培养；
[0158] (4)成骨诱导培养条件，在PLGA/TCP/葛根素支架材料上培养。
[0159] 之后用胰酶把支架上的细胞消化下来，于lOOOrpm离心4min，弃去上清，加入50ul 细胞裂解液，按AxyGen的RNA提取试剂盒说明书提取RNA，保存于一 40度冰箱，待测成骨相关 基因（BSP，0PN，0sterix)水平，结果见图4~图6。
[0160] 由图4~图6可看出，与不含葛根素的支架材料组(PLGA/TCP，PT)相比，含有葛根素 的支架材料组(PLGA/TCP/葛根素，PTG)显著促进成骨分化基因 Osterix及矿化相关基因0ΡΝ 和BSP的mRNA的表达水平，提示在基因水平含有葛根素的支架材料可以促进成骨分化。
[0161] 实施例14
[0162] 本发明生物复合材料浸提液促进钙结节形成试验
[0163] 材料浸提液的收集:紫外灭菌的材料，用PBS清净后，每单个支架置于1.5mL的无菌 EP管内，于lml未含血清的a-MEM中浸泡24小时，弃去首次浸泡培养基，更换成lml含血清的 a-MEM中浸泡24小时，收集二次浸泡培养基，再更换成lml含血清的a-MEM中浸泡24小时，收 集三次浸泡培养基。收集的培养基置于4度冰箱备用。
[0164] 将MC 3T3-E1细胞接种至6孔板，以α -MEM培养基正常培养，长满后，分别以：
[0165] (1)成骨诱导培养条件(含有10%FBS的a-MEM培养基培养里包含50ug/ml维生素 C， 10mM beta-磷酸）；
[0166] (2)成骨诱导培养条件，加入PLGA/TCP支架材料的10 %浸提液；
[0167] (3)成骨诱导培养条件，加入本发明生物支架材料的10%浸提液；
[0168] (4)成骨诱导培养条件，加入PLGA/TCP/淫羊藿素支架材料的10 %浸提液。
[0169] 培养5天，每隔两天更换一次培养液，弃去上清，加入中性福尔马林固定30min， ddH20洗净，加入1 %茜素红染液染色30min，洗净，拍照，结果见图7所示。
[0170] 由图7结果发现，与不含有葛根素的支架材料组(PLGA/TCP，PT)相比，含有葛根素 的支架材料组(PLGA/TCP/葛根素，PTG)的24h浸提液可以显著促进成骨细胞矿化，而含有淫 羊藿素的支架材料组(PLGA/TCP/淫羊藿素，PTI)的24h浸提液则未促进成骨细胞矿化，提示 葛根素在24h就已经释放并可发挥促成骨的生物学效应，而淫羊藿素在短期内则不能发挥 其生物学活性。含葛根素的复合支架材料的这一特性对于在支架植入早期需提供促成骨生 长因子的状况尤为重要。
[0171]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
【主权项】
1. 一种生物复合材料，其特征在于，所述生物复合材料包含有效量的中药活性物质，所 述中药活性物质包含葛根素、淫羊藿素、染料木素、姜黄素、柚皮苷、柚皮素、白藜芦醇、葛根 提取物、淫羊藿提取物、姜黄提取物中的至少一种。2. 如权利要求1所述的生物复合材料，其特征在于，所述中药活性物质包含葛根素、染 料木素、姜黄素、柚皮苷、柚皮素、白藜芦醇、葛根提取物、淫羊藿提取物、姜黄提取物中的至 少一种。3. 如权利要求2所述的生物复合材料，其特征在于，所述中药活性物质包含葛根素、姜 黄素、柚皮苷、葛根提取物、姜黄提取物中的至少一种。4. 如权利要求1或2或3所述的生物复合材料，其特征在于，所述生物复合材料还含有生 物可降解高分子、仿生磷灰石中的至少一种。5. 如权利要求4所述的生物复合材料，其特征在于，所述生物可降解高分子为医用天然 高分子、合成高分子中的至少一种;所述医用天然高分子包括壳聚糖、海藻酸钠、甲基纤维 素;所述合成高分子包含聚乳酸、聚乙交酯、聚酸酐、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮、 聚己内酯、静电纺丝膜、生物降解纤维、聚乳酸/乙醇酸共聚物。6. 如权利要求4所述的生物复合材料，其特征在于，所述仿生磷灰石为磷酸三钙、羟基 磷灰石中的至少一种。7. 如权利要求4所述的生物复合材料，其特征在于，所述生物复合材料包含生物可降解 高分子、仿生磷灰石和中药活性物质，且所述生物可降解高分子为聚乳酸/乙醇酸共聚物、 聚乳酸、壳聚糖中的至少一种，所述仿生磷灰石为磷酸三钙，所述中药活性物质为葛根素、 姜黄素、柚皮苷、葛根提取物、姜黄提取物中的至少一种。8. 如权利要求7所述的生物复合材料，其特征在于，所述生物可降解高分子与仿生磷灰 石的质量比为9:1~6:4。9. 如权利要求8所述的生物复合材料，其特征在于，所述生物可降解高分子与仿生磷灰 石的质量比为8:2~7:3。10. 如权利要求1~9任一项所述的生物复合材料，其特征在于，所述中药活性物质在所 述生物复合材料中的质量百分含量不大于5%。11. 如权利要求10所述的生物复合材料，其特征在于，所述中药活性物质在所述生物复 合材料中的质量百分含量为1~4%。12. -种如权利要求1~11任一项所述生物复合材料的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： (la) 将生物可降解高分子溶于第一有机溶剂中； (2a)将中药活性物质溶于与所述第一有机溶剂相同或第二有机溶剂中或制备成微球 或纳米粒； (3a)将步骤(2a)所得溶液加入到步骤（la)所得溶液中，制得包含生物可降解高分子和 中药活性物质的浆料； (4a)利用快速成型技术使步骤(3a)中的浆料成型，得到所述生物复合材料;或者 (lb) 将中药活性物质溶于有机溶剂中或制备成微球或纳米粒； (2b)在步骤（lb)所得溶液中加入仿生磷灰石，制得包含中药活性物质和仿生磷灰石的 浆料； (3b)利用快速成型技术使步骤(2b)中的浆料成型，得到所述生物复合材料;或者 (lc)将生物可降解高分子溶于第一有机溶剂中； (2c)将中药活性物质溶于与所述第一有机溶剂相同或第二有机溶剂中或制备成微球 或纳米粒； (3c)将步骤(2c)所得溶液加入到步骤（lc)所得溶液中，然后加入仿生磷灰石，混匀，制 得包含生物可降解高分子、中药活性物质和仿生磷灰石的浆料； (4c)利用快速成型技术使步骤(3c)中的浆料成型，得到所述生物复合材料。13. 如权利要求12所述生物复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2a)、（lb)和 (2c)中的微球采用以下方法制备而成:配制浓度为1 %的PVA17-88的水溶液，取PLGA和葛根 素溶于氯仿中，将含有PLGA和葛根素的氯仿溶液加入配制的PVA17-88的水溶液中，所述 PVA17-88的水溶液的体积是含有PLGA和葛根素的氯仿溶液体积的25倍，加完后，搅拌，待氯 仿挥发完后，取溶液高速离心，加适量蒸馏水分散后，冻干，即得葛根素微球。14. 如权利要求12所述生物复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2a)、（lb)和 (2c)中的纳米粒采用以下方法制备而成:将PLGA溶解于乙酸乙酯中，然后加入含有葛根素 的PVA水溶液中，在室温下对混合液进行超声，离心分离后，过量的溶剂在持续搅拌下蒸发， 分离得到的纳米粒经PBS洗涤3次，并悬浮在水中进行冷冻干燥，即得葛根素纳米粒。15. -种人工骨支架，其由权利要求1~11任一所述的生物复合材料制备而成，所述人 工骨支架具有三维多孔结构。16. 如权利要求15所述的人工骨支架，其特征在于，所述人工骨支架的孔径为250~450 μπι，孔隙率为60 %-80 %。
【专利摘要】本发明公开用于骨缺损修复的生物复合材料，所述生物复合材料包含有效量的中药活性物质，所述中药活性物质包含葛根素、淫羊藿素、染料木素、姜黄素、柚皮苷、柚皮素、白藜芦醇、葛根提取物、淫羊藿提取物、姜黄提取物中的至少一种。本发明所述生物复合材料，采用含有特定成分的中药活性物质作为促进骨生长的生长因子，来源广泛，价格低，结构及理化性质稳定，将中药活性物质或中药活性物质的微球或纳米粒均匀分散在支架材料中，使用时，中药活性物质或中药活性物质的微球或纳米粒从支架材料中持续释放，长期在骨缺损局部保持疗效，促进骨生长。同时，本发明还公开了一种所述生物复合材料的制备方法以及由所述生物复合材料制备而成的人工骨支架。
【IPC分类】A61L27/54, A61L27/56, A61L27/12, A61L27/36, A61L27/50
【公开号】CN105727374
【申请号】CN201610084819
【发明人】王新峦, 秦岭, 赖毓霄, 曹会娟, 李玲, 李龙, 成文翔, 张鹏
【申请人】中国科学院深圳先进技术研究院
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2016年2月14日