结果不于图6。 实施例4 :阴道pH的检杳材料
[0114] 测试了实施例1中提到的制剂B。PBS用作对照。 实验方案
[0115] 将6只雌性兔（2kg)随机分成2组（对照组中3只，处理组中3只）。使用lmL PBS或lmL制剂B清洗兔的阴道并收集分泌物用于pH测量。在给予PBS或制剂B之前进行 阴道刺激排尿。 结果
[0116] 制剂B未显著改变阴道分泌物的pH。 实施例5 :对影细朐（Ghost细朐）的毒件材料
[0117] 影R5X4(GhostR5X4)细胞获自中国北京中国科学院的组织培养库。该细胞系用 作抗HIV分析的指示细胞。使用实验方案5A测试实施例1中提到的制剂B并使用实验方 案5B测试实施例1中提到的制剂A至C。 实验方案
[0118]5A： 1. 将制剂B的连续稀释液添加至96孔板。随后添加lxlO4个影细胞/孔。各稀释都 重复三次。 2. 将细胞在37°C下孵育48小时。 3. 除去部分培养基以维持100μL7孔。添加5yLCCK8溶液并将板在37°C下孵育2 小时。 4. 在450nm处测量0D值。 5. 根据下式计算细胞活力：细胞活力=0D450样品/0D450对照（未处理的细胞）
[0119] 5B:参见实施例1中提到的实验方案 结果
[0120] 实验方案5A的结果示于图7。在等于或高于180x的稀释因子下使用制剂B时，没 有观察到细胞毒性。预测制剂B的50%细胞毒性为120x至150x的稀释因子。实验方案 5B的结果示于图8。 实施例6 :抗HIV-1活件材料
[0121] 使用实验方案6A测试实施例1中提到的制剂A至C;并使用实验方案6B至6D测 试实施例1中提到的制剂B;并使用实验方案6E测试实施例1中提到的制剂A和B。 实验方案
[0122] CNE33是使用CCR5的临床分离物（分离自一名中国患者的亚型BC重组 HIV-l(CRF)，由中国沈阳中国医药大学的商红教授（Prof.HongShang)获得）。使用的感 染性试验是标准、高灵敏度假病毒感染性试验，其测量由病毒长末端重复（LTR)控制的荧 光素酶输出，所述长末端重复的长度为约640bp并且是HIV复制循环期间针对病毒基因 表达的控制块（controlblock)(QiuΜ等（2012)PL〇SONE7(4) :e35906.doi:10. 1371/ journal,pone. 0035906;QiuM等（2012)AntiviralResearch96(2):138_147)〇
[0123] 从来自南京医科大学附属医院诊所的若干健康个体收集精液，初步筛选后三个样 品符合标准（如移动性、精液计数、不含其他感染）。
[0124] 6A： 1. 将2x104个影R5X4细胞接种至96孔板的各孔中。 2. 培养24小时后，将CNE33假型病毒储液与制剂的连续稀释液以1:1的比例混合。各 稀释都重复三次。 3. 孵育30分钟后，使用培养基（DMEM/10%FBS)将混合物稀释至80X。 4. 将50μL的稀释液悬浮至各孔。 5. 在37°C、5%C02培养箱至培养48小时后，测量荧光素酶活性。
[0125] 6B： 1. 将制剂B以4x稀释与CNE33在37°C下分别孵育5、10和15分钟。模拟孔含有培养 基代替制剂B并在37°C下孵育15分钟。 2. 移出50μL混合物并对其稀释以含有4000TCID50/mLCNE33,随后添加至lxlO4个 影细胞/孔。 3. 37°C下培养48小时后，测量荧光。
[0126] 6C:将制剂B的连续稀释液与CNE33在37°C下孵育5分钟并重复6B的剩余步骤。
[0127] 6D:在仅制剂B的处理（N)中，以1:1:1的体积比混合制剂B的多个稀释液、培养 基和病毒；在制剂B+精液处理（N+S)中，以1:1:1的体积比混合制剂B的多个稀释液、精液 和病毒。将混合物在37°C下孵育5分钟并重复6B的剩余步骤。
[0128] 6E： 1. 将2X104个细胞/孔影R5X4细胞接种至96孔培养板并将细胞在5%CO2、37°C培 养箱中培养24小时以达到90%铺满。 2. 以324x的稀释因子添加制剂A或B并将细胞处理30分钟。 3. 30分钟后，从一块板中除去制剂并使用培养基清洗细胞一次，并使另一块板维持在 制剂中。 4. 使用CNE33假型病毒储液以4000TCID50/mL的高接种感染两块板中的细胞并使感染 持续48小时。 5. 测量荧光素酶活性。 结果
[0129] 实验方案6A、6B、6C、6D和6E的结果分别示于图9、10、11、12和13。如图9所示， 制剂A至C的HIV-1抑制活性缺少剂量依赖性关系。基于图11所示的结果，制剂B的IC50 预测为约36x的稀释因子。如图12所示，存在人精液不会影响制剂B的抗病毒活性。基于 图13所示的结果，制剂A和B在非毒性浓度下抑制HIV-1感染（参见图8,其显示324x的 稀释因子下制剂A和B不显著降低细胞活力）。
[0130] 不受理论的限制，认为制剂B的抗病毒活性不可能是由于其酸性性质，因为稀释 溶液（在培养基中稀释的制剂B)的pH接近培养基的pH。 实施例7 :-个系统中毒件和抗HIV-1活件的检杳材料
[0131] CytoTox-ONE?均匀膜完整性试验购自美国普洛麦格公司（Promega)。测试了实施 例1中提到的制剂A和B。 实验方案
[0132] 通过均匀膜完整性试验测定细胞毒性，该试验测量具有受损的膜的影R5X4细胞 的乳酸脱氢酶（LDH)的释放。释放的LDH导致刃天青转化为试卤灵。荧光性试卤灵产物的 生成与LDH的量呈正比。
[0133] 具体步骤如下： 1. 对目标细胞进行细胞毒性研究以在与进行LDH释放试验所需条件相同的条件下建 立细胞毒性-制剂剂量关系曲线（具有37°C至22°C转变），并精确测定转变浓度（A点）和 CC50% (B点）。转变浓度和CC50%用于LDH释放分析。 2. 设置在相关培养基中含有细胞的透明壁化组织培养板。 3. 向适当孔中添加制剂和载剂对照使终体积为100μL/孔。分别通过转变浓度（A点） 和CC50% (Β点）测定添加的制剂的量。 4. 将细胞在37°C、5%C02培养箱中培养2小时。 5. 从37°C培养箱中移出试验板并平衡至22°C(约20-30分钟）。 6. 添加与各孔中细胞培养基体积相同体积的CytoTox-ONE试剂并混合或摇晃30秒 (例如，对96孔板格式，添加100μL的CytoTox-ONE试剂至100μL的含有细胞的培养基）。 7. 将培养板在22°C下孵育10分钟。 8. (每添加100μLCytoTox-ONE试剂）向各孔添加50μL的终止溶液。该步骤是可选 的，但推荐使用以获得一致性。 9. 将板摇晃10秒并使用560nm的激发波长和590nm的发射波长记录荧光。
[0134] 在相同的系统中，使用制剂A和B处理细胞并随后使用CNE33假型病毒储液感染 并通过测量病毒LTR控制的荧光素酶活性来测定对病毒感染性的作用。
[0135] 具体步骤如下： 1. 在单独但平行的分析中，以相同方式设置培养板并在相同条件下使用或不使用相应 制剂稀释物处理细胞。 2. 通过使用培养基清洗除去制剂或使制剂保留在培养物中。向培养板中添加假型病毒 以感染细胞并通过荧光素酶活性测量感染。 3. 对感染定量以测定各制剂对于细胞膜破坏和病毒灭活的不同作用。 4. 还使用相应浓度（转变浓度和CC50%)的制剂在与目标细胞相同的条件下处理假 型病毒，并通过超速离心或尺寸排阻凝胶过滤色谱除去制剂。随后，使用病毒感染目标细胞 并定量制剂对于病毒感染性的影响。
[0136] 各稀释重复三次并重复实验一次。 结果
[0137] -个代表性实验的结果示于图14。制剂A和B显示类似的细胞毒性概况，其中 CC50值处于128x至256x的稀释因子（预测为约192x)。在较高的浓度下（32x至128x稀 释），细胞毒性快速增加。在256x或更大的稀释因子下，与模拟处理的细胞相比细胞毒性较 低。
[0138] 在256x的稀释因子下，制剂A和B显示94. 3%和95. 6%的HIV-1感染抑制，而该 浓度下的细胞活力约为70%。在512x的稀释因子下，制剂A和B中病毒感染分别被抑制了 77. 1 %和70. 6%，而该浓度下的细胞活力高于80%。
[0139] 256x和512x的稀释因子下病毒感染的抑制不太可能是由于有活力的目标细胞减 少而导致的。不受理论的限制，可能与病毒相比，目标细胞膜对表面活性剂破坏较不敏感。 实施例8 :抗HSV-2活件材料
[0140] 测试了实施例1中提到的制剂A和B。 实验方案
[0141] 在Hec-la细胞中进行HSV-2感染和抑制试验。因此，分析了制剂A和B对Hec-la 细胞的细胞毒性。分别在制剂A或B存在的情况下，将Hec-la细胞与补充有青霉素（100单 位/ml)、链霉素（100ug/ml)和FCS(10%)的M5A培养基一起培养。根据生产商的方案使 用细胞计数试剂盒-8(美国同仁分子技术公司（DojindoMolecularTechnologies,Inc)) 测定培养24小时后的细胞活力。通过TecanT200系统测量0D405。通过膜损伤指数（MDI) 表示凝胶的细胞毒性，其计算方式为MDI(% )=(样品的0D405-模拟的0D450)/模拟的 0D450。从三个重复的测定值计算平均值和标准差。
[0142] 使用两个试验来测定制剂A和B对HSV-2感染的抑制活性。
[0143] 第一试验是细胞内Western试验。将HSV-2储液与连续稀释中的制剂A或B在室 温下孵育30分钟。在药物处理后试验HSV-2储液感染Hec-1-a细胞。培养24小时后，收获 细胞并通过细胞内Western试验分析来测定gD表达。由三个孔计算平均值和标准差。通 过gD表达水平显示HSV-2复制水平。独立地进行两次抑制试验。
[0144] 第二试验是表达荧光素酶的重组HSV-2试验。将表达荧光素酶的重组 HSV-2 (Luci-HSV-2)储液与连续稀释中的制剂A或B在室温下孵育30分钟。在药物处理后 使用Luci-HSV-2感染Vero-ICPIO细胞。在病毒不存在的条件下培养的细胞和未进行药物 处理而使用Luci-HSV-2感染的细胞被分别包括为细胞对照和病毒对照。培养24小时后，收 获细胞并测定荧光素酶活性（LA值）。抑制速率使用下式计算：抑制速率=1-[(LA样品-LA细胞对照）ALA病毒对照-LA细胞对照）]。 结果
[0145] 细胞毒性结果示于图15A和15B。细胞内Western试验结果示于图15C和15D。 表达荧光素酶的重组HSV-2试验结果示于图15E和15F。制剂A在1:64的稀释下达到 97. 3%的抑制速率，且在1:32的稀释下达到99. 8%的抑制速率。制剂B在1:4的稀释下达 到99. 8 %的抑制速率。 实施例9 :病毒的清除材料
[0146] 使用了由美国马里兰州贝塞斯达的国家癌症研究所提供的HIV毒株HTLV-IIIb和 PSR毒株BarthaK61 (杜发公司（Duphar)，韦斯普，荷兰1991)。 实验方案
[0147] 根据病毒安全性服务，最终报告5002，"液体凝胶"的病毒灭活能力的测试， Sanquin血液供应，Plesmanlaan125, 1066CX阿姆斯特丹，荷兰来进行实验。 结果