的血清型。
[0400] 33.根据定义1至13中任一项所述抗体的诊断制剂，任选包含带标记的抗体与/ 或其它带标记的诊断试剂，与/或固定至少一种抗体和诊断试剂的固相。
[0401] 34.命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体识别的分离表位。
[0402]35?-种免疫原，包括：
[0403] (a)定义34所述的表位；
[0404](b)任选其它与（a)中所述表位非天然相关的表位；及
[0405] (c)载体。
[0406] 36.根据定义35所述的免疫原，其中所述载体是药学上可接受的载体，优选包含 缓冲物质与/或佐剂。
[0407] 37.根据定义35或36所述的免疫原，所述免疫原在疫苗配方中，优选肠胃外使用。
[0408] 38.根据定义35至37中任一项所述的免疫原，用于通过施用有效剂量的所述免疫 原处理对象，以保护对象免被MDR大肠杆菌感染，或预防所述感染引发的疾病。
[0409] 39.根据定义38所述的免疫原，用于引发保护性的免疫应答。
[0410] 40.编码定义1至13中任一项所述抗体或定义35所述表位的分离核酸。
[0411] 参照下述实例将更充分地理解前述说明。但是，这些实例仅仅只是本发明实践一 个或多个实施例的方法代表，不应视为限制本发明的范围。
[0412]
[0413]实例1 :025b特异件抗体
[0414] 我们通过用盒编码卡那霉素抗性代替kps簇（编码胶囊合成），产生了代表 性 ST131-025b:H4 菌株 81009(81009 A kps::kan, [Szijarto et al，FEMS Microbiol Lett，2012, 332:131-6])的非胶囊化突变体。这种突变体菌株的亚致死剂量的活细胞或甲 醛-灭活细胞用于免疫小鼠4次，间隔时间为两周。然后，对从小鼠获得的血清样品进行分 析，而具有抗〇25b抗原最高IgG滴度的小鼠脾脏（ELISA、免疫蛋白印迹法和表面染色）用 于杂交瘤产生。在亚克隆之后，选择几个杂交瘤克隆，所述克隆分泌对纯化〇25b抗原具有 特异性且与表达〇25b抗原的活的野生型大肠杆菌菌株表面结合的抗体。这些从杂交瘤上 清液纯化的mAbs用于进一步测试。
[0415] 如图1所示，所有抗体与确定为ST131_025b:H4菌株的几种不同临床分离菌结合， 与表达的荚膜多糖无关（K5、K2或未知K类型）。关于与表达025a抗原的菌株结合，鉴定 了两种mAbs类型。一类由mAb 8D5-1G10表不，未与025a菌株表面结合，另一类以8D10-C8 表示的mAbs对025a菌株具有交叉反应性。但是，这些mAbs中没有一种可与表达不相关抗 原，即02(图1)或其它0-型（未画出）的任何大肠杆菌菌株结合。
[0416] 采用纯化LPS，通过免疫印迹分析，进一步证实了 mAbs的特异性（图2)。这些mAbs 从含有025b抗原的ST131菌株中识别LPS分子，但是，它们对025a LPS抗原的交叉反应潜 力不同。虽然mAb 8D5-1G10只与025b抗原反应，但mAb 8D10-C8对025a具有交叉反应性。 将这种观察的交叉反应性与日常用于检测ST131:025b菌株的商业025分型血清（Statens Serum Institut, high titer E.coli 025antiserum, #81369)显不的交叉反应性进行了对 比。与025b LPS相比，商业兔子血清显示出明显偏向结合025a抗原。相比之下，鼠源性 mAb 8D10-C8与025b LPS分子反应，强度与025a分子至少相同。随后的定量分析表明，mAb 8D10-C8与商业分型血清相比时，025b和025a的结合强度比至少高10倍。
[0417] 上述数据共同表明，有两种类型的025b-特异性mAbs，这些mAbs对025b具有高度 特异性，并识别〇25a和025b抗原共享的表位。因此，我们的数据证明，025b的结构确实与 经典025(即025a)抗原不同。025b亚单位的新结构将在实例2中进行阐明。
[0418] 采用RT-PCR，以及变性的重链和轻链引物，从杂交瘤克隆中扩增出025b-特异 性mAbs的重链（VH)和轻链（VL)的可变区，并测序。采用Ig数据库的BLAST以及頂GT/ V-QUEST分析序列，而⑶R区根据Kabat命名法定义。
[0419] 将mAb 8D5-1G10的可变轻链和重链序列克隆到各自的载体内，用于转化保藏在 DSMZ中的保藏号为DSM 26763和DSM 26762的大肠杆菌宿主细胞。
[0420] 将mAb 8D10-C8的可变轻链和重链序列被克隆到各自的载体内，用于转化保藏在 DSMZ中的保藏号DSM 28171和DSM 28172的大肠杆菌宿主细胞。
[0421] 实例2 :025b抗原的结构分析
[0422] 采用热酚/水法分离大肠杆菌ST131的LPS，并采用透析、蛋白酶K消化和超速 离心法对其进行纯化。1^5制剂的平均收率是干细菌质量的2.61%。采用505^^6￡分析 LPS，表明组分由不同数量寡糖重复单元（RU)取代的核心寡糖（0S)及未取代核心寡糖组 成。〇-特异性多糖（0-PS)和不同的寡糖成分通过弱酸水解释放，并通过在Bio-Gel P-10 上进行凝胶过滤分离。通过糖分析和甲基化分析、NMR光谱分析和MALDI-T0F质谱（MS)分 析各组分。
[0423] 0-PS RU的结构采用一个单RU取代的核心0S组成的组分测定。单糖分析表明，存 在Rha、Glc、Gal、Hep和更少量的GlcN。鉴别了等摩尔数量的末端Rhap、末端Glcp、3, 6-取 代Glcp、3-取代Rhap及痕量3-取代GlcpN的衍生物，并命名为0-PS RU。7-取代Ifepp、 6_取代Glcp、2-取代Glcp、末端Galp、3, 6-取代Glcp和末端Hepp的余下部分甲基化糖醇 乙酸酯构成了 K-12型的核心寡糖。由于分别被P和PPEtn取代及存在羧基，在标准甲基化 和糖分析中无法检测出3, 4-取代Ifepp、3, 4, 7-取代Ifepp和Kdo的衍生物。
[0424] LPS ST131的0-特异性PS的RU结构采用NMR光谱法测定。0-PS 4和13C共振的 全面归属通过综合COSY、T0CSY和N0ESY得到的信息以及HSQC-DEPT、HMBC和HSQC-T0CSY 实验获得。
[0425] HSQC-DEPT光谱包含13个端基质子和碳，以及一个Kdo自旋系统的信号。这 些信号来源于核心寡糖以及〇-特异性PS的一个RU。高电场区包含0-乙酰基的一个CH3 的信号、N-乙酰基的一个CH3的信号，以及两个6-脱氧糖的CH3特有的高磁场信号（Rha)。 光谱表明研究的寡糖具有十四糖结构。由于与P、PP和PEtn相关的高异质性，对非-还原 端的八糖的全面自旋系统进行了全面的分辨，重点是RU结构及其与K-12核心0S的连接。
[0426] HMBC谱图显示，相邻糖残基之间的残基间连接性采用N0ESY和HMBC实验观察。连 接位置处端基质子和碳之间以及连接位置处端基碳和质子之间出现交叉峰，这证明多糖的 非还原区中糖残基的序列。
[0427]根据这些测定，确定了 025b-特异性PS的重复单元（图3(a))，所述重复单元是戊 多糖，其中以一3) - 0 -GlcpNAc (残基K)作为RU的残基，取代了核心0S 7) - a -Ifepp (残 基L)的第一个残基。由于更长PS组分的可能污染，通过0-特异性链后面的RU无法鉴定 第一个RU的取代位置。此外，不需要对这些组分进行进一步详细的结构分析，可以排除后 面重复单元中存在作为a -端基异构体的GicNAc (据之前报道，某些大肠杆菌脂多糖存在 GicNAc)〇
[0428] 采用MALDI-TOF MS确认了核心0S、被一个RU取代的核心0S及最终0-PS RU(数 据未显示）的分子量。所有谱图都根据此处阐明的LPS ST131的RU结构及前面鉴定的 K-12 核心 0S 的糖型进行解释（Duda et al. Microbiology. 2011Jun;157(Pt 6): 1750-60. doi:) 10. 1099/mic. 0. 046912-0.Epub 2011Mar 3；Muller-Loennies et al. J Biol Chem.2003S印 5;278(36):34090-101.Epub 2003Jun 20)。低分辨率谱图的MALDI-MS 分析 显示，由更短0-PS取代的核心OS组成的组分具有下述优势离子的离子簇:m/z 2797. 2、m/ z 3659. 6、m/z 4522. 0和m/z 5383. 6,属于分别被1、2、3和4个RU取代的核心0S (具有P 和PPEtn)。这些离子的平均质量差是862. IDa，并与0-特异性PS RU计算的平均质量匹配 (861. 8Da, RU-H20)〇
[0429] 考虑到RU的分子量，并对比其它组分的MS结果，我们证明了作为第一 RU取代地 点的外核心区中存在由一7)-a -H印p_(l - 6)-a -Glcp二糖组成的更长核心0S糖型（图 3(a))。已经证明，LPS ST131由两种主要核心寡糖（0S)糖型组成。糖型的类型取决于存 在或不存在〇-特异性PS。未取代的核心寡糖的主要糖型是截短型的K-12核心寡糖，去掉 了 一 7) - a -H印p-(1 - 6) - a -Glcp二糖。这种二糖是0-PS取代核心0S和未取代核心0S 之间的区别。
[0430] 实例3 :大肠杆菌025b特异件诊断分析
[0431] 遵照生产商的说明，将025b-特异性mAb 8D5-1G10与直径1 y m的乳胶珠粒 (Polysciences)结合。测定结合的乳胶珠粒凝集不同大肠杆菌菌株的潜力。将一菌环细 菌（大约l〇 scfu)与10 y 1 PBS中1%的mAb-结合的乳胶珠粒悬浮液混合。如图4所示， 在温和地搅拌几秒钟后，表达〇25b抗原的大肠杆菌显示强烈的凝集模式。相反，表达025a 或02抗原的大肠杆菌不与同一试剂凝集。因此，这种推定诊断剂被认为比本领域目前用于 检测025b (和025a)-阳性大肠杆菌的凝集试剂（即多克隆抗025兔子血清）更具特异性。
[0432] 此外，由于在凝集分析中推荐将商业抗-025血清与加热杀灭（即细胞溶解）的大 肠杆菌细胞一起使用，我们测试了，纯化或与乳胶珠粒结合的〇25b mAbs是否具有更高的 灵敏度，即其在完整的荚膜多糖存在下，是否能够凝集活的大肠杆菌细胞。对多种〇25b临 床分离菌进行测试，某些代表性菌株的结果在表1中给出。发现下述两方面的灵敏度得到 改进：i)代表性菌株#1和#2与游离的或结合珠粒的非加热杀灭形式（直接从琼脂板取的 活细菌）的〇25b-特异性mAbs可以凝集，而采用商业025兔子血清的凝集要求事先加热溶 解细菌），ii)代表性菌株#3和#4即使在热杀灭形式时也不能够与商业血清凝集，而采用 纯化mAb 8D5-1G10时，同样的溶菌产物得到阳性结果。重要的是，当同样的抗体与乳胶颗 粒结合时，甚至与天然细菌细胞也存在凝集作用。这些结果表明了凝集分析中珠粒-结合 mAbs优异的灵敏度，这一点得到了以下事实的证明：采用这种试剂时，即使不进行任何预 处理（即不产生加热杀灭的溶菌产物），目前测试的所有〇25b阳性大肠杆菌菌株都呈阳性 凝集。此外，采用这种试剂作为检测〇25b-表达细菌的诊断工具，与基于PCR的技术相比更 具优势，而基于PCR的技术仅给出实际表达靶标抗原的细菌的阳性结果。例如，表1中的代 表性菌株#5对诊断中日常使用的025b特异性基因呈PCR阳性，但是，在任何凝集分析中均 呈阴性。这种菌株已经证明显示出粗糙的LPS显型（没有表达0-抗原），因此，PCR结果可 视为假阳性。当这种试验用于伴随诊断时，即用于选择可从〇25b特异性治疗方法中受益的 感染表达〇25b的大肠杆菌菌株的患者时，避免这种假阳性非常重要。
[0433] 还对用乳胶珠粒-结合mAbs检测游离025b LPS分子的潜力进行了试验。将 l-1000ng不同量的高度纯化025b LPS与10ul PBS中1%的珠粒悬浮液进行培养。如图5 所示，可以看到剂量依赖性凝集模式：l〇〇ng游离LPS时的结果最好，在1000或10ng时仍 能检测到凝集作用，而在lng游离025b LPS时检测不到凝集作用。
[0434] 表1 :利用商业025分型血清和025b特异性mAb 8D5-1G10得到的不同025b菌株 的凝集结果对比
[0435]
[0436] 实例4 :025b特异件mAbs的抗菌作用
[0437] 在致命的鼠源性菌血症模型中对025b-特异性mAbs (对025a具有或不具有交叉 反应性）的潜在保护作用进行了测试。对各组的5只小鼠腹膜内接受100 y g纯化8D5-1G10 或8D10-C8。24小时后，小鼠挑战静脉内注射（之前在预试验中确定的）致死剂量的表达 〇25b抗原的大肠杆菌菌株81009 (2xlOsCFU/小鼠）。每天对小鼠的致死率进行监测，监测3 周。图6显示了 2个独立实验的组合结果，两个实验的结果类似。在监测的3-周感染后期 间，采用PBS免疫的90 %的小鼠模拟死于感染，两种试验的mAbs的存活率呈统计学（时序 检验（Logrank test))上显著增加。
[0438] 为了确证这种体内数据，还对纯化mAbs的杀菌作用进行了体外试验。将2ml对数 生长中期的大肠杆菌81009培养基用PBS清洗2次，重新悬浮至最终浓度为5xl0 5CFU/ml。 将10 y 1这种细菌悬浮液在4°C用4 y g各mAbs培养15分钟，mAbs用40 y 1 RPMI-1640缓 冲液稀释，其中补充3%人白蛋白。然后，将50 y 1合并的人血清（前面吸收了大肠杆菌菌 株81009)加入到反应中，在37°培养1、2和3小时。反应中最终的CFU和抗体浓度分别是 5xl0 4CFU/ml和40 y g/ml，总体积是100 y 1。将10 y 1等分样放到TSB板上，在规定时间点 进行菌落计数。
[0439] 如图7所示，在3小时研究期内，测试的两种mAbs能够显著地降低CFU。与此相 反，与不相关mAb混合或无抗体混合的细菌在此介质中显示恒定的增长。补体在血清标本 中是失活时（在56°C培养30分钟），未观察到任何mAbs杀灭任何细菌（数据未显示）。这 些结果证明，这两种〇25b-特异性mAbs可以启动补体介导杀菌作用。
【主权项】
1. 一种与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的025b抗原特异性结合的分离抗体。2. 根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是单克隆抗体。3. 根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体与025a和025b抗原共享的表位交叉特 异性结合。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，相对于大肠杆菌的025a抗原，所述抗体 优先与〇25b抗原结合，或与这两种抗原结合的亲和力至少相等。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的抗体，所述抗体具有全长单克隆抗体或其抗体 片段的结合位点，包括至少一个掺入到结合位点的抗体域，优选其结合〇25b抗原的亲和力 Kd小于10 7M,优选小于10 SM。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合的表位与命名为 8D5-1G10或8D10-C8的抗体相同，优选包含与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体相同的结 合位点。7. -种与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的特异性结合的分离单克隆抗体，包括抗体 8D5-1G10的抗原结合位点，或源自或是抗体8D5-1G10,或抗体8D5-1G10的功能活性变体， 优选其中抗体8D5-1G10具有以下特点： a) 以保藏号DSM 26763保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区；和/或 b) 以保藏号DSM 26762保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区； c) 或（a)与/或（b)的功能活性变体的可变区。8. -种与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的025b抗原特异性结合的分离单克隆抗 体，所述抗体与〇25a和025b抗原共享的表位交叉特异性结合，并且包括抗体8D10-C8的抗 原-结合位点，或是或源自抗体8D10-C8,或是抗体8D10-C8的功能活性变体，优选其中所述 抗体8D10-C8的特点是： a) 以保藏号DSM 28171保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区；和/或 b) 以保藏号DSM 28172保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区； c) 或采用（a)与/或（b)的功能活性变体。9. 包含核苷酸序列的质粒，所述序列是 A -对保藏号DSM 26763的宿主细胞中包含的命名为8D5-1G10-LC的抗体轻链可变区进 行编码；与/或 -对保藏号DSM 26762的宿主细胞中包含的命名为8D5-1G10-HC的抗体重链可变区进 行编码； 或B -对保藏号DSM 28171的宿主细胞中包含的命名为8D10-C8-LC的抗体轻链可变区进行 编码；与/或 -对保藏号DSM 28172的宿主细胞中包含的命名为8D10-C8-HC的抗体重链可变区进行 编码。10. 包含编码序列的表达盒，用于表达权利要求1至8中任一项所述抗体的轻链与/或 重链，所述表达盒或编码序列来源于权利要求9所述的质粒。11. 包含权利要求9所述质粒或权利要求10所述表达盒的宿主细胞。12. 制备权利要求1至8中任一项所述抗体的方法，其中权利要求10所述的宿主细胞 在一定条件下培养或保持，以制备所述抗体。13. -种鉴定候选抗体的方法，包括： (a) 提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及 (b) 对样品中的抗体或样品产生的抗体与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体识别的表 位的结合进行评价，其中抗体和表位之间的阳性反应鉴定该抗体为候选抗体。14. 一种鉴定候选抗体的方法，包括： (a) 提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及 (b) 对样品中的抗体或样品产生的抗体与ST131-025b:H4菌株的025b抗原及非-MDR 大肠杆菌菌株的〇25a抗原的结合进行评价，其中相对025a抗原，抗体与025b抗原之间的 特异性阳性反应鉴定该抗体为候选抗体。15. -种制备权利要求1至8中任一项所述抗体的方法，包括 (a) 提供一种根据权利要求13或14所述鉴定的候选抗体；及 (b) 制备一种单克隆抗体，或人源化候选抗体或人源候选抗体，或其与候选抗体具有相 同表位结合特异性的衍生物。16. 根据权利要求1至8中任一项所述的抗体，用于处理承受MDR大肠杆菌感染风险或 遭受MDR大肠杆菌感染的对象，包括使对象服用有效剂量的抗体，限制对象的感染或使所 述感染引起的病情好转，优选用于治疗或预防肾盂肾炎、第二次菌血症、脓毒病、腹膜炎、脑 膜炎和呼吸机相关性肺炎。17. -种权利要求1至8中任一项所述抗体的药物制剂，优选包含肠胃外或粘膜剂型， 任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。18. 根据权利要求1至8中任一项所述抗体，用于诊断用途以测定表达LPS 025b抗原 的MDR菌株在对象中导致的大肠杆菌感染，如上下尿路感染，包括膀胱炎或尿道炎，上行性 或血源性肾盂肾炎，特别是糖尿病患者中的，以及菌血症、脓毒病、腹膜炎或肠道定植。19. 一种权利要求1至8中任一项所述抗体的诊断制剂，任选包含带标记的抗体与/或 其它带标记的诊断试剂，与/或固定至少其中一种抗体和诊断试剂的固相。20. 由命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体识别的一种分离表位。21. 一种免疫原，包括： (a) 权利要求20所述的表位； (b) 任选其它与（a)中所述表位非天然相关的表位；及 (c) 载体。22. 编码权利要求1至8中任一项所述的抗体，或权利要求20所述的表位的分离核酸。
【专利摘要】本发明主题涉及与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株O25b抗原特异性结合的分离抗体，其医疗和诊断用途，抗体的制备方法，包括在抗体制备中使用的分离核苷酸序列、质粒和宿主细胞；进一步涉及识别所述特异性抗体的分离表位。DSM 2676220130115
【IPC分类】C07K16/12, A61K39/395, A61P31/04
【公开号】CN105120896
【申请号】CN201480004831
【发明人】E·纳吉, G·纳吉, V·西亚尔托, Z·毛焦里奇, I·米尔基娜, L·瓜查利亚, A·巴达罗, G·曹纳, J·卢卡谢维奇
【申请人】阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2014年1月17日
【公告号】CA2895327A1, EP2945651A1, US20150322138, WO2014111516A1