17-92基因簇包括以下组合中的一 种或多种：miR-17, miR-19, miR-92, miR-106。
10. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：提高miR-17-92基因簇 的表达量后，新生神经元数量增加，进而促进神经再生。
【专利摘要】本发明涉及一种生物技术领域的miR-17-92基因簇促进神经细胞增殖和神经再生的新应用；所述应用具体为：提高miR-17-92基因簇的表达量后，神经细胞的数量会相应提升，进而促进神经细胞的增殖；提高miR-17-92基因簇的表达量后，新生神经元数量增加，进而促进神经再生。本发明涉及的miR-17-92能够有效促进体内神经干细胞扩增，为利用神经干细胞进行神经再生提供了有力的工具；本发明为干细胞替代治疗策略提供一个崭新的调节靶点，推动神经干细胞在未来的临床应用。
【IPC分类】A61K48-00, A61P25-28, A61P25-00
【公开号】CN104800860
【申请号】CN201510173294
【发明人】孙涛
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月13日