一种组合物、制剂及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞领域，特别涉及一种组合物、制剂及其用途。
【背景技术】
[0002] 从生物学上讲，衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程，它是复杂的自然现 象，表现为结构的退行性变和机能的衰退，适应性和抵抗力减退。在生理学上，把衰老看作 是从受精卵开始一直进行到老年的个体发育史。从病理学上，衰老是应激和劳损，损伤和感 染，免疫反应衰退，营养失调，代谢障碍以及疏忽和滥用药物积累的结果。
[0003] 美容和抗衰老越来越成为人们对美丽追求的手段，相应的也出现了越来越多的美 容抗衰老产品，在这些产品中，以外用的护肤产品为主，起到延缓衰老和皮肤保持弹性的目 的，但这些产品无法满足有面孔缺损等方面问题的人群对美容抗衰老的需求。而本专利的 产品能很好的解决这些面孔缺损问题，起到面部缺损修复和面部年轻化的目的。
[0004]目前常采用高浓度血浆浓缩（PRP)进行面部缺损修复，是利用自身血液制作的富 含血小板的高浓度血浆。但是PRP制剂无细胞成分，主要是血小板，通过血小板分泌各类生 长因子促进周围组织细胞的增殖来达到组织修复的功能，缺损修复能力低，时间长。血小板 缺陷、纤维蛋白合成障碍、血流动力不稳定等人群不能使用。PRP制剂需要从自体抽取外周 血进行血小板浓缩，属于血液制品，不适用于不具备医疗资质的机构单位。
[0005] 因此，提供一种快速高效修改面孔缺损的干细胞制剂均有重要的现实意义。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供一种组合物、制剂及其用途。该制剂充分利用干细胞的增殖 分化能力、玻尿酸和透明质酸钠的保湿以及EGF的促进细胞生长作用，达到稳定高效的修 复面孔缺损问题。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种组合物，包括脐带间充质干细胞、生长因子、透明质酸或其盐。
[0009] 在本发明的一些具体实施方案中，组合物还包括玻尿酸。
[0010] 在本发明的一些具体实施方案中，以mg/mL计，所述生长因子在所述组合物中的 质量体积比为1. 5~2. 5:1。
[0011] 在本发明的一些具体实施方案中，以cell/mL计，所述脐带间充质干细胞在所述 组合物中的密度为5 X105。
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，所述透明质酸盐为透明质酸钠，所述透明质酸 钠在所述组合物的中质量百分含量为5%~10%。
[0013] 在本发明的一些具体实施方案中，所述透明质酸或所述玻尿酸在所述组合物的中 质量百分含量为10 %~20%。
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步 骤： _5] 步骤1 :取脐带清洗后，剥去动、静脉管和外膜，剪碎成l_2mm2小块，倒置培养；
[0016] 步骤2 :加入完全培养基培养，2~3d后半量换液，培养6~8d，待细胞从组织块 中爬出，弃去组织块继续培养；所述完全培养基包括X-VIV015无血清培养基和10ng/ml的 EGF ；
[0017] 步骤3 :待细胞生长至80 %融合，弃去培养液，清洗，经0. 25 %胰酶消化l-2min，终 止消化，400g离心5min，收集细胞；
[0018] 步骤4 :在步骤3获得的细胞中加所述完全培养基重悬，传代培养，收集P2或P3R 细胞。
[0019] 具体的，在本发明的另一些实施方案中，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括 如下步骤：
[0020] 1.取脐带一根，PBS+200U/m的双抗溶液冲洗3遍；
[0021] 2.脐带剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜，中间华氏胶剪碎成l-2mm2小块， 均匀贴附于l〇cm培养皿，37°C 5% C02培养箱内倒放1-2h ;
[0022] 3?加入完全培养基（X-VIV015无血清培养基+10ng/ml的EGF) 5ml，2-3天后半量 换液，培养6-8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；
[0023] 4.带生长至80%融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0. 25%胰酶消化l-2min，加 FBS终止消化，收集细胞400g离心5min ;
[0024] 5.加完全培养基重悬，根据计数结果接种2-3皿；
[0025] 6.待细胞生长至80%融合后继续传代。取P2和P3代细胞上清液、P2或P3代细 胞进行制剂的制备。
[0026] 在本发明的一些具体实施方案中，所述生长因子的制备方法包括：
[0027] 步骤1 :取脐带清洗后，剥去动、静脉管和外膜，剪碎成l_2mm2小块，倒置培养；
[0028] 步骤2 :加入完全培养基培养，2~3d后半量换液，培养6~8d，待细胞从组织块 中爬出，弃去组织块继续培养；所述完全培养基包括X-VIV015无血清培养基和10ng/ml的 EGF ；
[0029] 步骤3 :待细胞生长至80 %融合，弃去培养液，清洗，经0. 25 %胰酶消化l-2min，终 止消化，400g离心5min，收集细胞；
[0030] 步骤4 :在步骤3获得的细胞中加所述完全培养基重悬，传代培养，收集P2或P3R 细胞上清液；
[0031] 步骤5 :取步骤4获得的P2或P3代细胞上清液，经0. 45 y m滤膜过滤除去大颗粒 物质，滤液再经〇. 22 y m滤膜过滤，除去3KDa以下小颗粒物质。
[0032] 具体的，所述生长因子的制备方法包括：
[0033] 1.收集P2和P3代上清液，经0. 45 y m滤膜过滤除去大颗粒物质
[0034] 2.滤液再经0. 22 y m滤膜过滤，除去3KDa以下小颗粒物质
[0035] (浓缩过程采用Slice200切向流器，循环过滤的时间为3h)，浓缩比：浓缩前体积： 浓缩后体积为3~4:1。
[0036] 3.浓缩液用冻干机制成冻干粉，备用。
[0037] 在本发明的一些具体实施方案中，所述生长因子的制备方法还包括取步骤5获得 的产品浓缩和冻干的步骤。
[0038] 本发明还提供了一种制剂，包含所述组合物和生理盐水，所述生理盐水在所述制 剂中的体积百分含量为70 %~90 %。
[0039] 具体的，整个制剂中：
[0040] 生长因子冻干粉浓度为：1. 5-2. 5mg/ml ;(都是以制剂为基准）
[0041] 脐带间充质干细胞密度为：5X105cell/ml
[0042] 透明质酸钠质量比为：5%-10%
[0043] 玻尿酸（透明质酸）体积比为：10%-20%
[0044] 生理盐水体积比为：70_90%。见图1。
[0045] 本发明还提供了所述组合物或所述制剂在制备美容和/或抗衰老的药物、保健品 和/或化妆品中的应用。
[0046] 在本发明的一些具体实施方案中，所述美容为修复缺损。更优选的，所述美容为修 复面部缺损。
[0047] 本发明提供了一种组合物，包括脐带间充质干细胞、生长因子、透明质酸或其盐。 本发明还提供了具有快速高效修复面孔缺损的干细胞制剂。充分利用干细胞的增殖分化能 力、玻尿酸和透明质酸钠的保湿以及EGF的促进细胞生长作用，达到稳定高效的修复面孔 缺损问题。
【附图说明】
[0048] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0049] 图1示制剂制备的流程图；
[0050] 图2示实施例4制备的制剂使用前后效果图；其中图2 (A)示实施例4制备的制剂 使用前效果图；图2(B)示实施例4制备的制剂使用前效果图；
[0051] 图3示实施例5中细胞增殖曲线。
【具体实施方式】
[0052] 本发明公开了一种组合物、制剂及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适 当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说 是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进 行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用 进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0053] 术语解释：
[0054] 透明质酸钠：透明质酸钠（SODIUM HYALUR0NATE)为从鸡冠中提取的物质， 也可通过乳酸球菌发酵制得，为白色或类白色颗粒或粉末，无臭味，干燥时，氮含量为 2. 8% -4. 0%，葡糖醛酸含量为37. 0% -51. 0%。在化妆品领域中使用较多，有保湿作用。
[0055] 玻尿酸：玻尿酸是由双糖单位（葡萄醛酸-N-乙硫氨基葡糖）组成的直链高分子 多醣，是一种组织中自然存在的物质。玻尿酸大量存在于人体的结缔组织及真皮层中，是一 种透明的胶状物质，具有强大的保湿功能，1公克的玻尿酸可以吸收500C. C的水分，相当于 甘油500倍吸水能力。在人类皮肤的真皮层中扮演了基质的重要角色，无论是组织结构上 整体的保养或是细胞之间的运送都具有很重要的功能。玻尿酸不仅有保持皮肤弹性的功 能，还能锁住大量水分子，对组织具有保湿润滑作用，使肌肤饱满年轻有弹性，但随着年龄 的增长，玻尿酸流失的速度比生长速度快时，肌肤也将渐渐变得缺乏水分，失去光泽弹性， 长久下来便出现皱纹等老化现象。
[0056] 表皮细胞生长因子：EGF是人体内存在的一种生长因子，它的主要功能是促进皮 肤细胞的分裂。研究表明：极微量的EGF即能强烈刺激细胞生长，抑制衰老基因表达，阻止 皮肤衰老，使皮肤各组成份保持最佳生理状态。此外，它还能刺激细胞外一些大分子（如透 明质酸和胶原蛋白等）的合成与分泌，滋润皮肤，是决定皮肤活力和健康的关键因素。研究 发现，EGF能促进上皮细胞、成纤维细胞的增值；增强表皮细胞的活力；延缓表皮细胞的老 化，使肌肤各组成成份保持最佳生理状态。
[0057] 脐带间充质干细胞：脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs)是指存 在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临 床应用前景。脐带间充质干细胞（MSCs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它 在骨、软骨