% -12 % Bis-Tris PAG (Bio Rad)上，且用Bio Rad trans-Mot翁涡轮系统使用PVDF膜来进行墨点法。在4°C 下，用针对以下蛋白质的抗体培育膜隔夜：IGF-lRi3 (编号3027,细胞信号传导；1:1000)、 P-S473AKT (编号4060,细胞信号传导；1:2000)、AKT (编号9272,细胞信号传导；1:1000)、 PTEN(编号 9559,细胞信号传导；1:1000)、AR(N-20,编号 sc-816, Santa Cruz ;1:200)及 GAPDH(编号7298,细胞信号传导；1:1000)(其充当内参考物）。使用以下抗体来分析增 殖及细胞凋亡的细胞周期调控因子及标记：p21Wafl/Cipl(12Dl ;#2947,细胞信号传导； 1:1000)、CDK2(78B2 ;#2546,细胞信号传导；1:1000)、细胞周期调节蛋白 E(C-19 ;sc-198， Santa Cruz ;1:1000)、PCNA (编号 2586,细胞信号传导；1:2000)及 PARP (编号 9542,细胞 信号传导；1:1〇〇〇)。
[0094] 在TBS-0. 5% Tween20(TBS_T)中的5% BSA或5%脱脂奶粉中制备抗体稀释液。 在TBS-T中洗涤之后，用多克隆HRP-结合山羊抗家兔二级抗体（DAK0,编号P0448)培育 膜1小时，且在TBS-T中进一步洗涤之后，借助于ECL/超ECL(GE Healthcare)及暴露在 ImageQuant LAS4000上来检测抗体反应性。为检测总蛋白质的量，将用抗磷酸化抗体培育 的膜在恢复型西方墨点汽提缓冲剂（Restore Western Blot Stripping Buffer，Thermo， 编号21059)中汽提15-20分钟，阻断，且用针对总蛋白质的抗体培育，随后如上文所述对膜 进行加工。
[0095] 使用流动式细胞测定法的细胞周期分析
[0096] 用1 μΜ IGF mAb_l及10 μΜ MDV-3100以及两种药物的组合处理4X IO5个VCaP 细胞，且在6孔培养板中在37°C下培育24小时、48小时及72小时。随后，将上清液转移至 FACS管，用胰蛋白酶分离黏附细胞，且收集在各别FACS管中。在离心之后，弃去培养基，且 将细胞集结块在4°C的冰冷70%乙醇中固定最少2小时。在完全移除乙醇之后，在低渗缓 冲溶液（〇· 1 %柠檬酸钠，〇· 1 % (v/v) triton X-100,100 μ g/ml 无 DNA 酶的 RNA 酶 A)中用 碘化丙啶（10 μ g/ml ;Sigma ;P4864-10mL)染色固定细胞，且在暗处在室温下培育30分钟。 使用Becton Dickinson FACS Canto II流式细胞仪来分析细胞，且用FACS Diva软件分析 数据。
[0097] 胸苷并入分析
[0098] 用1 μΜ IGF mAb_l及10 μΜ MDV-3100以及两种药物的组合来处理VCaP细胞， 且在平底96孔培养板中，在每孔5Χ IO4个细胞的密度下，在无 R1881存在的情况下依一 式三份培育96小时。在培育最后24小时，添加 3Η-胸苷（0. 4yCi/^L;PerkinElmer， NET355001MC)。随后，冷冻培养板，且在-20°C下培育24小时。为了采集，解冻培养板，且向 各孔中添加 40 μ L胰蛋白酶以分离细胞片段。将悬浮液转移至过滤培养板上。随后用蒸馏 水洗涤培养板三次，且在60°C下干燥3小时。每孔添加 25 μ L Microscint，且经由使用液 体闪烁计数器（1450Microbeta Wallac Trilux，Perkin-Elmer)测量胸苷并入量（CPM ;每 分钟计数）来测定增殖速率。
[0099] 细胞倍增时间的分析
[0100] 将3X IO5个细胞/孔VCaP细胞接种于每孔2mL细胞培养基中。在接种后24小 时，移除细胞培养基且换成不含R1881的DMEM+10% FCS。在更换培养基之后24小时，采集 经过预处理的孔且用BeckmanCoulterTMVi-CELLXR2.03计数，且向其余细胞中添加10μM MDV-3100。每24小时四次，在各时间点测定3个孔中的VCaP细胞数。自这些一式三份的 数值计算平均值。使用以下公式测定传代时间：
[0101]
[0102] NO = TO时的细胞计数
[0103] N =在培养之后的细胞计数
[0104] 半胱天冬酶3 (caspase-3)活性的评估
[0105] 为获得在用不同浓度的MDV-3100、IGF mAb_l及两种药物的组合处理后经历半胱 天冬酶-3/7介导的细胞凋亡的细胞的活细胞影像，使用CellPlayer?96孔动力学半胱天冬 酶-3/7 试剂（Essen BioScience ;#4440)。接种 50000 个 VCaP 细胞 /100 μ 1/ 孔，且次日 用各别浓度的两种药物在生长培养基中在无 R1881存在的情况下处理。将半胱天冬酶-3/7 试剂稀释至每孔100 μ 1生长培养基中5 μΜ的最终浓度，且添加至培养基中。将微板盘内 的培养板置于IncUCyte TM2011A中，且使用相差及荧光通道每4小时获取每孔3个影像，持 续7天。
[0106] 实施例1
[0107] IGF及AR信号传导阻断对前列腺癌细胞增殖的抑制效果
[0108] 为测试AR及IGF-1/2抑制的组合的抗增殖效果，在2D细胞增殖分析中，用AR拮抗 剂MDV-3100及针对IGF配位体（IGF mAb_l及IGF mAb_2)的完全人类单克隆抗体以单一 药物形式或以组合形式处理10种不同前列腺癌细胞株（Bob、C4-2、C-4-2B、DUCaP、MDA PCa 2b、P4E6、PC-3、Shmac 4、Shmac 5、VCaP)(表 1)。测试细胞株中的三种（VCaP 及 DUCaP (两 种细胞株皆来源于同一前列腺癌患者的不同癌转移位置）以及MDA PCa 2b)对单独的AR 及IGF信号传导抑制皆显示单一药物抗增殖性反应，及在结合时显示增强的效果（图1)。
[0109] 实施例2
[0110] IGF信号传导及雄激素合成阻断对前列腺癌细胞增殖的抑制效果
[0111] 作为测试雄激素及IGF信号传导抑制的组合潜力的第二种方法，用乙酸阿比特龙 (其选择性抑制CYP17A且因此抑制从头合成雄激素）单独及与IGF配位体中和单克隆抗体 (IGF mAb_l及IGF mAb_2)组合处理8种不同前列腺癌细胞株（22Rvl、BM 1604、DU-145、 DUCaP、LNCaP、MDA PCa 2b、PC-3、VCaP)。来自这些分析的结果亦鉴别出 VCaP、MDA PCa 2b 及DUCaP细胞为对单一药物两者及组合处理起反应的仅有的细胞株。然而，用乙酸阿比特 龙处理意味肿瘤细胞针对乙酸阿比特龙产生的自分泌雄激素显示抗增殖性效果。此可能限 制对乙酸阿比特龙处理敏感的细胞数。对MDA PCa 2b及DUCaP细胞的VCaP及2D分析的 2D及3D增殖分析的结果显示于图2中。这些数据表明乙酸阿比特龙对细胞增殖的单一药 物效果可经由与抗体中和IGF配位体组合而增强。
[0112] 实施例3
[0113] 雄激素受体及IGF-IR的存在以及PTEN及wt PIK3CA的表达表征前列腺癌细胞对 雄激素及IGF信号传导抑制剂的组合敏感
[0114] 图3显示在VCaP、MDA PCa 2b及DUCaP细胞株中的信号传导蛋白质表达，其与不 敏感细胞株PC-3相比，对AR及IGF信号传导抑制敏感。用MDV-3100及IGF mAb_l以单一 药物形式或以组合形式处理细胞24小时，且比较蛋白质溶胞物与未处理对照组的IGF-1R、 AR、PTEN及AKT的蛋白质表达以及AKT-Ser473的磷酸化。反应性细胞株表达wt AR、IGF-1R 及PTEN。这些特征不存在于PC-3或对单一药物处理或两种药物的组合中的任一者不显示 抗增殖性反应的其他测试细胞株中（表1)。
[0115] 这些结果表明在雄激素受体、IGF-1R，及PTEN(及wt PIK3CA)的表达的存在下，雄 激素与IGF信号传导抑制剂的组合使阻断活体外前列腺癌细胞增殖的功效增加。
[0116] 实施例4
[0117] 在MDV-3100及IGF mAb_l的组合处理后延长的AKT磷酸化抑制
[0118] 经由西方墨点法自处理4小时直至120小时分析MDV-3100及IGF配位体mAb (IGF mAb_l)以单一药物形式及以组合处理形式对抑制AKT磷酸化的效果。两种药物的组合使 AKT磷酸化的抑制比单独抗体处理更完全且持续时间更长（图4)。
[0119] 实施例5
[0120] IGF mAb_l及MDV-3100的组合处理产生对VCaP细胞中的细胞凋亡诱导的协同效 应
[0121] 为支持图1中所示的数据，来自图5中所示的氚化胸苷并入分析的结果展示 MDV-3100及IGF mAb_l两者单独均对细胞增殖具有抑制效果（约50% )，然而，两种药物 的组合有效得多。如由相差显微法（图6A)、半胱天冬酶3活性（图7)、基于FACS的细胞 周期分析（图8)及PARP分裂（图9)所评估，用IGF mAb_l单独处理VCaP细胞导致细胞 凋亡适度增加。相反，用MDV-3100单独处理后的细胞数减少（图6A)归因于细胞倍增时间 延长（图6B)。MDV-3100不诱导半胱天冬酶3活性（图7)、sub-Gl细胞凋亡细胞群体（图 8)或PARP分裂（图9)。然而，当IGF mAb_l及MDV-3100组合时，除sub-Gl细胞凋亡细胞 群体（图8)及裂解PARP(图9)增强之外，还观察到对半胱天冬酶3活性的协同效应（图 7)。
[0122] 实施例6 :IGF mAb_l与恩杂鲁胺组合的提议研究
[0123] 介绍
[0124] 此处所提议的研究调查与单独给予恩杂鲁胺相比，IGF mAb_l与恩杂鲁胺组合在 CRPC患者中的安全性及抗肿瘤活性。
[0125] 将进行此随机开放标签研究以探索IGF mAb_l及恩杂鲁胺的组合（组A)与恩杂 鲁胺（组B)相比的抗肿瘤活性及安全概况。除在随机试验开始之前的任何安全性问题之 外，进行耐受性及安全性阶段Ib以测定最大耐受剂量（MTD)及/或推荐的阶段II剂量。
[0126] 在28天治疗周期中，将经由在各治疗周期开始时进行一小时静脉内输注来每周 给予IGF mAb_l。将在各治疗周期期间经由连续经口给药来每日给予恩杂鲁胺。
[0127] 背景
[0128] IGF mAb_l为IgGl同型的完全人类单克隆抗体（HumAb)。该抗体以高亲和力结合 至IGF-I及IGF-2,且有效中和由两种蛋白质触发的增殖性及促存活性细胞信号传导。
[0129] 恩杂鲁胺为雄激素受体拮抗剂，其对雄激素受体信号传导路径中的不同步骤起作 用。化学名称为4-{3-[4-氰基-3-(三氟甲基）苯基]-5, 5-二甲基-4-氧代-2-硫酮咪 唑烷-1-基}-2_氟-N-甲基苯甲酰胺。分子量为464. 44且分子式为C21H16F4N4O2S。指定 恩杂鲁胺用于治疗患有转移性对去势疗法有抗性的前列腺癌（CRPC)的患者。
[0130] 给予
[0131] 在28天治疗周期中，将经由在各治疗周期开始时进行一小时静脉内输注来每周 给予IGF mAb_l。将在各治疗周期期间经由连续经口给药来每日给予恩杂鲁胺。
[0132] 试验群体的选择
[0133] 在研究中可募集总共高达约140名患者。约15-18名患者将进入研究的部分I耐 受性及安全性阶段，以确保组合疗法的安全性及确定部分II的推荐剂量。在研究部分II 中，120名患者将随机分入两个研究组之一，各组随机分入60名患者（组A = 60,组B = 60) 〇
[0134] 将在3个或更多个中心进行研究部分I。将在全球10个或更多个中心进行研究部 分IIo
[0135] 研究中包括的所有患者（亦即已给出知情同意书）的记录保留在研究地点的ISF， 不管其是否已用研究性药物治疗。
[0136] 进入研究的主要诊断
[0137] 待包括于此研究中的患者必须已经诊断且在组织学或细胞学上确认为转移性 CRPC，且已接受一个系列的多西紫杉醇（docetaxol)治疗且在此之后有进展。患者在任何 情况下可能接受或未接受预先的阿比特龙或卡巴他赛治疗及可能在该治疗中失败。
[0138] 纳入准则
[0139] 1.患者已在组织学或细胞学上确认前列腺癌。
[0140] 2.年龄彡18岁的男性患者。
[0141] 3.具有转移性前列腺癌的放射照相证据（阶段Ml或D2)的患者。可经由放射性 核种骨扫描、CT扫描或MRI在研究治疗开始28天内评估远程癌转移。
[0142] 4.在接受多西紫杉醇同时或在完成基于多西紫杉醇的化学疗法120天内出现疾 病发展（生物化学、临床或放射照相）且在研究者的意见中不太可能再自额外基于多西紫 杉醇的疗法得到显著益处，或对使用此药物的疗法不耐受的患者。
[0143] 5.患者必须具有定义为以下中至少一者的进行性疾病的证据：
[0144] a.进行性可测量疾病：使用常规实体瘤标准RECIST 1. 1。
[0145] b.骨扫描进展：在骨扫描中至少两个新病灶。
[0146] c.增加 PSA :间隔至少1周采集的至少两个连续上升PSA值超过参考值（PSA#1)。 第三PSA