-〇_acylated monophosphoryl lipid A) (MPL)(参 见 GB 2220211)，MF59 (Novartis)，AS03 (GlaxoSmithKline)，AS04 (GlaxoSmithKline)，聚 山梨醇酯80(Tween80 ;ICL Americas, Inc.)，咪唑并吡啶化合物（参见国际申请号PCT/ US2007/064857,公布为国际公开号W02007/109812)，咪唑并喹喔啉化合物（参见国际申 请号PCT/US2007/064858,公布为国际公开号W02007/109813)和皂角苷，如QS21 (参见 Kensil 等，in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(在疫苗设计中：亚 基和佐剂方法）（eds. Powell&Newman, Plenum Press, NY, 1995);美国专利号 5, 057, 540)。 在一些实施方式中，佐剂是弗氏佐剂（完全或不完全的）。其他佐剂是水包油乳液（如 藍稀或花生油），任选地联合免疫刺激剂，如单磷酰脂质A (参见Stoute等，N. Engl. J. Med. 336,86-91(1997))。另一种佐剂是 CpG (Bioworld Today, 1998 年 11 月 15 日）。
[0138] 5. 6 用途
[0139] 在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中的感染的方法，包括向所述受试者 施用本文描述的生物缀合物或其组合物。在一种【具体实施方式】中，本文描述了一种用于治 疗感染的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文描述的生物缀合物或其组合物。
[0140] 在另一种实施方式中，本文提供了用于在受试者中诱发免疫应答的方法，包括向 所述受试者施用本文描述的生物缀合物或其组合物。在一种【具体实施方式】中，本文提供了 一种对本文描述的生物缀合物诱发免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的 本文描述的生物缀合物或其组合物。
[0141] 在一种【具体实施方式】中，对其施用生物缀合物或其组合物的受试者受到感染或易 感感染，例如细菌感染。在另一种【具体实施方式】中，对其施用生物缀合物或其组合物的受试 者受到肠道沙门氏菌感染或者易感肠道沙门氏菌的感染。在另一种【具体实施方式】中，对其 施用生物缀合物或其组合物的受试者受到伤寒沙门氏菌感染或易感伤寒沙门氏菌的感染。
[0142] 在另一种实施方式中，本文描述的生物缀合物可以用于产生抗体，该抗体用于例 如诊断和研宄目的，例如，这样的抗体可用于确定施用包含本文描述的生物缀合物的免疫 原性组合物、或用于治疗肠道沙门氏菌感染的任何其他组合物是否导致足以杀灭肠道沙门 氏菌或使其无效的宿主免疫应答（例如，这样的抗体可以用于血清杀菌测定）。
[0143] 5. 7 测定
[0144] 5. 7. 1用于评估生物缀合物诱导免疫应答的能力的测定
[0145] 可以使用本领域技术人员已知的或本文描述的任何方法来评估本文描述的生物 缀合物在能够与肠道沙门氏菌（S.enterica)的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答 的能力。在一些实施方式中，本文描述的生物缀合物在能够与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉 反应的受试者中产生免疫应答的能力可以通过用本文描述的生物缀合物使受试者（例如， 小鼠）或受试者组免疫并且用对照（PBS)使额外的受试者（例如，小鼠）或受试者组免疫 进行评估。这样的受试者可以代表疾病的动物模型，例如，伤寒症的动物模型（参见，例如， Libby等，2010, PNAS USA 107 (35): 15589-15594)。可以随后用毒性的肠道沙门氏菌攻击 所述受试者或受试者组并且可以确定该毒性的肠道沙门氏菌在所述受试者或受试者组中 引起疾病（例如，伤寒症）的能力。本领域技术人员将认识到，如果用对照免疫的受试者或 受试者组在用肠道沙门氏菌攻击后患病（例如，伤寒症）而用本文描述的生物缀合物免疫 的受试者或受试者组没有患病，则该生物缀合物能够在能够与肠道沙门氏菌的Vi多糖交 叉反应的受试者中产生免疫应答。可以通过例如免疫测定（如ELISA)来测试本文描述的 生物缀合物诱导与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的抗血清的能力。
[0146] 5. 7. 2血清杀菌测定
[0147] 可以使用血清杀菌测定（SBA)来评估本文描述的生物缀合物在能够与肠道沙门 氏菌的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答的能力。这样的测定是本领域熟知的并 且简单地包括产生和分离针对关注的靶标（例如，肠道沙门氏菌的Vi多糖）的抗体的步 骤，其中通过向受试者（例如，小鼠）施用激发出这样的抗体的化合物。随后，可以例如通 过以下来评估抗体的杀菌能力：在所述抗体和补充物存在下培养所讨论的细菌（例如，肠 道沙门氏菌），并例如使用标准的微生物学方法测定所述抗体杀灭该细菌和/或使其无效 的能力。
[0148] 6.实施例
[0149] 本实施例证实，能够成功地形成修饰的大肠杆菌0121 0-抗原并且施用包含这样 的抗原的生物缀合物能够在与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的小鼠中产生抗体。
[0150] 6.1材料和方法
[0151] (a)菌株、质粒和培养条件。
[0152] 本实施例中描述的菌株和质粒列于表1中。质粒的构建在下文中描述。将大肠 杆菌株在37°C在LB培养基（每升IOg胰蛋白胨、5g酵母膏和5g NaCl)或LB琼脂（每升 添加了 15g琼脂的LB培养基）中培养。使伤寒沙门氏菌BRD948在37°C在补充了 l%v/ V Aro-mix (在IOml ddH20中的40mg L-苯丙氛酸、40mg L-色氛酸、IOmg 4_氛基苯甲酸和 1〇11^2,3-二羟基苯甲酸）和1%￥八171'-11111(在1〇1111(1(11120中的4〇11^1^-酪氨酸二钠） 的LB培养基中生长。如果适当，该培养基含有四环素（20yg mr1)、壮观霉素（80yg mr1) 或氨苄西林（100 y g mr1)。
[0153] 表1.本研宄中使用的菌株和质粒。
[0156] * 哥德堡大学微生物保藏中心（CultureCollectionUniversityofGStcborg)， 保藏人：瑞典哥德堡E. R. B. Moore教授
[0157] **Coligenetic Stock Center，耶鲁大学，美国康奈提格州纽黑文
[0158] (b) DNA 操作
[0159] 使用 NucleoSpin Plasmid 或 NucleoBond Xtra Maxi Plus 试剂盒 (Macherey-Nagel)分离质粒 DNA。使用 NucleoSpin Tissue 试剂盒（Macherey-Nagel)分 离总染色体DNA。根据制造商说明使用限制酶（Fermentas)、奸碱性磷酸酶（Fermentas)、 T4DNA 连接酶（Fermentas)和 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（Finnzyme)。使用 NucleoSpin Extract II试剂盒（Macherey-Nagel)，纯化PCR和限制片段用于克隆。所有DNA测序通过 Synergene Biotech GmbH (瑞士）完成并且合成的寡核苷酸在Microsynth AG (瑞士）订 购。
[0160] (C)质粒构建
[0161] 质粒1含有合成的寡核苷酸盒，其形成自退火连接入EcoRI-消化的PLAFRl中的 5' -AATTGGCGCGCCCGGGACTAGTCTTGGG(SEQ ID NO. :1)和 5' -AATTCCCAAGACTAGTCCCGGGCGC GCC (SEQ ID NO. : 2) [Friedman, A. M. , Long, S. R. , Brown, S. E. , Buikema, ff. J. , Ausubel, F. M. : Construction of a broad host range cosmid cloning vector and its use in the genetic analysis of Rhizobium mutants (宽宿主范围粘粒克隆载体的构建及其在根瘤菌 突变体的遗传分析中的用途）.Gene 18 (3)，289-296 (1982)]，由此引入独特的AscI和SpeI 单个限制位点。使用引物 5'-AAAGGCGCGCCGCGAAGGTAAAGTCAGCCG(SEQ ID NO. :3)和 5'-AA AACTAGTCAGGAGTGAATTAAGTCAITG(SEQ ID NO. :4)，将大肠杆菌0121 0抗原簇由制备自大肠 杆菌0121 (CCUG 11422)的基因组DNA扩增。将该消化的PCR片段连接到Ascl/Spel消化 的质粒1中，产生质粒2。质粒3通过如下构建：将形成自退火5' -TGAATGAATGAACTAGTTCA ATCACTCA(SEQ ID NO. :5)和 5' -TGAGTGAITGAACTAGITCAITCAITCA(SEQ ID NO. :6)的合成 寡核苷酸盒插入到单个限制位点PmlI中，中断wbqG的开放阅读框。
[0162] (d) LPS 分析
[0163] 收集相当于A_为1的过夜培养物的细胞，再悬浮在100 y 1的根据Laemmli的 Ix 样品缓冲液[Laemmli, U. K.，Favre, M. :Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events( 菌体 T4. I. DNA 包装事件的头部的突变）.J Mol Biol 80 (4)，575-599 (1973)]并在 95 °C 煮 10 分钟。加入蛋白酶 K (Fermentas)至 200 y g/ ml的最终浓度，并将样品在60°C温育1小时。根据制造商说明，使用来自Invitrogen 的12 % BisTris NuPAGE凝胶和MES运行缓冲液，通过SDS-PAGE分离来自蛋白酶 K-消化的全细胞溶解产物的LPS分子物质。通过用银染色使LPS可视化[Tsai, C. M. ,Frasch, C. E. :A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels(用于检测聚酰胺凝胶中的脂多糖的灵敏银染色）.Anal Biochem 119(1)，115-119(1982)]。0抗原的免疫学性质使用标准方法通过蛋白质印迹分析。大肠 杆菌0121 0抗原的结构与痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae)类型70抗原相同，因此 抗-痢疾志贺氏菌类型7血清购自Reagensia AB (瑞典）并以1:100稀释液使用。抗-Vi 多克隆抗体购自Murex Biotech Ltd(英格兰）并以1:100稀释液使用。
[0164] (e) ^^一异戊二烯焦磷酸（Und-PP)-连接的0抗原聚糖的分析
[0165] 0抗原聚糖在大肠杆菌菌株SCM6中分析，该菌株在多个多糖基因簇中含有染色体 缺失。〇多糖通过用编码〇抗原簇的质粒和WecA表达质粒（质粒4)转化SCM6细胞而表 达。用空质粒转化的SCM6用作阴性对照以鉴别0抗原特异信号。菌株在摇瓶中培养过夜。 收获相当于A_为400的细胞，用0. 9% NaCl洗涤一次，并冻干。通过重复的多轮涡旋和冰 上温育10分钟，用95%甲醇（MeOH)从干燥的细胞中提取脂质。通过添加CldH 2O将该悬浮液 转换成85% MeOH并在规则涡旋的同时再温育10分钟。在离心后，收集上清并且提取物在 N2下干燥。将干燥的脂质溶解在含有IOmM磷酸四丁铵（TBAP)的1:1甲醇/水（M/W)中并 经过 C18SepPak柱（Waters Corp.，Milford, MA)。该柱用 10ml MeOH调节，接着用以 1:1M/W 的IOmllOmM TBAP调节。在上样后，用1:1M/W的IOml IOmM TBAP洗涤该柱并用5ml MeOH 接着用5ml 10:10:3氯仿/甲醇/水（C/M/W)洗脱。合并的洗脱流分在队下干燥。
[0166]根据 Glover 等[Glover, K. J.，Weerapana，E.，Imperiali，B. : In vitro assembly of the undecaprenyIpyrophosphate-1 inked heptasaccharide for prokaryotic N-Iinked glycosylation (用于原核N-连接的糖基化的^^一异戊二稀焦磷酸-连接的七 糖的体外组装）.proc Natl Acad Sci U S A 102(40)，14255-14259(2005)]，通过将在2ml IM三氟乙酸（TFA)中的干燥样品溶解在50%正丙醇中并加热至50°C达15分钟来水解脂质 样品。水解的样品在N 2下干燥，溶解在4ml 3:48:47C/M/W中并经过C 18S印Pak柱（Waters Corp. ,Milford, MA)以从水解的聚糖分离脂质。该柱用10ml MeOH调节，接着用IOml 3:48:47C/M/W平衡。将样品上样至柱并收集流出物（flow-through)。用4ml 3:48:47C/M/ W洗涤柱并且利用SpeedVac干燥合并的流出流分。
[0167]根据 Bigge 等[131886，]\〇.，？&七61，1'.?.，131'11。6，]\六.，6〇111(1;[叫，？. N. , Charles, S. M. , Parekh, R. B. :Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and anthranilic acid(聚糖使用 2_ 氨基 苯甲酰胺和邻氨基苯甲酸的非选择性和有效焚光标记）.Analytical biochemistry 230 (2)，229-238 (1995)]，用2-氨基苯甲酰胺（2AB)标记干燥的样品。使用如在 Merry 等[Merry, A. H.，Neville, D. C.，Royle，L.，Matthews, B.，Harvey, D. J.，Dwek，R. A. , Rudd, P. M. : Recovery of intact 2-aminobenzamide-labeled 0-glycans released from glycoproteins by hydrazinolysis (通过肼解释放自糖蛋白的完整2-氨基苯甲 酰胺-标记的 0_ 聚糖的回收）?Analytical biochemistry304 (1),91-99 (2002)]中描 述的纸片法（paper disk method)，进行聚糖清理。根据 Royle 等[1?0716，]^.，]\&11:1：11，1'. S. , Hart, E. , Langridge, J. I. , Merry, A. H. , Murphy, N. , Harvey, D. J. , Dwek, R. A. , Rudd, P. M. :An analytical and structural database provides a strategy for sequencing 〇-glycans from microgram quantities of glycoproteins (分析和结构数据库提 供用于对来自微克量的糖蛋白的〇-聚糖测序的策略）.Analytical biochemistry 304 (I)，70-90 (2002)]，但改变为三溶剂系统，使用GlycoS印N正相柱，通过HPLC进行2-AB 标记的聚糖的分离。溶剂A:在80%乙腈中的IOmM甲酸铵pH 4.4。溶剂B :在40%乙腈中 的30mM甲酸铵pH 4.4。溶剂(：：0.5%甲酸。柱温度为30°〇并且248-标记的聚糖通过荧 光检测（人ex = 330nm,人em = 420nm)。梯度条件：在160分钟内100 % A至100 % B的线 性梯度，流速为0. 4ml HiirT1，接着2分钟100% B至100% C，在2分钟内恢复至100% A并 以100% A在Iml HiirT1流速运行15分钟，然后恢复至0. 4ml min 4达5分钟。将样品注入 到 CldH2O 中。
[0168] 为了鉴别0抗原特异性聚糖，从获自含有0抗原簇的细胞的痕迹减去来自带有空 白质粒对照的细胞的2AB聚糖分布图。收集0抗原特异性峰并且2AB聚糖在MALDI SYNAPT HDMS Q-TOF系统（Waters Corp.，Milford, MA)上进行分