，例如，第〇天施用第1剂，在第5-40天施用第2剂，在第10-100 天施用第3剂，优选三剂分别在第0天、28天和90天施用。根据优选的加快方案，施用可在 第0天、7天和14天进行。加快方案可用于预防，例如，针对面临选择性外科手术的患者。 通常明矾被作为佐剂使用，例如，磷酸盐或氢氧化物。
[0245] 因此，本发明主题物质是以对025b具有高度特异性的鼠源性mAbs的发现为基础。 这些抗体作为诊断剂用于鉴定属于ST131谱系的MDR菌株具有很大的潜力。此外，特别是 在人源化以后，这些mAbs适合用于预防（例如，用于高风险群体）和治疗ST131-〇25b:H4 菌株导致的大肠杆菌感染。
[0246] 根据抗025的免疫血清常规用于诊断鉴定025b抗原表达的大肠杆菌菌株的这一 事实，人们认为，〇25b和025 (025a)糖类抗原是相同的或非常类似的。人们对ST131菌株中 〇 -抗原合成的遗传学背景未进行充分阐明，但是，rfb簇内的特定基因（编码0 -抗原合 成）构成了基于PCR的025b菌株鉴定的基础。此外，迄今为止，没有结构数据支持025 (a) 和025b抗原之间存在任何差异。
[0247]因此，令人吃惊的是，本发明的抗体可以特异性结合025b抗原，并特异性区分 〇25b抗原和025a抗原。
[0248] 为了证实表达大肠杆菌的025b抗原和025a抗原之间的遗传差异，米用从对保守 的侧翼基因：gnd和galF具有特异性的寡核苷酸开始的引物步移法，从商业可以获得的菌 株 81009 (Szijarto et al，FEMS Microbiol Lett, 2012, 332:131-6)对编码 0-抗原合成的 rfb簇进行测序。得到的rfb操作子的重叠群长11，300bp，与编码025抗原合成的酶（NCBI 登录号⑶014554)仅部分同源。结果证明，025b rfb操作子3'端长2043bp的片段与025rfb 操作子的对应区不同源，其中该片段被编码岩藻糖合成和运输的长6267bp的序列代替。
[0249] 对纯化组分中从大肠杆菌ST131分离的LPS中存在的0-特异性PS生物学重复单 元（RU)的结构进行了详细分析，该纯化组分由以一个重复单元（RU)替换的核心0S组成。 LPS ST131的RU是结构如图3所示的0-乙酰化戊多糖。
[0250] 实际上，据Kenneetal. (Kenne,Lindbergetal.，CarbohydrRes. 19830ct 28 ;122(2) :249-56)报道，ST1310-PS的RU结构与LPS025RU不同，据我们所知，它是 大肠杆菌脂多糖的一种新 0-血清型（Stenutzetal.FEMSMicrobiolRev. 2006May; 30(3) : 382-403.Review) 〇
[0251] 此外，从LPS ST131分离的核心寡糖的MALDI-T0F质谱法和组合物分析（糖及 甲基化分析）的初步结果支持K-12型，这是以前Szijarto V. et al.等在遗传学分析 的基础上报道过的（Szijarto et al，FEMS Microbiol Lett, 2012,332:131-6)。已经 证明，LPS ST131由两种主要核心寡糖（OS)糖型组成。糖型的类型取决于存在或不存 在〇-特异性多糖（PS)。未取代核心寡糖的主要糖型是截短型的K-12核心寡糖，去掉了 -7)-a -H印p_(l - 6)-a -Glcp二糖。该二糖的存在是0-PS取代核心0S和未取代核心 0S之间的区别。
[0252] 根据本发明的一个具体方面，提供一种与025b特异性表位选择性结合的抗体， 例如，与8D5-1G10抗体相同的表位结合或与命名为6D1-1B2或8A1-1G8或8D10-C8抗体 中的任一抗体相同的表位结合，该词语包括与基本上相同的表位结合的变体；或者包含与 8D5-1G10抗体或命名为6D1-1B2或8A1-1G8或8D10-C8抗体中任一抗体相同的结合位点， 该词语包括包含基本上相同的结合位点的变体。命名为6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10的抗 体将尤其包括特异性区分〇25b抗原和025a抗原的结合位点，且仅结合025b抗原。命名为 8D10-C8的抗体将尤其包括交叉特异性结合025b抗原和025a抗原的结合位点，及与025a 抗原相比，优选结合〇25b抗原。
[0253] 如果抗体交叉竞争，从而在给定时间点，仅一种抗体与表位结合，即一种抗体阻止 另一种抗体的结合或调节效应，则称抗体为"相同的表位结合"或"包括相同的结合位点"或 具有"基本上相同的结合"特点。
[0254] 此处谈及抗体时使用的词语"竞争"或"交叉竞争"指的是第一抗体，或其抗原-结 合部分，以一种与第二抗体，或其抗原-结合部分的结合足够类似的方式与表位结合，从而 在第二抗体存在下，第一抗体与其同源表位的结合结果，与不存在第二抗体时第一抗体的 结合相比，其结合减少，这种减少是可以检测的。或者，其中在第一抗体的存在下，第二抗体 与其表位的结合也减少，这种减少是可以检测的，但是，并不一定要求如此。
[0255] 也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，第二抗体并不抑制第一 抗体与其各表位的结合。但是，若每个抗体可以检测地抑制另一个抗体与其同源表位的结 合，不管其程度是相同、更大或更少，都称抗体为了与其各表位的结合而彼此"交叉竞争"。 竞争和交叉竞争抗体均包括在本发明之内。
[0256] 此处的竞争指的是采用竞争性ELISA分析，例如，如实例部分所述测定的相对抑 制大于大约30%。希望的是在特定的环境中，例如，在竞争分析用于选择或筛选设计具有结 合025b指定功能的新抗体时，设定更高的相对抑制阈值作为竞争合适水平的标准。因此， 例如，可以设定竞争性结合的标准，其中在抗体被视为具有足够竞争性之前，检测到至少 40 %相对抑制，或至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或甚至至少100 %。
[0257] 特别是，提供一种抗体，所述抗体包括命名为6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10或 8D10-C8的抗体中的任何一个抗体的可变区，特别是选自6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10和 8D10-C8的抗体的⑶R序列的至少其中一个，优选至少两个，至少3个，至少4个，至少5个或 至少6个⑶R序列，或其功能活性的⑶R变体。更具体地说，提供命名为6D1-1B2、8A1-1G8、 8D5-1G10或8D10-C8中的任何一个抗体。
[0258] 特别是，命名为8D5-1G10抗体或8D10-C8抗体的抗体或其任何功能活性变体可以 采用保藏材料或其中包含的各核苷酸序列，如其中一个质粒与/或其中一个保藏宿主细胞 制备。
[0259] 根据一个具体的方面，8D5-1G10抗体或其功能相当的变体可以来源于包含由任何 质粒进行编码的可变区的抗体，所述质粒掺入到保藏号为DSM 26763和/或DSM 26762的 宿主细胞中；例如，采用保藏材料的部分或（点）突变的CDR序列来工程改造特异性抗体或 其任何功能活性变体。
[0260] 根据本发明另一个具体方面，8D5-1G10抗体或其功能相当变体来源于或采用在以 保藏号DSM 26763与/或DSM 26762保藏的宿主细胞制备的抗体可变区；例如，采用部分序 列，例如，保藏材料的一个或多个CDR序列，从而工程改造特异性抗体或其任何功能活性变 体。
[0261] 具体地，6D1-1B2或8A1-1G8抗体变体是功能活性的8D5-1G10抗体的CDR变体，例 如，至少其中一个CDR序列有部分变化。
[0262] 根据一个具体的方面，8D10-C8抗体或其功能相当的变体可以来源于包含由任何 质粒进行编码的可变区的抗体，所述质粒掺入到保藏号为DSM 28171与/或DSM 28172;例 如，采用保藏材料的部分或（点）突变的CDR序列来工程改造特异性抗体或其任何功能活 性变体。
[0263] 根据本发明另一个具体方面，8D10-C8抗体或其功能相当变体来源于或采用以保 藏号DSM 28171与/或DSM 28172号保藏的宿主细胞制备的抗体可变区；例如，采用部分序 列，例如，保藏材料的一个或多个CDR序列，从而工程改造特异性抗体或其任何功能活性变 体。
[0264] 在某些方面，本发明提供变体抗体，优选单克隆抗体，更优选鼠源性、人源化或人 源抗体，包括重链和轻链，其中重链或VH可变区或各自的CDR中任一个包包括来源于各自 保藏质粒与/或各自保藏宿主细胞的氨基酸序列。
[0265] 在某些方面，本发明提供变体抗体，优选单克隆抗体，更优选鼠源性、人源化或人 源抗体，包括重链和轻链，其中轻链或VL可变区或各自的CDR中任一个包括来源于各自保 藏质粒与/或各自保藏宿主细胞的氨基酸序列。
[0266] 在某些方面，本发明提供变体抗体，优选单克隆抗体，更优选鼠源性、人源化或人 源抗体，包括重链和轻链，其中重链和轻链或VH/VL可变区或各自的CDR中任一个包括来源 于各自保藏质粒与/或各自保藏宿主细胞的氨基酸序列。
[0267] 在某些方面，本发明还提供变体抗体，包括来源于保藏材料的各自的结合序列，如 可变序列与/或CDR序列，其中所述结合序列，例如，任何CDR序列，包括与来源于保藏材 料的氨基酸序列的一致性是至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%或至少 99%的序列，其中变体是功能活性的变体。
[0268] 正如本发明所述，一方面，本发明提供抗体分子，所述抗体分子的特征在于，例 如，与单克隆抗体8D5-1G10或8D10-C8竞争结合025b抗原的能力。6D1-1B2、8A1-1G8、 8D5-1G10抗体中的任何一个抗体是鼠源性lgG3抗体，8D10-C8抗体是携带k(kappa)轻链 的鼠源性lgG2b抗体，是发明人分离和表征的。8D5-1G10抗体或8D10-C8抗体的可变区由此 处谈到的保藏材料表达。因此，本发明充分公开了轻链和重链决定的结合特点，及8D5-1G10 抗体或8D10-C8抗体的VL/VH域，使其作为母抗体，或与本发明功能活性变体或竞争性抗体 对比。
[0269] 8D5-1G10重链（8D5-1G10-HC)的成熟可变区是，例如，利用保藏号为DSM 26762的 宿主细胞制备的，或者是利用惨入其内的编码质粒的各序列彳目息制备的。
[0270] 8D5-1G10轻链（8D5-1G10-LC)的成熟可变区是，例如，利用保藏号为DSM 26763的 宿主细胞制备的，或者是利用对惨入其内的编码质粒的各序列彳目息制备的。
[0271] 8D10-C8重链（8D10-C8-HC)的成熟可变区是，例如，利用保藏号为DSM 28172的宿 主细胞制备的，或者是利用对掺入其内的编码质粒的各序列信息制备的。
[0272] 8D10-C8轻链（8D10-C8-LC)的成熟可变区是，例如，利用保藏号为DSM 28171的宿 主细胞制备的，或者是利用对掺入其内的编码质粒的各序列信息制备的。
[0273] 相对其它大肠杆菌抗原，例如除025抗原以外的任何糖类抗原或任何核心抗 原，优选结合〇25b抗原的亲和力差异优选至少高10-倍，即Kd至少相差10,优选至少高 100-倍，更优选至少高1000倍。
[0274] 与商业分型血清，如Statens Serum Institut提供的高滴度大肠杆菌025抗血清 (#81369)相比，优选结合025b抗原的结合亲和力差异特别是至少高5倍，或至少高6-倍， 或至少高7-倍，或至少高8-倍，或至少高9-倍，或至少高10-倍。
[0275]相对025a抗原，优先结合025b抗原的结合亲和力差异特别是至少等于或大于，例 如，至少高1. 5倍或至少高2-倍，或至少高3-倍，或至少高4-倍，或至少高5倍，或至少高 6-倍，或至少高7-倍，或至少高8-倍，或至少高9-倍，或至少高10-倍。
[0276] 本发明的优选抗体与任何所述单个抗原，特别是025b抗原结合具有较高亲和力， 特别是具有较高结合速率与/或较低解离速率，或较高结合亲和力。抗体的结合亲和力 的通常以抗体的浓度表征，即一半抗源结合位点被占据时的浓度，被称为解离常数（Kd或 KD)。通常，Kd〈10 7M的结合物被视为高亲和力结合物，在一些情况下，例如，用于较高亲和 力的治疗目的时，如，Kd〈10 SM，优选Kd〈10 9M，甚至更优选Kd〈10 时。
[0277]然而，在特别优选的实施例中，单一抗原的结合亲和力是中等亲和力，例如，当与 至少两个抗原结合时，Kd小于10 6M和不超过10 7M，。
[0278]本发明可以提供中等亲和力结合物，优选连同亲和力成熟过程，如果必要的话。
[0279] 亲和力成熟是抗体和靶抗原产生亲和力增加的过程。随着抗体结构的变化，包括 氨基酸突变发生或体细胞免疫球蛋白基因片段突变的结果，产生和选择抗原结合位点变 体，实现更大的亲和力。亲和力成熟的抗体比母抗体的亲和力大几个对数倍（log)。
[0280] 单一母抗体可以经历亲和力成熟。或者，与革El标抗原具有类似结合亲和力的抗体 文库可以视为母体结构，这些母体结构经过变化得到亲和力成熟的单一抗体或亲和力成熟 的抗体文库。
[0281]本发明优选的亲和力成熟的抗体变体，其结合亲和力至少增加10倍，优选至少 增加100倍。在采用各母分子文库的竞争性筛选（selection campaign)中，可以采用亲 和力成熟，采用具有中等亲和力的抗体，得到本发明具有特异性靶结合性质、结合亲和力 Kd〈10 7M的抗体。或者，可以通过本发明的抗体亲和力成熟，甚至更加提高亲和力，得到亲 和力较高的抗体，对应的Kd小于10 SM或小于10 9M，优选小于10 WM，或甚至小于10 nM，最 优选处于皮摩尔范围。
[0282] -个具体方面涉及本发明的一种抗体，其特征在于特异性抗菌功能活性，如补体 介导杀菌和调理吞噬吸收和杀灭细菌。
[0283] 吞噬效应细胞可以通过采用补体活化的另一种途径活化。与微生物表面抗原结合 的抗体吸引补体的第一组分，与它们的Fc区发生级联反应，并启动激活"经典"补体系统。 这导致刺激吞噬效应细胞，通过补体和抗体依赖机制（CDC)，最终杀灭靶标细菌。
[0284] 根据一个具体实施例，本发明的抗体在免疫效应细胞存在下具有标准SBA或0PK 试验测定的细胞毒性活性。如果与对照相比，细菌杀灭百分数明显增加的话，可以表明本发 明抗体的SBA或0PK试验测定的细胞毒性活性。与SBA或0PK相关的细菌活性优选以绝 对百分数增加量衡量，优选高于5 %，更优选高于10 %，甚至更优选高于20 %、30 %、40 %或 50%〇
[0285]本发明的抗体可以采用杂交瘤方法鉴定或获得。在这种方法中，小鼠或其它合适 的宿主动物，如仓鼠，经免疫引出淋巴细胞，产生或能够产生与用于免疫的蛋白质特异性结 合的抗体。或者，淋巴细胞可以体外免疫。然后，采用合适的融合剂，如聚乙二醇，淋巴细胞 与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
[0286] 为产生抗抗原的单克隆抗体，对杂交瘤在其中生长的培养基进行分析。优选杂交 瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀法或通过体外结合试验，如放射免疫 法（RIA)或酶联免疫吸附剂法（ELISA)进行测定。
[0287] 例如，本发明的抗体可以通过源（母）抗体得到，例如，以编码卡那霉素抗 性的盒代替kps簇（编码胶囊合成），利用代表性ST131-025b: H4菌株81009 (如 81009 A kps: :kan)的非-胶囊突变体来免疫小鼠得到。然后，分析从小鼠得到的血清样 品，显示最高IgG抗025b抗原滴度（ELISA和蛋白质印迹法）的小鼠脾脏可用于产生杂交 瘤。在亚克隆之后，可以选择杂交瘤克隆，其分泌对025b抗原具有特异性的抗体及与表达 〇25b抗原的活的野生型大肠杆菌表面结合。然后，这些mAbs可以从杂交瘤上层清液提纯， 用于进一步测试其〇25b抗原的特异性结合，及可能测试其相对025a抗原优先结合025b抗 原的结合亲和力差异，和工程改造抗体，例如，用于不同诊断或治疗用途。
[0288] 差异结合抗体，本发明亦称为选择性抗体，在某些情况下，通过针对单一抗原进行 筛选而得到。为了增加分离差异结合克隆的可能性，应针对不同的抗原通过采用几种选择 性压力来开展进行性筛选。特殊的mAb选择策略以交替的方式采用025b和025a成分或其 它大肠杆菌抗原。
[0289] 重组抗原可用于从抗体文库选择抗体，例如，酵母展示抗体文库。
[0290] 在任一事件中，采用本领域熟悉的抗体优化方法，可以进一步改善选择性结合。例 如，此处所述免疫球蛋白链可变区的某些区域可以采用一种或多种优化策略，包括轻链替 换、目标突变形成、CDR融合及选定CDR与/或框区域的定向突变。
[0291] 鉴定具有要求的选择性结合特性的抗体的筛选方法可以通过展示技术实现（使 用噬菌、细菌、酵母菌或哺乳动物细胞）。反应性可以根据ELISA、蛋白质印迹法或流式细胞 术的表面染色法，例如，采用标准试验进行评价。
[0292] 一旦鉴定出具有要求性质的差异结合抗体，可以测定抗体识别的优势表 位。表位作图的方法是本领域所熟悉和公开的，例如，Epitope Mapping:A Practical Approach, Westwood and Hay, eds.，Oxford University Press, 2001 中所述。
[0293] 表位作图涉及抗体结合表位的鉴定。对于熟悉本领域的技术人员来说，有许多种 测定蛋白质上表位位置的方法，包括抗体-抗原复合物的结晶学分析、竞争试验、基因片段 表达试验和基于合成肽的试验。谈到抗体时所称"结合相同表位"的抗体此处应按下述方 式理解。当两个抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体被称为结合相同或基本上相同 或大体上相同的表位。测定两个抗体是否与相同或空间上重叠的表位结合的常用方法是竞 争试验，该试验采用标记抗原或标记抗体，可以配置成不同形式的所有数量。通常，抗原定 植在96-孔板上，采用放射性或酶标记方法测定未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。
[0294] 一旦鉴定出抗体具有要求的差异结合性质，可以采用本领域熟悉的方法包括，例 如，杂交瘤技术或重组DNA技术制备这种抗体，包括抗体片段。
[0295] 例如，可以采用熟悉的重组表达载体，例如，本发明的质粒或包括编码抗体序列的 核苷酸序列的表达盒，通过分离DNA编码要求抗体链并转染到编码序列转染重组宿主细胞 中表达，从而重组单克隆抗体。重组宿主细胞可以是原核细胞和真核细胞，如前文所述的那 些细胞。
[0296] 根据具体的方面，核苷酸序列可用于基因操作来对抗体进行人源化或改善亲和 力，或抗体的其它特点。例如，如果抗体在临床试验中使用和治疗人类时，恒定区可以工程 改造，使其与人类恒定区更类似，从而可以避免免疫应答。期望的是，基因操作抗体序列使 其与靶025b的亲和力更大及抗MDR大肠杆菌的功效更大。显然，对于熟悉本领域的技术人 员来说，可以对抗体进行一种或多种多核苷酸变化，却仍然保持其对靶〇25b的结合能力。
[0297] 采用各种方法产生抗体分子，通常是人们熟悉的。例如，美国专利 6331415(Cabilly et al)描述了一种重组制备抗体的方法，其中重链和轻链从单一细 胞中单一载体或两个独立的载体同时表达。Wibbenmeyer等人（1999, Biochim Biophys Acta 1430(2) : 191-202)和 Lee 和 Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198)描述了 采用独立培养的大肠杆菌中表达的质粒，从独立制备的重链和轻链制备单克隆抗体的方 法。与抗体制备有关的其它各种方法在，例如，Harlow, et al.，ANTIB0DIES:A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.，（1988)中进 行了描述。
[0298] 如果要求的话，可以对本发明的抗体，例如，8D5-1G10抗体或8D10-C8抗体，或各 自的结合位点或CDR进行测序，然后，多核苷酸序列或其序列变体或突变体可以克隆到载 体中表达或传播。编码抗体的序列可以保持在宿主细胞的载体内，然后，宿主细胞可以扩大 和冷冻供将来之用。细胞培养中重组单克隆抗体的制备可以采用本领域熟悉的方法通过B 细胞抗体基因克隆进行。
[0299] 另一方面，本发明提供一种分离核酸，所述分离核酸包括编码制备本发明重组抗 体的序列。
[0300]另一方面，本