的HarlanTeklad研究用饮食）和自来水可供动物自由采食。实验在光照阶段（9 :00-15 : 00)进行。按照EuropeanCommunitiesCouncil在 1986 年 11 月 24 日批准的指南（86/609/ ECC)进行小鼠的处理，且实验协议经过Granada大学的ResearchEthicsCommittee批准。
[0206] 2.L2药物和给药
[0207] 选择性σ-1受体拮抗剂BD-1063(l-[2_(3, 4-二氯苯基）乙基]-4-甲基哌嗪） 由TocrisCookson公司（英国，布里斯托尔）提供，NE-100(N，N-二丙基-2-[4_甲氧 基-3-(2-苯基乙氧基）苯基]乙胺盐酸盐）是按照已公开的方法（Nakazato等，1999)合 成的，实施例1化合物（化合物63 ·HC1)和选择性σ1受体激动剂PRE-084[2_(4-吗啉 乙基）1-苯基环己烧羧酸酯）盐酸盐]作为实验化合物，由TocrisCookson公司（英国， 布里斯托尔）提供。盐酸吗啡（GeneralDirectorateofPharmacyandDrugs,Spanish MinistryofHealth)和吲噪美辛（西班牙，马德里，Sigma-AldrichQuimicaS.A.)分别 用作阿片类和非留体抗炎药类对照药物。除吲哚美辛外的所有药物都溶解在无菌生理盐水 中，吲噪美辛溶解在5%碳酸氢钠中（西班牙，巴塞罗那，PanreacQuimicaS.L.U.)。实验 开始前迅速配制上述药物溶液，并按5ml/kg的量将药物溶液或其溶剂经皮下注射（s.c.) 到实验动物的肩胛间区域。用来诱发膀胱炎的环磷酰胺（Sigma-Aldrich)溶解在盐水中， 并以10ml/kg的量进行腹腔内注射（i.p.)。对照组动物注射相同体积的溶剂。
[0208] 2. 2评估环磷酰胺诱发的内脏疼痛和牵涉性痛觉过敏的一般步骤
[0209] 将先前描述的实验方案（Olivar和Laird，1999;Laird等，2002;Wantuch等； 2007)进行小的修正，并按其进行环磷酰胺诱发的自发性疼痛相关行为和牵涉性机械痛觉 过敏的测试。将小鼠置于单独的透明塑料盒（7X7X13cm)中，并将上述塑料盒置于具有丝 网底板的高台上（腔室的后面和下面装有小镜子，用以加强对动物的观察）。40分钟的适应 期后，将动物从隔间移出，并注射环磷酰胺溶液（或其溶剂），然后将其立即送回隔间。在注 射环磷酰胺后的4小时观察期内，每隔半小时观察2分钟。所记录的疼痛相关行为按照以下 级别进行编码：〇=正常，1 =竖毛，2 =强烈竖毛，3 =呼吸困难，4 =舔腹部，5 =腹部拉伸 和收缩。如果在一个观察期内出现上述行为中的一种以上，分配不同类型行为的相关点数 之和；即，如果在一个观察期内发生了两个拉伸和收缩（每个5点）和一个舔腹部（4点）， 最终的分数是9点而不是14点。每个时间点的分值叠加得到总分数。在4小时观察结束 时，通过测试对腹部点状机械刺激的收缩反应来确定牵涉性痛觉过敏。所述的机械刺激通 过使用一系列刻度的vonFrey长丝（美国，加利福尼亚，Touch-TestSensoryEvaluators， NorthCoastMedicalInc.)采用上下模式（Chaplan等，1994)施加到腹部实现，施加的力 大小为0. 02-2g(0. 19-19. 6mN)。使用长丝施加三次刺激，每次施加2-3s，每次间隔5s。实 验首先使用〇. 4g(3. 92mN)vonFrey长丝，S卩范围的中间值。在每次连续测试中，如果动物 对长丝没有反应，则选择加大刺激；如果反应为阳性，则使用更弱的刺激。如果观察到实验 动物立即舔/抓施加部位、腹部强烈收缩或者跳跃，则认为对长丝的反应为阳性。
[0210] 对行为反应进行评估的实验人员并不知晓实验对象的处理情况和基因型。所有实 验，如WT或σ1-K0组、溶剂处理或环磷酰胺处理组及生理盐水处理或药物处理组的实验， 均进行平行实验。每只动物仅使用一次，并只接受单一浓度的环磷酰胺（或其溶剂）和单 一剂量的一种药物（或其溶剂）。
[0211] 2. 3髓过氧化物酶活性测定
[0212] 髓过氧化物酶（ΜΡ0)活性的变化代表多形核白细胞浸润的一种可靠指标 (Rouleau等，2000)。因此，注射环磷酰胺5小时后，将实验动物的膀胱解剖出来并用弹簧剪 刀精细地切碎。然后在0. 4ml含0. 5%十六烷基三甲基溴化铵（HTAB;Sigma-Aldrich)的 磷酸盐缓冲液（50mM，pH6)中，将其均质化。然后，将其冷冻解冻三次，离心（6000g，10分 钟），收集上清液，使用96孔板进行ΜΡ0活性测定。简言之，将50μ1上清液或者人类嗜中 性粒细胞ΜΡ0标准品（Sigma-Aldrich)加入96-孔板。加入150μ1含0. 167mg/ml邻联茴 香胺（3丨〖11^-41(11^〇11)及0.0005%过氧化氢（3丨〖1]^-41(11^〇11)的磷酸盐缓冲液，开始反应， 5 分钟后测量 450nm处的吸光度（MicroplateSpectrophotometerPowerWaveX，Bio_tek instruments.Inc)〇
[0213] 2. 4不同浓度的环磷酰胺在天然WT小鼠和σ-lKO小鼠中的效果的比较
[0214]按照上述步骤，向WT和〇 -1-K0小鼠施用不同剂量的环磷酰胺（10-300mg/kg)，连 续记录同一动物每个浓度引起的疼痛相关的行为、腹部机械刺激的牵涉性痛觉过敏和ΜΡ0 活性。形成剂量-反应曲线（剂量vs.疼痛值、机械阈值或ΜΡ0活性），并确定了用于药理 研究的环磷酰胺的最佳剂量。结果如图1和图2((A)和（B))所示。
[0215] 2. 5对WT小鼠和〇耶小鼠中由环磷酰胺诱发的内脏疼痛和ΜΡ0上升的药效比较
[0216] 为评价药物对于环磷酰胺诱发的内脏疼痛的效果，进行了多种剂量的不同σ-1 受体拮抗剂（图4)和对照药物（图5)对疼痛行为值、牵涉性痛觉过敏和ΜΡ0活性的 影响测试。因此，在实验动物腹腔内注射环磷酰胺2小时后，皮下注射施加不同剂量的 BD-1063 (16-64mg/kg)(图 4)、实施例 1 化合物（32-128mg/kg)(图 4)、NE-100 (16-64mg/kg) (图4)、吗啡（l-8mg/kg)(图5)、B引噪美辛（2-8mg/kg)(图5)、或其溶剂，并在2小时内每 隔30分钟进行疼痛行为值的记录。为测试药物对疼痛相关行为的影响，施加300mg/kg的 环磷酰胺。选取该浓度下的环磷酰胺，是因为其可在WT小鼠中产生最大疼痛值（见图1)， 并因此为观察该反应的任何减轻情况提供最大的窗口。在单独实验中，我们检测了相同剂 量的σ:受体拮抗剂和对照药物对环磷酰胺诱发的牵涉性痛觉过敏的效果。在上述实验中， 环磷酰胺的剂量为l〇〇mg/kg，是因其可使WT小鼠和σfKO小鼠的牵涉性痛觉过敏的机械 阈值达到最大降低程度（见图6)。在这些实验中，腹腔内注射给药环磷酰胺2小时后，进 行研究的药物或其溶剂的皮下注射，且2小时后（即注射环磷酰胺4小时后）按一般步骤 所述使用vonFrey长丝以上-下模式进行实验动物的腹部刺激，记录动物的反应（见图7 和8)。行为测试结束（环磷酰胺给药5小时后）后，处死动物，并切除膀胱以测定MP0活性 (图9、图10和图11)。
[0217] 为了评估通过实施例1对吗啡对牵涉性痛觉过敏的影响的可能调控，将动物按 100mg/kg的量进行环磷酰的腹腔内注射，并在115分钟后注射实施例1化合物（32mg/kg， s.c.)或生理盐水，5分钟后使用吗啡（lmg/kg，s.c.)或生理盐水处理该动物，并在此次注 射2小时后按前述步骤进行牵涉性痛觉过敏的评估。为了检测 〇1-受体在实施例1化合 物-吗啡的相互作用中的作用，在注射实施例1化合物前5分钟注射PRE-084 (32mg/kg， s.c.)(图 12) 〇
[0218] 2. 6统计分析
[0219] 牵涉性疼痛的程度，以产生50%响应的机械阈值表示，其计算公式为Dixon公式 (1980):50%机械阈值&) = [(10°^5)/10.000]，其中&=最终使用的乂〇1^代7长丝的 值（对数单位）；κ=阳性/阴性反应模式的表值；δ=刺激间的平均差（对数单位）。
[0220] 进行Bonferroni校正后，利用单因素或双因素方差分析（AN0VA)对各实验组间 进行平均值的比较，或使用SigmaPlot12. 0程序（美国，加利福尼亚州，圣荷西，Systat SoftwareInc.)进行t-检验来比较2个平均值。P〈0. 05被认为统计学显著。
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