牛蒡子提取物及其制备方法与在抑菌中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种牛蒡子提取物，其制备方法为：取牛蒡子，粉碎；按固液比1:6～10的比例加入65～80％乙醇溶液，60℃±5℃水浴中浸提1.5～2.5小时，抽滤，滤渣在同样条件下再浸提1.5～2.5小时，抽滤；合并两次的滤液，蒸发浓缩，加入无水乙醇，密封静置18～24小时，再次抽滤，冷冻干燥得粉末，即为牛蒡子提取物。实验证明，本发明的牛蒡子提取物对大肠杆菌O157：H7、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、耶尔森氏菌属、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等各种食源性致病菌均具有显著的抑制作用，可以用于制备抑菌制剂。
【专利说明】
牛蒡子提取物及其制备方法与在抑菌中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及牛蒡子提取物，及其制备方法，以及其在抑菌中的应用。
【背景技术】
[0002] 牛蒡作为一种在野外自然生长的稀有植物，之前很少有研究者去关注它，因此，几 乎没有被人研究其成分，也没有人知道它的价值，对它的开发以及利用就更是少之又少了。 但是，随着现代科学的发展，人们对牛蒡的研究也在不断地深入，它的营养及药理价值也逐 渐地被人们所了解，牛蒡也渐渐地得到了大面积的种植，在我国，牛蒡的种植面积已经高达 2.33多万公顷。
[0003] 牛蒡子是牛蒡成熟后经过干燥的种子，最早在《本草图经》中曾有记录，它有很多 别称，如大力子、恶实、蝙蝠刺、夜叉头等。牛蒡在东北三省的产量非常大，被人们称为"关力 子"，它在全国各地均有销售，甚至有的出口国外。产者质佳的属浙江桐乡，称作"杜大力"， 主要销往浙江和江苏。其它的产地大多是自产自销。国外主要分布在欧洲、日本、阿富汗、印 度、伊朗等国。
[0004] 牛蒡子中含有多种营养成分，罗永明等对牛蒡子中的挥发油成分进行了详细的实 验研究以及分析，其结果显示了其中含有66物质，大约在挥发油总量的比例中占90.8%，主 要物质组成是S-胡薄荷酮和R-胡薄荷酮，S-胡薄荷酮含量为7.59%，R-胡薄荷酮的含 量为17.38%。牛蒡子中含量最多的是木脂素，牛蒡苷、罗汉松酯素、牛蒡苷元以及拉帕酚素 等都属于木脂素，这些成分中含量最高的是牛蒡子苷，其分解后的最多的物质是牛蒡子苷 元。除了以上成分外，牛蒡子中的营养成分还有蛋白质和油脂等成分，蛋白质的含量大约有 24.7 %，油脂的含量大约有26.1 %。油脂中的成分也是多样的，有棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚 麻酸、亚油酸等，这些成分物质中，亚油酸的含量最高，其次是油酸和亚麻酸，并且这些油脂 中不饱和脂肪酸的含量非常高，就亚油酸而言已经占一半以上了。
[0005] 现代科学研究表明，牛蒡子具有多种药理作用和临床应用，简介如下：
[0006] ( - )抗肿瘤作用
[0007] (1)抗乳腺癌作用
[0008] Hirose等进行哺乳动物的乳腺癌诱发的实验研究，其结果显示，空白组和给使用 牛蒡子实验组的哺乳动物相比较，在乳腺癌诱发率上的差异几乎是有，但是对其有明显的 降低作用的是在发病的多样性和复杂性上。
[0009] (2)抗皮肤癌作用
[0010] Takasaki M等对牛蒡子进行了一系列的实验，对其牛蒡子苷元和牛蒡子苷做了很 好的研究，尤其是对其抗癌效果及作用做了详细的研究，最终得出的结论是牛蒡子苷不具 有生物活性，然而牛蒡子苷元却具有生物活性。
[0011] (3)抗肝癌作用
[0012] Kato T等也对牛蒡子进行了一系列的实验研究，最终研究结果显示牛蒡子苷对肝 脏的癌变具有一定的保护作用，只不过其作用非常的微弱。然而Moritani S等也对抗肝癌 做过研究，它在实验中得出对小鼠的肉瘤细胞以及人肝癌细胞，牛蒡子苷元和牛蒡子苷它 们两个均表现出了很强的毒性，然而对肝肠的细胞而言，几乎没有表现出其毒性，通过体内 试验研究，结果表明，牛蒡子的浸膏所具有的活性和牛蒡子苷元的所具有的抗肝癌的活性 相互比较而言，他们几乎是一样的，对抗肝癌的效果研二，它们所具有的这种活性成分是非 常有用的。
[0013] ⑷抗白血病作用
[0014] 米靖宇等通过使用MTT的研究方法对牛蒡子苷元和牛蒡子苷的抗白血病是否具有 活性进行研究。最终的结论是牛蒡子苷对抗白血病没有很好效果，然而牛蒡子苷元的实验 结果与其恰好相反，它对白血病的细胞株的抑制活性非常好，和目前医院所对白血病人使 用的一些抗白血病的药物的药性相比较，发现和他们的活性几乎差不多。而且还做染色排 除的一些试验研究，最终可发现牛蒡子苷元对HL-60细胞的生长的抑制，是以无毒的机理来 进行的，可能真正起作用的是它可以使白血病的细胞停止合成DNA和RNA以及相关蛋白质。
[0015] (二)抗糖尿病作用
[0016] 贺学林等也对抗糖尿病做了相关的实验，主要研究的是对患糖尿病大鼠肾脏的早 时期所存在的病变，牛蒡子是否对此具有一定的防治作用。研究最后看出对患糖尿病的大 鼠，牛蒡子可以对其的一些症状有非常显著的缓解，肾重与质量之间的比值都有所减少，而 且还减少了尿白蛋白的排出比率，对肾脏的病理性伤害有了很大程度上的降低。所有的实 验数据分析显示，在某种程度上对糖尿病早时期肾脏的防治有很好的效果。
[0017](三)免疫调节及抗炎的作用
[0018] 牛蒡子苷元对肿瘤坏死的因子的产生的研究分析，以及对淋巴的增殖和免疫的调 节作用的研究分析，发现牛蒡子苷元能够对干扰素-γ的信号所导致的NO释放起到一定程 度的抑制作用，但是对脂多糖引起的产生的NO有非常的增大。最后的研究结论分析，牛蒡子 苷元对一些活性巨噬细胞以及一些淋巴细胞的增殖，可能是用调节其免疫应答来进行起作 用的。
[0019] (四）抗病毒的作用
[0020] (1)抗HIV-I 的作用
[0021]在体内试验时，最后结论显示了对已经感染了HIV-I病毒的人体细胞体系中的病 毒应答，牛蒡子苷元对其是作为一种抑制剂。在别的实验研究中，在体外的牛蒡子苷元显示 出一种非常强烈的抑制效果，是在对HIV-I病毒蛋白的表达方面;也对其分子存在的机理做 了详细的研究，目前人们认为有关活性抑制剂应该是核基质，认为被病毒感染的细胞的酶 抑制的活性更强。
[0022] (2)抗流感的作用
[0023]高阳等人对ARC-G做了一些实验，其研究在抗甲I型流感病毒的方面，结果发现了 ARC-G对离体的胸主动脉、大鼠气管及豚鼠的气管有一定的松弛作用，是因为抑制了细胞外 的钙向内流入，细胞内的钙进行释放而引起的，牛蒡子在体外有很强的抗甲I流感病毒的作 用。
[0024]牛蒡子的临床应用，简介如下：
[0025] ( - )风热感冒
[0026] 牛蒡子与桔梗、金银花、薄荷、连翘、甘草等可以一同被人们所食用，对疏散身体的 风热以及宣清肺利咽喉有很好的治疗效果，常用于对风热引起的感冒以及咽喉肿痛等症状 的治疗。
[0027] (二)肺热喘咳、阴虚火旺
[0028] 牛蒡子与麻黄、杏仁、石膏、黄芩等辛凉清肺药物一同被食用，能够很好的宣肺利 膈、祛痰止咳，对肺热而引起的喘咳症状的疗效很好。牛蒡子与一些合适的药物相搭配食 用，对经常咳嗽并且气喘不断、阴虚火旺等这类症状具有非常好的疗效。
[0029](三)鼻窍不通
[0030] 牛蒡子具有疏散风热、辛凉解表、解毒利咽、消肿等相关功效，可单一食用或者与 其他药物搭配，对各种鼻炎以及鼻窦炎都有非常不错的治疗效果。
[0031] (四）痄腮喉痹、痈肿疮毒
[0032] 牛蒡子能够对外扩散其热量、对内排除其毒素、清热身体多余的热量，对身体的毒 素有解除作用，因此能够对风热的外部袭击、毒火在内淤结所带来的痈肿疮毒的症状，它可 以对其有很好的改善作用。牛蒡子和一些适宜的药物一起被人们食用，对痄腮、喉痹都有一 定的治疗效果。
[0033](五）神经病变
[0034] 牛蒡子的功效很多，如果头面部位有了风火，它可以帮助其得以上宣下泄、顺畅调 节气血、邪火也有了排除的通道。牛蒡子与其他的一些药物在一起相互组合食用，对周围性 的神经性麻痹症状和三叉神经疼痛症状都可以起到治疗的作用。
[0035] (六)小儿流涎
[0036] 有人曾经用牛蒡子与其他疗效相近的药物组合，牛蒡子通过炒至焦，并且和这些 药物一起熬煎，把其当作茶水给一个大约2岁左右的小孩来饮用，用到两付此药，小孩的流 涎之症状被治疗并且痊愈。
[0037](七)小儿积滞
[0038]曾有人给一个因为厌食而拒绝食用食物的3岁小男孩进行了治疗，他只用牛蒡子 一种药物，将其炒至表皮变的焦黄，然后加水煎熬，小孩将其食用了一天，然后重新去医院 复查，发现腹胀已经被消除了。
[0039](八)便秘
[0040]牛蒡子具有降气下行、润肠通便等功效，可用于治疗习惯性便秘、血虚便秘、气滞 便秘等症状。对于咽喉肿痛、痈肿疮疡、风热痒疹等病症所引起的大便干结，造成便秘，可以 与连翘、浮萍等药物一起煎药食用。
[0041]植物源杀菌剂，是目前的研究热点之一，开发一种新型的植物源杀菌剂具有重要 的价值和意义。
【发明内容】
[0042]针对上述现有技术，本发明制备了牛蒡子提取物，并对牛蒡子提取物的抑菌性能 进行了研究。本发明为天然性植物抑菌剂的研究提供了理论和实践的依据，对于新型天然 抑菌先导化合物的研究提供了理论依据，研究结果对其具有一定的理论价值。
[0043] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0044] 牛蒡子提取物，是通过以下方法制备得到的：取牛蒡子，粉碎；按固液比1:6~10 (单位g:ml)的比例加入65~80 %乙醇溶液(体积百分数），60 °C ± 5°C水浴中浸提1.5~2.5 小时，抽滤，滤渣在同样条件下再浸提1.5~2.5小时，抽滤;合并两次的滤液，40°C以下蒸发 浓缩，加入无水乙醇，密封静置18~24小时(沉淀糖），再次抽滤，得牛蒡子提取液，冷冻干燥 得粉末，即为牛蒡子提取物。
[0045] 优选的，粉碎至颗粒直径在0.1_。
[0046] 所述牛蒡子提取物，在抑制大肠杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、耶尔森氏菌、 肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或/和副溶血性弧菌中的应用。
[0047] 所述牛蒡子提取物，在制备抑制大肠杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、耶尔森 氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或/和副溶血性弧菌的制剂中的应用。
[0048] 本发明以牛蒡子为原料，采用滤纸片法、96孔板法和菌落总数法对牛蒡子提取物 抑菌作用进行了初步研究，同时用牛津杯法研究了紫外照射、PH值、热处理、金属离子对提 取物抑菌性能的影响。研究结果显示，牛蒡子提取物对大肠杆菌〇157:H7、铜绿假单胞菌、单 增李斯特菌、耶尔森氏菌属、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等各种食源性 致病菌均具有显著的抑制作用。以单增李斯特菌、大肠杆菌0157 :H7、肠炎沙门氏菌和金黄 色葡萄糖菌为受试菌，PH对牛蒡子提取液的抑菌效果没有显著的影响，经60°C处理30min、 121°C高压处理15min，提取物仍均有明显抑菌效果，紫外照射15min，30min，以及加入不同 金属离子后，提取物仍有较显著的抑菌效果。结论:牛蒡子具有良好的抑菌效果和抑菌稳定 性。
【附图说明】
[0049] 图I :pH对提取物抑菌效果的影响。
[0050] 图2:热处理对提取物抑菌效果的影响。
[0051 ]图3:紫外照射对提取物抑菌效果的影响。
[0052]图4:金属离子对提取物抑菌效果的影响。
【具体实施方式】
[0053]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0054]下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检 测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0055]实施例1牛蒡子提取物的抑菌作用研究 [0056] 1 · 1实验材料
[0057] 1 · 1 · 1实验原料
[0058] 柳川理想牛蒡子，购买于江苏省徐州市丰县。
[0059] 1.1.2供试菌种:如表1所示。
[0060] 表1供试菌种
[0066] 1.1.4实验仪器:如表3所示。
[0067]表3实验仪器
[0070] 1.2实验方法
[0071] 1.2.1牛蒡子提取液的制备
[0072] 取足够量的干燥柳川理想牛蒡子，用粉碎机粉碎至粉末状（用粉碎机粉碎到颗粒 直径在0.1mm;颗粒太大，提取率不高，也不利于有效成分溶出；颗粒太小，各种杂质的溶出 度也会增高，而且不利于过滤、浓缩和分离）；称取30克粉末状的牛蒡子，用量筒准确量取 240mL70 %乙醇，加入500mL烧杯中，配成料液比为1:8的混合液，于60°C水浴中浸提2h(在浸 提时注意密封防止乙醇挥发）后抽滤，滤渣在同样条件下再浸提2h，合并两次滤液，40°C以 下于旋转蒸发仪中蒸发浓缩（真空度为O.IMPa，温度为35°C)，至50mL后加入无水乙醇 400mL，密封静置18~24h沉淀糖，再次抽滤，所得液体即为牛蒡子提取液，先放在冰箱冷冻 至固体，再放于冷冻干燥机里冷冻干燥24h至干燥粉末，保持干燥，保存备用。
[0073] 1.2.2菌悬液的制备
[0074]所有供试菌种在含有20 %甘油的TSB甘油管中，放于-20 °C冰箱中冷冻保存。实验 时，取出TSB甘油管放于在无菌操作台中，用无菌移液枪从其中取其原菌液，将其接种于已 制备好的无菌TSB的试管中，对于每种受试菌分别接于两支试管，将其置于37°C的生化恒温 培养箱中，培养18~24h。然后挑选取出菌液生长较好的试管，使用划线方式接种于TSA中， 置于37°C培养箱中培养18~24h，然后挑取其中生长较好的单菌落，将其接种于装有TSB的 试管中培养18~24h，然后保存在4°C冰箱中。每次实验时取0.5mL菌悬液于装有4.5mL无菌 生理盐水的试管中，稀释10倍，使其菌液浓度约保持在IO 8CFUAiL~109CFU/mL。
[0075] 1.2.3最大抑菌圈直径
[0076] 该实验采用滤纸片法测定最大抑菌圈直径。首先，菌悬液的涂布，将TSB培养基倒 于培养皿中，待其完全冷却凝固后，将培养好的新鲜菌液，稀释三个梯度，用移液枪分别移 取IOOyL菌悬液，用涂布器将其在平皿培养基上均匀涂布。其次，滤纸片的贴放，将无菌并在 lOmg/mL牛蒡子提取液中浸泡6h后的滤纸样片用无菌镊子贴放于培养基表面，每个平板均 匀的贴放5片滤纸片，然后用无菌镊子轻轻倾乳样片，使其紧贴于平皿培养基表面。每个样 品做三个平行，实验重复三次，盖好平皿，放于37°C培养箱中培养18~24小时观察结果。最 后，最大抑菌圈直径的测量，采用十字交叉法，测量抑菌圈的直径，使用直尺(包括贴片直径 6mm)，并记录实验数值，取平均值。
[0077] 1.2.4最低抑菌浓度
[0078]用二甲基亚讽配制成 10mg/mL、5mg/mL、2 · 5mg/mL、1 · 25mg/mL、0 · 625mg/mL、 0 · 3125mg/mL、0 · 15625mg/mL、0 · 07815mg/mL的牛蒡子提取液。用TSB将新鲜培养的大肠杆菌 0157:H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌浓度分别稀释至61og CFU/mL。于 96孔板各孔中分别加入受试TSB菌液20uL，20uL牛蒡子二甲基亚砜提取液和120mLTSB，每个 浓度做三个平行实验，96孔板置于37 °C培养24h后，在每个孔中加入4(^浓度为0.4mg/mL碘 硝基四唑紫（INT)，之后于37°C培养40min后记录各提取物最低抑菌浓度(如样液显示红色 则表示其无抑菌作用）。
[0079] 1.2.5菌落总数的测定
[0080]以新鲜培养的大肠杆菌0157: H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌 为受试菌，分别接种各病原菌〇.5mL(5-61og CFU/mL)于生理盐水中，使抑菌体系中微生物 初始浓度约为4_51og CFU/mL。加入50mg提取物粉末，使提取物浓度为5mg/mL，同时做一组 空白实验。各培养液分别于0、1、3、5、7、12和24h测定菌落总数。在每个测定时间点，各取 0.5mL培养液采用生理盐水行系列梯度稀释，然后取IOOyL各适宜浓度稀释液涂布于与其相 应培养基平板，置于37°C培养箱中培养12~24h，菌落总数计数法测定各培养液中的微生物 浓度。每个提取液实验浓度做3个平行，每个实验重复3次。
[00811 1.2.6 pH值对提取物抑菌效果的影响
[0082] 分别用柠檬酸和氢氧化钠配制pH = 3 · 5、4 · 8、8 · 3、9 · 9的二甲基亚砜溶液和5mg/mL 二甲基亚砜提取液。用TSB将新鲜培养大肠杆菌0157: H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金 黄色葡萄球菌浓度分别稀释至61og CFU/mL。在无菌操作环境下，将TSA固体培养基倒入培 养皿，用移液枪分别移取各菌悬液100μΙ，涂布器涂布均匀。采用牛津杯法，将牛津杯消毒杀 菌后每个培养皿加4个牛津杯，将上述溶液用移液器移入IOOuL于牛津杯中，盖好培养皿，每 个平板做三个平行实验，放入37°C培养箱中培养18~24小时观察结果。
[0083] 1.2.7热处理对提取物抑菌效果的影响
[0084] 将5mg/mL牛蒡子二甲基亚砜提取液分别在60 °C下热处理30min和121°C高压热处 理15min，用TSB将新鲜培养大肠杆菌0157: H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球 菌浓度分别稀释至61og CFU/mL。在无菌操作环境下，将TSA固体培养基倒入培养皿，用移液 枪分别移取各菌悬液100μΙ，涂布器涂布均匀。采用牛津杯法，将牛津杯消毒杀菌后每个培 养皿加4个牛津杯(注意做一个二甲基亚砜的和没有处理过的牛蒡子提取液的对照实验）， 将上述溶液用移液器移入IOOuL于牛津杯中，盖好培养皿，每个平板做三个平行实验，放入 37 °C培养箱中培养18~24小时观察结果。
[0085] 1.2.8紫外照射对提取物抑菌效果的影响
[0086]在无菌操作环境下，将5mg/mL牛蒡子二甲基亚砜提取液在紫外灯下分别照射 15min，30min，用TSB将新鲜培养的大肠杆菌0157: H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色 葡萄球菌浓度分别稀释至61og CFU/mL。在无菌操作环境下，将TSA固体培养基倒入培养皿， 用移液枪分别移取各菌悬液1〇〇μ1，涂布器涂布均匀。采用牛津杯法，将牛津杯消毒杀菌后 每个培养皿加3个牛津杯，将上述溶液用移液器移入IOOuL于牛津杯中，盖好培养皿，每个平 板做三个平行实验，放入37 °C培养箱中培养18~24小时观察结果。
[0087] 1.2.9金属离子对提取物抑菌效果的影响
[0088] 实验前配制二甲基亚砜、5mg/mL的二甲基亚砜提取液、提取液Na'提取液Ca2+提取 液Fe3+、提取液Zn2+等六份溶液，在无菌操作环境下，将TSA固体培养基倒入培养皿，用移液 枪分别移取各菌悬液100μΙ，涂布器涂布均匀。采用牛津杯法，将牛津杯消毒杀菌后每个培 养皿加6个牛津杯，将上述六份溶液用移液器移入IOOuL于牛津杯中，盖好培养皿，每个平板 做三个平行实验，放入37°C培养箱中培养18~24小时观察结果。
[0089] 2结果与分析
[0090] 2.1牛蒡子提取物对食源性致病菌的抑制作用
[0091 ] 2.1.1牛蒡子提取物对食源性致病菌的最大抑菌圈直径:如表4所示。
[0092]表4牛蒡子提取物对食源性致病菌最大抑菌圈直径
[0095]从表4中可以看出，不同浓度牛蒡子提取液对各种食源性致病菌的生长均表现出 良好抑制作用，也可以看出对不同菌有着不同的抑制效果。抑制效果最好的是G+单增李斯 特菌的最大抑菌圈直径为22.3mm，其次G-大肠杆菌0157:H7的最大抑菌圈直径为22.9mm，对 G-恶臭假单胞菌、G-铜绿假单胞菌、G-耶尔森氏菌属抑菌效果很微弱，然而对G+的食源性致 病菌在一定程度上均有较好的抑制效果，通过实验数据看出G+和G-的各种食源性致病菌的 抑菌效果参差不齐。整体来说牛蒡子提取液对G+菌属的抑制效果优于对G-。
[0096] 2.1.2牛蒡子提取物对食源性致病菌的最低抑菌浓度
[0097]选择食品中最常见的大肠杆菌0157 : H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡 萄球菌4种菌为受试菌，进行MIC实验:结果如表5所示。
[0098]表5牛蒡子提取物对食源性致病菌的最低抑菌浓度
[0100]通过实验数据得出：牛蒡子提取液对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，MIC为 0.3125mg/mL。其次为单增李斯特菌，MIC为2.5mg/mL。大肠杆菌0157 :H7和肠炎沙门氏菌抑 制效果最差，MIC为5mg/mL。
[0101] 2.1.3菌落总数法测定其抑菌效果
[0102] 选择食品中最常见的大肠杆菌0157 :H7、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌3种菌为 受试菌，进行实验:结果如表6所示。
[0103] 表6菌落总数的测定
[0105] 从上表实验数据分析得出：在空白实验的对照下，除去菌的自然死亡，牛蒡子提取 物对大肠杆菌抑制效果最好，其次是金黄色葡萄球菌。可得出牛蒡子提取液内含有抑菌活 性物质。
[0106] 2.2牛蒡子提取物的抑菌稳定性
[0107] 2.2.1 pH对提取物抑菌效果的影响
[0108] 选取大肠杆菌0157 :H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌这四种菌 为受试菌，将相同PH值下二甲基亚砜溶液与牛蒡子提取物的抑菌效果做比较，结果如图1所 示。通过空白对照实验，pH=3.5对于四种提取液抑菌有一定的促进作用，pH=4.8对大肠杆 菌0157 :H7和肠炎沙门氏菌抑制效果不明显，pH=8.3对抑菌略微有促进作用，pH=9.9对抑 菌效果略微有抑制作用。通过最大抑菌圈直径法，从数据中可以得到牛蒡子提取物对各致 病菌的抑制作用并不仅仅是PH值的影响，原因是提取液中的活性物质发挥了抑菌作用。
[0109] 2.2.2热处理对提取物抑菌效果的影响
[0110] 结果如图2所示。牛蒡子提取物经60°C下热处理30min与空白实验做对照后看出其 仍具有较好的抑菌活性，且与未经处理的提取物抑菌效果相当，与对照组相比较，其可以明 显抑制大肠杆菌0157 :H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的生长。牛蒡叶提取 物经121°C高压热处理15min后，与对照组相比较，其抑菌活性略有下降，但仍能明显的抑制 大肠杆菌〇157:H7、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的生长。以上实验结果 表明牛蒡叶提取物具有较好的热稳定性。
[0111] 2.2.3紫外照射对提取物抑菌效果的影响
[0112] 如图3所示。结合图形，可以看出牛蒡子提取物在紫外灯下分别照射15min，30min 之后其抑菌效果还是很好，尤其是对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的抑制作用几乎是没 有任何影响的，与未经处理的提取物抑菌效果差不多一致。整体来说，牛蒡子提取物在紫外 照射后，仍可明显的抑制大肠杆菌0157 :H7、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特 菌。以上结果表明，紫外照射对提取物抑菌效果没有显著性影响。
[0113] 2.2.4金属离子对提取物抑菌效果的影响
[0114]在牛蒡子提取物中分别加入金属离子Na+、Ca2+、Fe3+、Zn2+，实验发现其抑菌活性在 不同程度上都有所变化（如图4所示），与对照组相比较，可以非常明显表现出对大肠杆菌 0157:H7、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的影响，虽然影响程度大小不一。 Na+对四种菌的抑菌效果都有一定的促进作用;Ca2+对四种菌有略微的限制;Fe3+和Zn 2+对大 肠杆菌0157 :H7和肠炎沙门氏菌也有所促进效果，对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌有所 抑制但不是很明显，抑菌效果还是不错的。
[0115] 结论:确定牛蒡子提取液对大肠杆菌0157: H7、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、耶尔 森氏菌属、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等各种食源性致病菌的抑制作 用。
[0116] 以单增李斯特菌、大肠杆菌0157 :H7、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄糖菌为受试菌， pH对牛蒡子提取液的抑菌效果没有显著的影响，经60°C处理30min、121°C高压处理15min， 提取物仍均有明显抑菌效果，紫外照射15min，30min，以及加入不同金属离子后，提取物仍 有较显著的抑菌效果。牛蒡子具有良好的抑菌效果和抑菌稳定性。
【主权项】
1. 一种牛蒡子提取物的制备方法，其特征在于:取牛蒡子，粉碎;按固液比1:6~10的比 例加入65~80%乙醇溶液，60°C ±5°C水浴中浸提1.5~2.5小时，抽滤，滤渣在同样条件下 再浸提1.5~2.5小时，抽滤;合并两次的滤液，蒸发浓缩，加入无水乙醇，密封静置18~24小 时，再次抽滤，得牛蒡子提取液，冷冻干燥得粉末，即为牛蒡子提取物。2. -种利用权利要求1所述的制备方法制备得到的牛蒡子提取物。3. 权利要求2所述的牛蒡子提取物在抑制大肠杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌、耶 尔森氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或/和副溶血性弧菌中的应用。4. 权利要求2所述的牛蒡子提取物在制备抑制大肠杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特 菌、耶尔森氏菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或/和副溶血性弧菌的制剂中的应用。
【文档编号】A61K36/28GK105963334SQ201610422933
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】贺菊萍, 张晨, 郑欣宇
【申请人】徐州工程学院