专利名称：一种稠油降解菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株降解稠油的细菌及其在 废水生物处理和污染土壤环境修复中的应用。
背景技术：
原油主要由烷烃、芳烃、胶质和浙青质组成。稠油属于原油的一种，其主要特点为 高胶质浙青质、高蜡含量及高粘度。随着中质原油和轻质原油产量的逐渐减少，稠油开始被 人们带来的水体及土壤污染的问题越来越严重，日益引起人们的重视。由于稠油具有高胶 质浙青质及高粘度的特点，和石油相比，在环境中更难去除，在环境中的存在时间会更长。目前，石油污染土壤治理技术的主要有三种物理法、化学法和生物法。由于生物 法与物理化学法相比具有成本低、无二次污染、处理效果好、操作简单等优点，生物修复特 别是微生物修复受到各国科学研究工作者的青睐。研究表明，能够降解石油烃的微生物非 常多，包括细菌、真菌和放线菌在内可达到100余属，200多个种。细菌中能降解石油烃的主 要有无色杆菌属、产碱杆菌属、芽孢杆菌属、微球菌属、假单胞菌属、分支杆菌属等。目前，国内外学者分离出了可以降解稠油的细菌和真菌。但是总的菌种较少，限于 假单胞菌、枯草芽孢杆菌、微杆菌属、红平红球菌及镰刀菌属等。一方面，这些菌对稠油的降 解效果还有待提高。另一方面，在实际修复中，由于周围环境的不稳定性，寻找一种能真正 适应真实环境的高效降解菌是目前环境保护的热点问题。
发明内容
本发明主要针对上述现有稠油污染修复技术所面临的难题，提供一种高效稠油降 解菌，及其主要在废水生物处理和污染土壤环境修复中的应用。本发明所提供的一种稠油降解菌，它来源于广州石化总厂污水处理厂曝气池周 围的泥水混合物中，经人工富集培养、分离纯化得到，该菌株是不动杆菌(Acinetobacter sp.)GS02，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCN0:M 2010172，保藏日期为 2010年7月8日。该菌的菌落为圆形、凸起光滑、边缘整齐、灰白色，并且有粘性。电子显微 镜下观察该菌的形态为无芽孢球杆菌。生物学特性为氧化酶阴性，接触酶阳性，革兰氏染 色为阴性，非发酵型，专性需氧，该菌可在好氧条件下降解稠油。菌株GS02的16srDNA的登 录号为HM452380。上述菌株CCTCC M 2010172可以应用于废水生物处理和污染土壤环境修复中，具 体操作步骤如下将所述菌株CCTCC M 2010172接种至含稠油0. 5-2. Og/L的无机盐液体培养基中， 在150r/min、30°C的摇床中避光振荡培养24h以上。所述无机盐液体培养基是KH2P04 0. 5g，K2HP04 3H20 lg，NaCl 2g，22. 5g/L 的 MgS04 水溶液 3. OmL, 36. 4g/L 的 CaCl2 水溶液 1. 0ml, 0. 25g/L 的 FeCl3 水溶液 1. 0ml，微量 元素溶液1. 0ml，蒸馏水1L。其中，微量元素溶液组成:MnS04 H20 39. 9mg/L, ZnS04 H20
342. 8mg/L, (NH4) 6Mo7024 4H20 34. 7mg/L。优选地，所述液体培养的温度为25-35°C，pH值为6. 5 8. 0。优选地，在所述无机盐液体培养基中加入NaCl，调节NaCl浓度为4_8g/L。优选地，所述振荡培养的时间为72h。优选地，所述液体培养的温度为30°C。优选地，所述液体培养的pH值为7. 2。优选地，所述稠油的初始浓度为1. 5g/L，所述NaCl浓度为6g/L。所述菌株CCTCC M 2010172在废水生物处理和污染土壤环境修复中的应用。该菌 能利用稠油作为唯一碳源和能源生长。在纯培养条件下，该菌对稠油的降解率可达到45% 左右。该菌株在25-35°C下对稠油降解均有较好的效果，这个温度与环境中的温度接近，适 用于实际中的环境修复。在中性或者偏碱性的较宽PH值变化范围中，对稠油的降解效果仍 保持在较高水平。在盐浓度为6g/L时对稠油的降解效果达到最高值。另外，在稠油初始浓 度为0. 5-2. Og/L的范围内均可以较好的降解稠油。这将对该菌在含稠油的废水生物处理 和污染土壤环境修复中起到重大作用。本发明的优点是该菌株CCTCC M 2010172对稠油中的烷烃组分及难生物降解的姥 鲛烷及植烷都有很好的去除效果，与其它菌株相比，有高效的稠油去除率和很好的环境适 应能力；在纯培养条件下，菌株对稠油的降解率可达到45%左右，比一般的稠油降解菌提 高了 15%左右。
图1为Acinetobacter sp. GS02生长与稠油的降解曲线图；图2为菌株GS02降解稠油后残余组分的GC-MS图谱；图3为不同初始稠油浓度下Acinetobacter sp. GS02对稠油的降解率及绝对降解量。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限 于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。实施例1菌株CCTCC M 2010172的筛选分离及其稠油降解性能现场采集广州石化总厂受石油烃类污染的泥水混合物，采用以稠油为唯一碳源 的无机盐液体培养基体系驯化稠油降解菌。无机盐液体培养基KH2P040. 5g，K2HP04 3H20 lg，NaCl 2g，MgS04 水溶液(22. 5g/L) 3. OmL，CaCl2 水溶液(36. 4g/L) 1. 0ml，FeCl3 水溶液 (0.25g/L) 1.0ml，微量元素溶液1.0ml，蒸馏水1L。其中，微量元素溶液组成:MnS04 H20 39. 9mg/L, ZnS04 'H2042. 8mg/L，(NH4)6Mo7024 . 4H20 34. 7mg/L。稠油的初始浓度为 lg/L。经 过若干代反复驯化，在固体培养基(NR)中划线培养，得到多株纯菌，将纯菌涂布在稠油无 机盐固体平板上，看是否出现嗜油斑来验证其降解稠油的能力，最后得到一株稠油的高效 降解菌GS02，该菌经16S rDNA鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。所述固体培养基 (NR)成分蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，琼脂18g，蒸馏水1L，pH自然。稠油无机盐固体培养基无机盐液体培养基1000ml，琼脂18g，稠油lg。将Acinetobacter sp. GS02接种至含稠油lg/L的上述无机盐液体培养基中，在 150r/min、3(TC的摇床中避光振荡培养，在第0、6、16、24、48、72、96、120h分别取样测定培 养基中菌密度和稠油残留率，实验结果见图1。由图1可以看出，GS02在24h左右达到稳定 生长期，稠油降解率也随着菌密度的增大而提高。GS02对稠油的降解率同样在72h达到最 大值，为44. 8%。菌株在达到稳定生长期后对稠油的降解速率变缓，这是由于细菌首先利用 稠油组分中的烷烃及小分子芳烃组分，当这些物质大部分被分解后，细菌才利用胶质和浙 青质，但是这些物质较难生物降解，因此造成后期的降解减缓。将经过GS02降解后的稠油用正己烷溶解后进GC-MS分析，从图2的饱和烃 离子碎片图可以看到，空白中实验所用稠油的正构烷烃的碳数分布为nC9-nC35，主峰为 C17 (29. 78min)。经过GS02和GS07降解后，碳数分布为nC9_nC17和nC23_nC35的烷烃数量明 显降低。35min和40min左右出的峰分别是生物标志化合物[2°]姥鲛烷(Pr)和植烷(Ph)， 这两种烷烃属于异戊二烯烃，很难被生物降解。通过与空白样相比，在降解后这两种物质的 峰变成优势峰，另外，在降解后姥鲛烷峰和植烷峰也有明显降低，可以推断出这两株菌对稠 油中难降解的物质也有很好的分解作用。本实例说明分离所得到的菌株CCTCC M 2010172可利用稠油作为唯一碳源和能源 进行生长繁殖，并且对稠油中难降解物质具有较高降解能力。实施例2温度对稠油降解作用的影响将已接种GS02的稠油无机盐液体培养基分别放置于25、28、30、35和40°C的恒温 摇床中培养6d后，测定温度对稠油降解效果的影响。表 1_温度(°c )降解率(％ )
2534. 5
2838. 7
3045. 7
3539. 5
4027. 4
由表1可以看出，降解菌GS02在25_35°C范围内对稠油都有一定的去除效果，在 30°C时降解效果最佳，为45.7%。在25-35°C较宽的温度范围内降解效果变化不明显。当温 度达到40°C时，降解率有所降低，这是由于在高温环境下，细菌细胞内的蛋白质容易变性、 酶的活性受到抑制。由于环境中的温度极少达到40°C，一般是在中低温的范围内变动，因此 降解菌GS02适用于实际环境中的修复。本实例说明菌株GS02在中低较宽的温度范围内均能较好的降解稠油，为其在不 同温度环境中的应用提供了保证。实施例3
pH值对稠油降解作用的影响调节无机盐液体培养基的pH值分别为6. 5,7. 0,7. 2,7. 5及8. 0，在稠油初始浓度 为lg/L的条件下，培养6d，测定pH值对稠油降解作用的影响。表2_PH降解率(％ )
6. 531. 5
7. 045. 7
7. 247. 6
7. 538. 3
8. 034. 9
如表2可以看出，pH值为7. 2时，降解菌GS02对稠油的降解作用最强，在6d的降 解率可达到47. 6%;pH为6. 5时的降解率较低，为31. 5%。pH值主要影响细菌酶的活性、细 胞质膜的透性及稳定性，从而影响到石油烃的降解速率在中性或偏碱性范围内降解菌GS02 对稠油都有较高的降解效果。本实施例说明降解菌GS02在中性和偏碱性较宽pH范围内均能较好降解稠油，使 其在不同pH环境中的应用成为可能。实施例4稠油初始浓度对菌GS02降解稠油的影响将GS02在稠油初始浓度分别为0. 5、1. 0、1. 5、2. 0和2. 5g/L的无机盐液体培养基 中培养，6d后分别测稠油的降解率并且计算稠油的绝对降解量。如图3可知，GS02对稠油的 降解率分别为46. 9%,45. 7%,30. 4%U9. 5%U5. 4%；对稠油的绝对降解量分别为0. 234、 0. 457,0. 456,0. 39,0. 385g/L。GS02对稠油的降解率随培养基中初始稠油的浓度的升高而 降低，在0. 5g/L时的降解率最大。但是对稠油的绝对降解量随初始稠油浓度的增多，出现 先增大后平稳最后下降的趋势，在初始稠油浓度1. 5g/L时最大绝对降解量达到0. 4g/L左 右，而后有所下滑。稠油浓度的提高一方面提高了微生物可降解组分的绝对量，从而使绝对 降解量有所提高，但是另一方面对细胞有毒害物质的量也增加，使细菌的活性降低，造成高 初始稠油浓度时降解率和绝对降解量均有下降的趋势，但与低浓度相比，GS02对稠油的绝 对降解量数值仍有增大。本实施例说明降解菌GS02在较大(0.5_2g/L)浓度范围内较好的降解稠油，为其 在稠油污染环境中的修复提供了保证。实施例5无机盐初始浓度对菌GS02降解稠油的影响。用NaCl调节盐度，分别配置了 2、4、6、8和10g/L五个盐度值的降解用培养基进行 实验。如表3所示，GS02对盐的耐受能力较强且盐浓度范围较宽，在盐浓度为4-6g/L时对 稠油有较好的降解效果，降解率达到30%以上。当营养盐及温度不是限制因子时，石油烃的 生物降解率随盐度的增大而减小。
表 3_盐度(g/L)降解率(％ )
222. 9
433. 2
633. 8
829. 5
1022. 2
本实施例说明降解菌GS02在较大盐度(4-8g/L)浓度范围内较好的降解稠油，为 其在稠油污染环境中的修复提供了保证，尤其是在盐浓度为6g/L时对稠油的降解效果达 到最高值。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种稠油降解菌，其特征在于，该菌株是不动杆菌(Acinetobacter sp.)GS02，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NOM 2010172，保藏日期为2010年7月8日。
2.权利要求1所述的降解菌的应用，其特征在于，该菌株应用于废水生物处理和污染 土壤环境修复中。
3.根据权利要求2所述的降解菌的应用，其特征在于，将所述菌株CCTCCM2010172接 种至含稠油0. 5-2. Og/L的无机盐液体培养基中，在150r/min、3(TC的摇床中避光振荡培养 24h以上。
4.根据权利要求2所述的降解菌的应用，其特征在于，所述无机盐液体培养基是KH2P040.5g，K2HP04 3H20 lg，NaCl 2g，22. 5g/L 的 MgS04 水溶液 3. OmL，36. 4g/L 的 CaCl2 水溶液1.0ml, 0. 25g/L的FeClyjC溶液1. 0ml，微量元素溶液1. 0ml，蒸馏水1L。
5.根据权利要求4所述的降解菌的应用，其特征在于，所述液体培养的温度为 25-35°C，pH 值为 6. 5 8. 0。
6.根据权利要求3或4或5所述的降解菌的应用，其特征在于，在所述无机盐液体培养 基中加入NaCl，调节NaCl浓度为4_8g/L。
7.根据权利要求6所述的降解菌的应用，其特征在于，所述振荡培养的时间为72h。
8.根据权利要求6所述的降解菌的应用，其特征在于，所述液体培养的温度为30°C。
9.根据权利要求6所述的降解菌的应用，其特征在于，所述液体培养的pH值为7.2。
10.根据权利要求6所述的降解菌的应用，其特征在于，所述稠油的初始浓度为1.5g/ L，所述NaCl浓度为6g/L。
全文摘要
本发明公开了一株稠油降解菌及其应用，该菌株是不动杆菌(Acinetobacter sp.)GS02，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2010172，保藏日期为2010年7月8日。该菌的菌落为圆形、凸起光滑、边缘整齐、灰白色，并且有粘性。电子显微镜下观察该菌的形态为无芽孢球杆菌。生物学特性为氧化酶阴性，接触酶阳性，革兰氏染色为阴性，非发酵型，专性需氧。该菌株对稠油中的烷烃组分及难生物降解的姥鲛烷及植烷都有很好的去除效果，与其它菌株相比，有高效的稠油去除率和很好的环境适应能力。基于其上述特性，该菌在受稠油污染的水体及土壤的修复中具有很好的应用。
文档编号A62D3/02GK101921722SQ20101024523
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者党志, 卢桂宁, 易筱筠, 杨琛, 贾群超, 郭楚玲 申请人:华南理工大学