新型靶向纳米粒子及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及荷载小片段发夹样结构DNA分子的新型靶向纳米粒子及其构建与应用，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002]放射治疗是利用一种或多种电离辐射对恶性肿瘤或一些良性病变进行治疗，而对周围正常组织的损伤很小，目前已成为治疗恶性肿瘤的主要手段。Bergonie及Tribondean于1906年提出了关于放射敏感性的定律。放射敏感性是指放射效应，肿瘤放射的敏感性主要取决于它们的固有敏感性、组织来源、分化程度、大体类型、贫血、局部合并感染等。按照放射治疗肿瘤的效应可以把不同的肿瘤分为放射敏感、放射中等敏感及放射抵抗的肿瘤。对于放射抵抗的肿瘤，以往多采取姑息态度或拒绝治疗。因此，利用各种辅助手段降低肿瘤的放射抵抗，提高其放射敏感性，同时尽可能减轻或避免正常组织的辐射损伤，已经成为放射治疗学的研究热点。随着对肿瘤分子生物学研究的深入，放射增敏剂的概念从传统的乏氧细胞增敏剂扩展为一个涵盖多方面的复杂领域，包括细胞微环境、DNA损伤、细胞周期调控等。
[0003]近年来，法国国家放射学院居里研究所Dutreix报道了一种新型放射增敏剂Dbait0 Dbait是一段具有发夹样结构的双链DNA分子，小到只有几十个碱基。目前常用的放射增敏剂的作用机制为抑制DNA损伤修复通路中的单一靶点，而Dbait分子具有独特的作用机制，Dbait分子能够靶向性抑制DNA损伤的主要修复通路之一一一非同源末端连接修复整个途径中修复焦点的形成，通过提高肿瘤细胞亚致死性损伤来提高肿瘤对放射的敏感性。Dbait分子的单纯应用无肿瘤抑制作用，只有与引起DNA损伤的放射、化疗药物等治疗方式联合才能产生增敏作用。如何靶向性、高效地转导Dbait分子到肿瘤细胞内，并实现其放射增敏作用是当前研究的难点。
[0004]利用载体将外源基因准确、高效、靶向地导入宿主细胞内，是肿瘤基因治疗的关键技术。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为基因载体。质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核苷酸(DNA)分子。质粒载体构建成功后，借助转染技术将其导入靶细胞内，其表达受质粒大小、转入质粒的量、细胞类型等条件的影响，常规用于基因工程的质粒长度大多为数千碱基对(bp)以上。然而，目前对于如何靶向性、高效地将小片段DNA分子(长度<50bp)转染导入宿主细胞的研究尚不透彻。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的不足之处，本发明提供一种新型靶向纳米粒子及其制备方法和用途，使用叶酸靶向、生物可降解的正电子聚合物载体PE1-CyD-FA (Hl)，将小片段发夹样结构的双链DNA分子Dbait包装成纳米粒子Hl/Dbait，从而有效实现其放疗增敏作用。该纳米粒子具有低细胞毒性、尚转染效率、尚稳定性等优点，且制备方便。
[0006]本发明是通过如下技术方案实现的:一种新型革El向纳米粒子，所述纳米粒子由叶酸靶向、生物可降解的正电子聚合物载体PE1-CyD-FA(Hl)荷载小片段发夹样结构的双链DNA分子构成。所述小片段发夹样结构的双链DNA分子<50bp。
[0007]进一步，所述纳米粒子的粒径为100?200纳米，Zeta电位为1mV?20mV。
[0008]所述的新型靶向纳米粒子的制备方法，包括以下步骤:
[0009](I)取正电子聚合物载体PE1-CyD-FA (Hl)溶于双蒸水中，得溶液I，室温、避光静置5分钟；
[0010](2)取小片段发夹样结构的双链DNA分子Dbait溶于双蒸水中，得溶液2，室温静置5分钟；
[0011 ] (3)避光、漩涡振荡下将溶液I滴入溶液2中，继续漩涡振荡15秒，使溶液I与溶液2充分混匀，避光、室温静置20分钟后得到新型靶向纳米粒子Hl/Dbait，即可用于后续相关实验。
[0012]所述的新型靶向纳米粒子用于肿瘤放射治疗的用途。
[0013]进一步，所述的肿瘤是前列腺癌或结直肠癌或肝癌或肺癌或黑色素瘤或乳腺癌或卵巢癌或胰腺癌或食管癌或胃癌或子宫癌或喉癌或甲状腺癌。
[0014]本发明的有益效果是:本发明提供一种新型靶向纳米粒子的构建及其在肿瘤放射治疗中的应用，经实验验证，该靶向纳米粒子具有较高的转染效率、较高的稳定性、较低的细胞毒性，能够显著提高肿瘤细胞的放射敏感性，且有效地抑制荷瘤鼠的肿瘤生长、延长荷瘤鼠的生存时间，在肿瘤治疗中具有显著效果。
【附图说明】
[0015]下面根据附图和实施例对本发明进一步说明。
[0016]图1.1.粒度/Zeta电位测定仪检测新型靶向纳米粒子的粒径检测图。
[0017]图1.2.粒度/Zeta电位测定仪检测新型靶向纳米粒子的粒径结果统计图。
[0018]图1.3.粒度/Zeta电位测定仪检测新型革El向纳米粒子的Zeta电位结果统计图。
[0019]图2.琼脂糖凝胶电泳检测新型靶向纳米粒子的稳定性与包裹率结果图。
[0020]图3.荧光显微镜下观察新型靶向纳米粒子在前列腺癌细胞株PC3中的转染效率结果图。
[0021]图4.MTT法检测的新型靶向纳米粒子的细胞毒性结果图。
[0022]图5.1.克隆形成实验检测新型靶向纳米粒子对前列腺癌细胞株PC3克隆形成能力影响的结果图。
[0023]图5.2.克隆形成实验拟合单击多靶模型与线性二次模型。
[0024]图5.3.新型靶向纳米粒子对前列腺癌细胞株PC3辐射增敏作用相关参数统计表。
[0025]图6.1.Western Blot检测新型革巴向纳米粒子对前列腺癌细胞株PC3细胞内DNA损伤标记物γ -Η2ΑΧ表达水平影响的结果图。
[0026]图6.2.Western Blot检测新型靶向纳米粒子对前列腺癌细胞株PC3细胞内DNA损伤标记物γ -Η2ΑΧ表达水平影响的灰度分析统计图。
[0027]图7.1.免疫荧光法检测新型靶向纳米粒子对前列腺癌细胞株PC3细胞内DNA损伤标记物γ -H2AX表达水平影响的结果图。
[0028]图7.2.免疫荧光法检测新型靶向纳米粒子对前列腺癌细胞株PC3细胞内DNA损伤标记物γ -H2AX表达水平影响的荧光表达量统计图。
[0029]图8.Western Blot检测新型革El向纳米粒子对前列腺癌细胞株PC3细胞内DNA损伤应答蛋白分子表达水平影响的结果图。
[0030]图9.免疫组化法检测新型靶向纳米粒子对PC3肿瘤组织内DNA损伤标记物γ -H2AX表达水平影响的结果图。
[0031]图10.免疫组化法检测新型靶向纳米粒子对PC3肿瘤组织内DNA损伤应答蛋白DNA-PKcs表达水平影响的结果图。
[0032]图ll.Western Blot检测新型革巴向纳米粒子对PC3肿瘤组织内DNA损伤应答蛋白分子表达水平影响的结果图。
[0033]图12.新型靶向纳米粒子对荷瘤鼠的肿瘤体积生长影响的结果图。
[0034]图13.新型靶向纳米粒子对荷瘤鼠生存期影响的结果图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合实施例对本发明进一步说明。
[0036]—种新型靶向纳米粒子，所述纳米粒子由叶酸靶向、生物可降解的正电子聚合物载体PE1-CyD-FA (Hl)荷载小片段发夹样结构的双链DNA分子构成；所述小片段发夹样结构的双链DNA分子为新型放射增敏剂Dbait分子，其大小为32bp。
[0037]进一步，所述纳米粒子的粒径为100?200纳米，Zeta电位为1mV?20mV。
[0038]所述的新型靶向纳米粒子的制备方法，包括以下步骤:
[0039](I)取正电子聚合物载体PE1-CyD-FA (Hl)溶于双蒸水中，得溶液I，室温、避光静置5分钟；
[0040](2)取小片段发夹样结构的双链DNA分子Dbait溶于双蒸水中，得溶液2，室温静置5分钟；
[0041 ] (3)避光、漩涡振荡下将溶液I滴入溶液2中，继续漩涡振荡15秒，使溶液I与溶液2充分混匀，避光、室温静置20分钟后得到新型靶向纳米粒子Hl/Dbait，即可用于后续相关实验。
[0042]所述的新型靶向纳米粒子用于肿瘤放射治疗的用途。
[0043]进一步，所述的肿瘤是前列腺癌或结直肠癌或肝癌或肺癌或黑色素瘤或乳腺癌或卵巢癌或胰腺癌或食管癌或胃癌或子宫癌或喉癌或甲状腺癌。
[0044]在本发明的优选实例中，选择去势抵抗性前列腺癌。
[0045]人前列腺癌细胞株PC3细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所。PC3细胞培养于含100yg/ml链霉素、100U/ml青霉素和10%胎牛血清的RPM1-1640培养基中，于37°C，5% 0)2培养箱中培养。
[0046]Dbait于南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0047]实施例1.新型革E向纳米粒子的粒径与Zeta电位检测
[0048]取新鲜配制的不同N/P比(1:1、6:1、12:1、18:1、24:1)的Hl/Dbait混合液，采用粒径/Zeta电位测定仪，对Hl/Dbait纳米粒子的光散射粒径、Zeta电位值进行测定。
[0049]实施例2.新型靶向纳米粒子的稳定性与包裹率检测
[0050]取新鲜配制的不同N/P比(1:1、6:1、12:1、18:1、24:1)的Hl/Dbait混合液，采用琼脂糖凝胶电泳对新型靶向纳米粒子Hl/Dbait的稳定性与包裹率进行检测。琼脂糖凝胶电泳的具体步骤如下:
[0051](I)称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50mllXTAE液，瓶口倒扣小烧杯，微波炉加热至琼脂糖完全融化，沸腾3次；
[0052](2)待琼脂糖凝胶液冷却至60°C时，加入5ul核酸染料，摇匀后倒入装置备用的制胶槽中，使凝胶液均匀铺于制胶槽底面。室温静置至凝胶完全凝固，垂直拔下制胶槽内的齿梳，将凝胶置入电泳槽内，添加IXTAE电泳缓冲液至没过凝胶1-2_。
[0053](3)混合Hl/Dbait混合液与DNA上样缓冲液后，将各样品分别加入样品孔内。
[0054](4)加样后立即电泳，电压120V，时间30分钟。
[0055](5)电泳结束后，取出凝胶置于凝胶成像系统内拍照并保存。
[0056]实施例3.倒置荧光显微镜下观察新型靶向纳米粒子对前列腺癌细胞株PC3细胞的转染效率
[0057](I)南京金斯瑞生物科技有限公司合成5-FAM标记的Dbait分子，用于焚光检测。
[0058](2)将处于对数生长期的PC3细胞接种至6孔板内，3X105/孔，用含有10%胎牛血清、100 μ g/ml链霉素、100U/ml青霉素的RPMI 1640培养基常规培养。待细胞融合度达到70% -80%时，更换培养基为无抗生素、含2%胎牛血清的RPMI1640培养基，准备进行转染。
[0059](3)按照N/P = 12:1 配制 Hl、5-FAM-Dbait 溶液，5-FAM-Dbait 用量为0.lnmol/2ml
培养基/孔。
[0060](4)避光、漩涡振荡条件下，将Hl溶液滴入5-FAM-Dbait溶液中，继续旋涡振荡15秒，混匀Hl/Dbait转染混合液，室温避光静置20min。
[0061](5)将Hl/Dbait转染混合液缓慢均匀加入6孔板中，前后左右摇动，使其充分混匀，置于37 °C，5 % CO2培养箱中继续培养。
[0062](6)培养24小时后，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光表达量，确定转染效率。
[0063]实施例4.MTT法检测新型靶向纳米粒子对前列腺癌细胞株PC3细胞的毒性
[0064](I)将处于对数生长期的PC3细胞接种至96孔板内，5X103/孔，用含有10%胎牛血清、100 μ g/ml链霉素、100U/ml青霉素的RPMI 1640培养基常规培养。待细胞贴壁后，更换培养基为无抗生素、含0.05%胎牛血清的RPMI 1640培养基，准备进