冰袋、培养皿、70%酒精及棉球、离心管、12 孔板（已包被）、胰酶、HBSS液、DNA酶、生长培养基、维持培养基。
[0089] 试验操作：取出怀孕17天的孕鼠子宫，逐个分离胚胎。取出胎鼠的脑皮层，将其 放入HBSS中并清洗几次。加入酶消化处理后弃去上清。加入生长培养基。倾斜培养皿，用 ImL移液枪缓慢吹打，静止后取上层单个悬浮细胞转移至离心管，重复上述操作三次。
[0090] (2)预试验：A0 42致神经元损伤的毒性浓度试验
[0091] 在神经元培养第6天，将细胞分成6组，AP42浓度分别为0、10、20、40、80、 160ymol/L，每组均加入AP42单体寡聚体混合物（H4)，作用时间均为24个小时，并设置一 个复孔。一次试验使用12个细胞培养孔，试验重复1次，试验分组如表1所示。
[0092] 表1造模的浓度分组表（ymol/L)
[0093]
[0094] 根据试验结果，利用WST-8检测细胞活性，筛选神经元成活率30 % -60 %的AP42 浓度作为正式造模浓度，测定JKF-027的神经保护活性。
[0095] (3)化合物I的神经保护活性测定
[0096] 加样：由细胞存活率能够看到，当高于80ymol/L浓度时，由于造模药浓度太高相 互聚集形成胶状物质，影响蛋白之间交互作用，导致寡聚体聚合效果下降，高浓度的AP42 细胞毒性效果下降。而低于10ymol/L后造模药浓度较低，在相同聚合时间内寡聚体聚合 效率较低，细胞毒性下降。10ym〇l/L-80ymol/L的浓度范围的细胞存活率都能达到预先 设定的要求，由于在人体内AP42含量非常低，因此我们选择10ymol/L造模药浓度来构建 细胞损伤模型。在神经元培养第6天加入相同浓度的AI342以及不同浓度的不同受试药物 培养24h，用WST-8检测细胞活性。并设置1个复孔及2个阴性对照孔和2个正常对照孔。 试验重复2次。试验分组如表2所示。
[0097] 表2药物的浓度分组表（ymol/L)
[0098]
[0099] (4)用WST-8检测细胞活性
[0100] 向每孔中加入相应量的WST-8溶液。
[0101] 将培养板在培养箱内孵育2-4小时。
[0102] 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0103] 4)细胞活性检测
[0104] 细胞活力*(% ) = [A(加药）_A(空白）]/[A(未加药）-A(空白）]X100%
[0105]A(加药）：具有细胞、WST溶液和药物溶液的孔的吸光度
[0106]A(空白）：具有培养基和WST溶液而没有细胞的孔的吸光度
[0107]A(未加药）：具有细胞、WST溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
[0108] *细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力
[0109] 5)试验结果
[0110] 第1次独立试验结果见表3和图1 ;第2次独立试验结果见表4和图2 ;第3次 独立试验结果见表5和图3 ;三次独立试验结果平均值见表6和图4。从试验结果来看，三 次试验具有相当好的重复性，结果更加具有说服力。横坐标代表不同的给药浓度，1代表 0? 001yM;2 代表 0? 01ymol/L;3 代表 0?Iymol/L;4 代表I. 0ymol/L;5 代表 10ymol/L; 6代表lOOymol/L;7代表1000ymol/L。不同浓度的不同受试药物抗Af3 42蛋白毒性曲 线呈现先上升后下降的趋势，且都有一个有效剂量区间。相比模型组，JKF-027最佳抗毒浓 度范围为0. 1-10ymol/L。相比于JKF-027,化合物I抗毒有效浓度范围广，多组有效浓度 之间抗毒作用与造模组相比都具有差异显著性，有效浓度之间不存在明显的差异，在浓度 0? 01-1000ymol/L之间都具有明显抗毒作用。
[0111] 从3次重复试验结果来看，3次检测数值规律基本一致，药物细胞试验的趋 势都呈现很正常的峰值曲线，两种受试药品均有效。JKF-027的最佳抗毒浓度范围为 0. 1-lOymol/L。相比于JKF-027,化合物I的抗毒作用浓度范围广，多组有效浓度之间抗毒 作用都不存在明显的差异，在浓度〇. 01-1000ymol/L范围内抗毒作用相比于模型组都具 有明显差异，因此抗阿尔兹海默症作用效果较JKF-027要好很多。
[0112] 表3第1次独立试验存活率数据
[0113]
【主权项】
1. Src蛋白抑制剂在制备下述药物中的应用： (1) 治疗和/或预防阿尔茨海默病或老年痴呆症； (2) 治疗和/或预防神经系统退行性疾病； (3) 改善认知功能障碍或学习记忆能力减退； (4) 抑制A抑制忆细胞毒性； (5) 治疗和/或预防血管性痴呆或血管性认知障碍； (6) 治疗和/或预防胆碱能神经元退行性病变。2. 权利要求1所述的应用，所述的Src蛋白抑制剂为Src/Abl双效抑制剂。3. 权利要求1所述的应用，所述的Src蛋白抑制剂选自达沙替尼（dasatinib)或其药 学上可接受的盐、伯舒替尼（bosutinib)或其药学上可接受的盐。4. 式I所示化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或盐的溶剂化物、酯或醚、前体或 代谢物在制备下述药物中的应用：(1) 治疗和/或预防阿尔茨海默病或老年痴呆症； (2) 治疗和/或预防神经系统退行性疾病； (3) 改善认知功能障碍或学习记忆能力减退； (4) 抑制A抑制忆细胞毒性； (5) 治疗和/或预防防血管性痴呆或血管性认知障碍； (6) 治疗和/或预防胆碱能神经元退行性病变。5. 权利要求4所述的应用，所述的式I所示化合物为游离碱形式的式I化合物，或其可 药用盐。6. 权利要求4所述的应用，所述的药学上可接受的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷 酸盐、硝酸盐、醋酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、乙醇酸盐、硬脂酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸 盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、双羟萘酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、苯基马来酸盐、谷氨酸 盐、安息香酸盐、水杨酸盐、富马酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、草酸盐和羟乙磺酸盐。7. 权利要求4所述的应用，所述的溶剂化物或盐的溶剂化物是指式I所示化合物的水 合物或式I所示化合物的盐的水合物。8. 权利要求4所述的应用，所述的药物包含如式I所示化合物或其药学上可接受的 盐、溶剂化物或盐的溶剂化物、酯或醚、前体或代谢物以及一种或多种药学上可接受的添加 剂。9. 权利要求4所述的应用，所述的药物为口服制剂、肌内、腹膜内、静脉内、ICV、脑池内 注射或者输注制剂、皮下注射或者植入制剂、通过吸入喷雾剂、经鼻、阴道、直肠、舌下或者 局部给药制剂。10. 权利要求4所述的应用，所述的药物中式I所示化合物或其药学上可接受的盐、溶 剂化物或盐的溶剂化物、酯或醚、前体或代谢物按质量百分比含量为〇. 1-99. 9%，优选的为 1-90 %，更优选的为5-80 %，最优选的为10-70 %。
【专利摘要】本发明提供了Src蛋白抑制剂N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(3-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基氨基}-5-噻唑甲酰胺(式I)在制备预防和/或治疗阿尔兹海默病药物中的应用，利用原代分离的胎鼠大脑皮层神经元，Aβ42寡聚体和受试药品作用24h，检测不同浓度式Ⅰ化合物体外抗Aβ42寡聚体毒性药效，结果表明式Ⅰ化合物的有效浓度范围宽，且在有效浓度范围内的细胞存活率高。
【IPC分类】A61K31/506, A61K31/496, A61P25/28
【公开号】CN105030776
【申请号】CN201510355573
【发明人】冯泽旺, 汪进良, 刘岩, 赵宣
【申请人】北京键凯科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月24日