抗－HBeAg单克隆抗体细胞株、制备方法和抗－HBeAg单抗的制作方法

专利名称：抗－HBeAg单克隆抗体细胞株、制备方法和抗－HBeAg单抗的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒免疫学检测技术领域，具体涉及抗-乙型肝炎病毒e抗原(抗-HBeAg)的单克隆抗体细胞株及其制备方法和抗-HBeAg单克隆抗体。
背景技术：
近年来，肝病已经越来越成为威胁人类健康的主要疾病之一，其中病毒性肝炎中尤以乙型肝炎对人类影响最大。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的全球性公共健康问题，成为了当前的一种世界性疾病。目前全世界HBV持续感染者达3.5亿，其中75％在亚洲和西太平洋地区。我国是乙型肝炎的高流行区，HBV感染者达1.2亿，平均年发病约140万左右，居法定传染病第三位。随着我国对乙型肝炎的深入了解，自我保健意识的逐步加强，对乙肝的预防与检测成为了医疗界的重要课题。
由于乙肝影响范围的广泛性、危害的严重性，乙型肝炎诊断试剂作为专用于乙肝患者各种生理指标的检测、乙肝的诊断和治疗过程监测的生物学和化学试剂，具有广泛的应用范围和社会需求。无论是新产品的开发还是已有产品的市场推广，均具有巨大潜力。
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒相关的一个分泌型的抗原，在前C区编码，和核心抗原(C抗原)有部分同源性，但是由于在N端有了一个信号肽，所以是一个分泌型的抗原。HBeAg与HBVDNA、DNAP和前-S高度相关，共同代表病毒复制(Matsuo M.，Clinical Evaluation or HBeAg/Anti-Hbesystem in HBeAg Positive Hapatitis，Acta Hepatol Spn.，1985，26(7)819)。目前在乙型肝炎病毒的血清标志物中HBeAg是应用最为广泛、最为可靠的评估乙型肝炎病毒(HBV)复制与传染性的指标之一。HBeAg阳性有助于判断急性肝炎的预后、代表血液传染性强，亦可作为抗病毒药物疗效的考核指标之一(彭文伟主编，《病毒性肝炎研究》，广东科技出版社，1998年版，19-20；倪语星、洪秀华、楼昌斌主编，《现代病原学检验与临床实践》，上海，上海科学技术文献出版社，1999年146)。目前，在乙型肝炎的两对半的诊断中，HBeAg诊断也是其中很重要的一部分，因此HBeAg的抗体的研制具有重要的临床使用价值。
目前，HBeAg的检测方法有放射免疫检测法(RIA)和酶联免疫吸附检测法(ELISA)等。由于RIA法所需设备昂贵、操作复杂、价格高、易污染等缺点而使其使用受到很大限制，这一限制为EL1SA法的使用提供了广阔的市场。Imai M等人利用单克隆抗体技术制备出单克隆抗-HBeAg(a，b)两株杂交瘤细胞后，使检测HBeAg的方法在特异性和敏感性方面达到了一个新水平(Imai M，免疫学杂志(J.Immunol)，1982，12869)。由于单克隆抗一HBe杂交瘤细胞株难以获得，也由于其分泌的抗-HBeAg单克隆抗体不配对而无法用于ELISA检测，因此，在检测HBeAg时，往往采用包被单抗、酶标多抗，这会导致假阳性率高、敏感性低等技术缺陷，因此采用双抗体夹心-ELISA法检测HBeAg是必然趋势。但是双抗体夹心ELISA法需要两个识别HBeAg不同表位的单克隆抗体，而利用传统的方法制备抗-HBeAg单克隆抗体时往往只能得到识别HBeAg一个优势表位(命名为b表位)的抗体，这给夹心法ELISA检测HBeAg的临床应用造成了很大限制。

发明内容
为了克服上述现有技术中存在的缺乏HBeAg不同表位的单克隆抗体这样的技术缺陷，发明人进行了广泛而详细的研究工作，包括对传统的单克隆抗体技术的改进、制备和筛选识别HBeAg不同表位的单克隆杂交瘤细胞、抗-HBeAg单克隆抗体的制备及其在检测HBeAg中的应用等。
基于上述研究，本发明所要解决的技术问题之一是提供产生抗-HBeAg单克隆抗体的杂交瘤细胞株以解决现有技术中存在的缺乏识别HBeAg不同表位的单克隆抗体细胞株的技术缺陷。
本发明所要解决的技术问题之二是提供产生抗-HBeAg单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法以解决现有技术中存在的难于制备识别HBeAg的b表位以外的抗原表位的单克隆抗体杂交瘤细胞株这样的技术缺陷。
本发明所要解决的技术问题之三是提供抗-HBeAg单克隆抗体的制备方法以解决现有技术中存在的缺乏识别HBeAg不同表位的单克隆抗体的技术缺陷。
本发明还要的解决的技术问题是提供抗-HBeAg单克隆抗体在检测HBeAg中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明的构思是这样的为了在获得识别优势表位抗体的同时能够获得不同于优势表位抗体的抗体，人为改变机体对抗原不同表位反应性的相对强弱。在免疫前先静脉注射识别HBeAg优势表位(b表位)的单抗。另外还可以在每次免疫前将抗原HBeAg和b表位的单克隆抗体反应，然后再进行注射免疫。因而增加了获得b表位之外的其他表位的抗体的几率。
本发明理论根据是免疫学的两个基本原理第一，用识别一个表位的抗体可以对这个表位进行封闭；第二，机体内产生抗体具有一个负反馈调节机制，即当机体内已经有识别一个表位的大量的抗体存在时，再注射抗原，机体对这个表位的反应性会被负反馈调节，从而抑制了这个表位的抗体的产生水平，而对其他表位的反应水平相对提高。
在本发明中，发明人用HBeAg免疫动物，第一次免疫前先静脉注射大量识别HBeAg的b表位的抗体，第一次免疫用福氏完全佐剂与HBeAg混合后乳化按照本领域公知的方法免疫动物，第二次、第三次免疫用福氏不完全佐剂与HBeAg混合后乳化免疫动物，第三次免疫后再用HBeAg回忆刺激动物，取血清检测抗体效价。优选地在每次免疫前将HBeAg和优势表位(b表位)的抗-HBeAg单抗预先反应后再免疫动物。免疫动物的抗原或者是商品化的乙型肝炎病毒e蛋白(HBeAg)或者用本领域普通技术人员所公知的基因工程技术制备所得到的HBeAg(HBeAg的氨基酸序列是公知的，Sequence ID No.1)。免疫动物可以是本领域常用的动物如兔、小鼠等。优选地使用BALB/C小鼠。免疫方法、免疫剂量、免疫间隔时间等因使用不同的动物会有所不同，但本领域的技术人员可以根据公知的技术(如根据金伯泉主编，《细胞和分子免疫学实验技术》，西安，第四军医大学出版社，2002年)方便地实施之。血清抗体效价用双向琼脂扩散法或间接ELISA法检测。
免疫小鼠前先注射0.1mg～5.0mg识别HBeAg优势表位的抗体、优选地注射0.1～2.0mg识别HBeAg优势表位的抗体。每次免疫前使0.05mg～0.2mg HBeAg和0.1～1.0mg识别HBeAg优势表位的抗体混合乳化后注射免疫小鼠。
优选地免疫小鼠前先注射0.5mg～1.0mg识别HBeAg优势表位的抗体，然后每次免疫前使0.1mg～0.2mg HBeAg和0.5～1.0mg识别HBeAg优势表位的抗体混合乳化后注射免疫小鼠。
从回忆刺激后的动物脾脏中分离脾脏B淋巴细胞，在常规条件下用聚乙二醇(PEG)作融合剂将脾脏B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，用含有1×HAT(次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T))和10％小牛血清的细胞培养液进行选择培养。50×HAT有商品化产品，其含有5mM的H、0.02mM的A和0.8mM的T。按照本领域常规的方法进行细胞融合，培养液是RPMI1640。融合杂交瘤细胞的克隆化采用本领域常规的有限稀释法，最后获得了两株产生抗-HBeAg单克隆抗体的细胞株S-29-3和S-72-3，其中细胞株S-29-3已经于2005年9月23日提交位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC-C200516；细胞株S-72-3已经于2005年9月9日提交中华人民共和国位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC-C200517。
将上述保藏号为CCTCC-C200516和CCTCC-C200517的杂交瘤细胞株按照常规动物细胞培养方法进行体外培养扩增或者注射小鼠腹腔制备腹水。用间接ELISA法检测培养或腹水中抗体效价，用本领域公知的方法从培养物或者腹水中回收抗-HBeAg单克隆抗体，即获得抗-HBeAg单克隆抗体，为说明方便分别表示为抗体S-29-3和抗体S-72-3。
以HBeAg和其他蛋白质抗原如牛血清白蛋白作为抗原、用间接ELISA法进行抗体特异性检测。用本领域公知的方法如酶标或荧光素标记的第二抗体鉴定抗体的Ig类及用标准的抗亚类血清系统作双扩散或夹心ELISA法鉴定上述抗-HBeAg单克隆抗体的亚类，上述抗-HBeAg单克隆抗体中抗体S-29-3为IgG1，轻链为κ链；抗体S-72-3为IgG2b亚型，轻链为κ链。
用竞争结合试验和/或生物传感器(Biosensor)检定上述抗-HBeAg单克隆抗体的识别表位。人工合成了一段18个氨基酸残基的肽(LN18)(Sequence IDNo.2)，它是HBeAg的119-136的氨基酸序列，间接ELISA检测表明抗体S-72-3与肽LN18的结合性很弱而商品化的识别HBeAg优势表位(b表位)的单克隆抗体(ewb)与LN18特异性结合，表明本发明的抗体S-72-3所结合的表位是在HBeAg的119-136之外的氨基酸序列，与ewb的表位不同。进一步用基因工程的手段表达了另一个多肽Ec(Sequence ID No.3)，系去掉了HBeAg抗原C端氨基酸残基的多肽，亦即包含HBeAg1-118的肽段。本发明的抗体S-72-3和Ec高度结合而ewb与Ec几乎不结合，因而本发明的抗体S-72-3的表位位于HBeAg的1-118序列。
用间接ELISA法检测抗体S-29-3与肽段LN18及无关肽的结合性，抗体S-29-3与LN18高度结合，表明抗体S-29-3识别的表位可能就是LN18所代表的抗原表位，即HBeAg119-136氨基酸序列。该结果显示本发明的免疫方法同样获得了识别与HBeAg的b表位相近似的表位的抗体。
因而，本发明提供了产生抗-HBeAg单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号分别为CCTCC-C200516和CCTCC-C200517。
本发明提供了制备产生抗-HBeAg单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，即在用HBeAg免疫动物前先注射识别HBeAg优势表位的抗体，然后再用HBeAg免疫动物。优选地在每次免疫动物前将HBeAg和识别HBeAg优势表位的抗体反应后再免疫动物。免疫动物是家兔或者小鼠，优选地是BALB/C小鼠。从免疫动物中分离产生抗-HBeAg单克隆抗体的脾脏B淋巴细胞，然后将脾脏B淋巴细胞与相应品系的骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，然后用本领域通用的技术筛选杂交瘤细胞；用本领域常用的技术如有限稀释法分离单克隆细胞，用间接ELISA法鉴定单克隆杂交瘤细胞，获得产生抗-HBeAg单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用本领域常用的技术冻存。
本发明还提供了抗-HBeAg单克隆抗体，其中抗体S-72-3识别HBeAg的优势表位(b表位)以外的表位，优选地识别HBeAg的119-136之外的表位，最优选地识别位于HBeAg的1-118氨基酸序列的表位。抗体S-29-3识别HBeAg的119-136表位，其为IgG1型。
另外，本发明提供了制备上述抗-HBeAg单克隆抗体的方法，包括如下步骤(a)扩增产生上述抗-HBeAg单克隆抗体的细胞株；
(b)从扩增产物中回收抗-HBeAg单克隆抗体。
扩增细胞株的方法在本领域是公知的，如用体外动物细胞培养法，例如滚瓶、方瓶或者动物细胞发酵罐培养扩增杂交瘤细胞。或者用体内制备腹水法，如先扩增上述杂交瘤细胞株然后腹腔注射BABL/C小鼠，7-10天后采集腹水。
从扩增产物中回收抗-HBeAg单克隆抗的方法在本领域也是常用的，如硫酸铵沉淀法、阴离子交换层析法或者葡萄球菌A蛋白亲和层析法。
本发明的抗体S-72-3与商品化的识别HBeAg优势表位的单克隆抗体(ewb)识别HBeAg的不同抗原表位，可以配合使用用于夹心法ELISA检测血清中的HBeAg。用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记本发明的抗-HBeAg单克隆抗体，与ewb配合用于检测血清中的HBeAg。预先将ewb固定在固相载体上，然后加入待检样品，设置阳性对照和阴性对照，抗体-抗原结合后加入标记的本发明的抗-HBeAg单克隆抗体，反应、加入酶反应底物显色或发光检测样品中的HBeAg。当然，标记ewb而预先固定本发明的抗体也可以达到检测目的。本发明的方法具有很高的特异性和较高的准确率。
本发明的两个抗-HBeAg单克隆抗体具有不同的抗原识别表位，因而可以配合用于夹心法ELISA检测HBeAg，在临床上用于检测乙型肝炎病毒。
应当明确，在本发明中单克隆抗体和单抗系同义语，可以互换使用。本发明的抗-HBeAg单克隆抗体有时也以抗体S-72-3和抗体S-29-3表示，但抗体S-72-3指称杂交瘤细胞株S-72-3(保藏号CCTCC-C200517)产生的抗-HBeAg单克隆抗体；抗体S-29-3指称杂交瘤细胞株S-29-3(保藏号CCTCC-C200516)产生的抗-HBeAg单克隆抗体，因而抗体S-72-3和抗体S-29-3不能与抗-HBeAg单克隆抗体互换使用。


图1是BALB/C小鼠免疫后血清抗体效价的测定，方法为间接ELISA法，◆为免疫HBeAg的小鼠血清、■为正常小鼠血清。
图2是间接ELISA法检测单克隆抗体腹水效价，◆系杂交瘤细胞株S-29-3腹水，■系骨髓瘤细胞系SP2/0腹水。
图3是间接ELISA法检测单克隆抗体S-29-3腹水和HBeAg结合的特异性，□为重组HBeAg抗原(5μg/mL)，■为对照蛋白(牛血清白蛋白，BSA，10μg/mL)。
图4是间接ELISA法检测抗体S-29-3与肽LN18的结合，□代表LN18和抗体S-29-3结合，■代表无关肽和抗体S-29-3。
图5是间接ELISA法检测抗体S-72-3与肽LN18的结合，LN18+S-72代表LN18和抗体S-72-3，LN18+ewb代表肽LN18和商品化抗体ewb结合。
图6是间接ELISA法检测抗体S-72-3和ewb与Ec的结合，其中S-72表示抗体S-72-3与Ec结合，ewb表示抗体ewb与Ec结合。
图7夹心法ELISA检测HBeAg，其中E表示重组HBeAg、BLANK表示无关蛋白BSA。
图8是Biocore检测抗体S-29-3的亲和常数。
图9是Biocore检测抗体S-72-3的亲和常数。
以下结合具体的实施方式详细说明本发明。除有特殊说明外，具体操作均按照《分子克隆实验指南》(第二版)(金冬雁、黎孟枫等译，J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，北京科学出版社，1998年)和《细胞和分子免疫学实验技术》(金伯泉主编，西安第四军医大学出版社，2002年版)进行。在详细描述了这些具体实施方式
后，本领域的普通技术人员会充分知晓如何设计其他可靠方法，从而通过应用本发明的成果来获得同样的信息。因此无论这些具体实施方法的描述如何详细具体，均不意味着对发明总体范围的任何限制，本发明的范围仅以权利要求的范围为准。
具体实施例方式
实施例1抗-HBeAg杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备(一)免疫动物用基因重组的HBeAg蛋白三次免疫BALB/C小鼠。第一次免疫的前一天，先静脉注射0.5mg识别HbeAg的b表位的抗体ewb(上海科华有限公司产品)。第一次免疫用福氏完全佐剂与HBeAg蛋白等量混匀后乳化，静脉注射，0.1mg/只，注射0.2～0.3mL。第二、第三免疫用福氏不完全佐剂与HBeAg蛋白等量混匀后乳化，免疫方法与用量同第一次免疫。每次免疫间隔一个月。每次免疫小鼠前均使0.1mg HBeAg和0.5mg抗体ewb混合、与等量佐剂混匀乳化。第三次免疫一个月后，腹腔注射0.1mg的HBeAg蛋白回忆刺激BALB/C小鼠。间接ELISA方法检测免疫后的血清效价，图1。从图1中可以看出，经过三次免疫之后，对重组HBeAg抗原的间接ELISA法检测抗血清的效价64000，而正常小鼠血清对重组HBeAg抗原没有反应。间接ELISA法检测中包被的HBeAg抗原浓度是1.5μg/ml。
福氏不完全佐剂和福氏完全佐剂均使用商品化产品。
(二)杂交瘤细胞株的制备和筛选取回忆刺激3天后的小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG-4000进行融合。用含1×HAT和10％小牛血清的RPMI-1640培养。融合后三天开始出现融合细胞，512个孔中335个为融合孔，融合率为65.4％。用ELISA法检测抗-HBeAg单克隆抗体，检测281个孔，其中阳性孔为12个，阳性率为4.2％。经过三次有限稀释克隆，最后获得一株稳定分泌抗-HBeAg单克隆抗体的细胞株，标记为S-29-3和S-72-3。
(三)腹水的制备及其效价和抗体亚型的鉴定将阳性杂交瘤细胞株S-29-3以1×106个/只的量腹腔注射预先致敏8-10周龄的BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用间接ELISA方法检测S-29-3单抗的效价。以骨髓瘤细胞系SP2/0腹水为对照，包被的HBeAg抗原浓度是1.5μg/mL。
结果SP2/0腹水重组HBeAg抗原无反应(图2)，单克隆抗体S-29-3的效价为1.28×106。进而用标准抗亚类血清系统作双夹心ELISA确定细胞株S-29-3分泌的抗体亚型为IgG1，轻链为κ链。
实施例2抗-HBeAg单克隆抗体的制备将阳性杂交瘤细胞株S-29-3以1×106个/只的量腹腔注射预先致敏8-10周龄的BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用间接ELISA方法检测S-29-3单抗的效价。腹水4℃、12000rpm离心15min，取1份(体积)腹水与2份(体积)0.06MpH4.8的醋酸缓冲液混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸33μL/mL腹水，室温混合30min。4℃静置2小时以上使其充分沉淀，然后4℃、12000rpm离心30min，弃去沉淀，上清经砂芯漏斗过滤后加入1/10体积的0.1MpH7.4的PBS，用2M NaOH调节pH至7.4。冰浴下于30min内加入0.277g/mL的硫酸铵使饱和度达到45％，4℃静置1小时以上，然后4℃、10000rpm离心30min，弃去上清。沉淀用含有137mM NaCl、2.6mM KCl、0.2mM EDTA的pH7.4PBS溶解，并于50-100倍体积的上述PBS中4℃透析过夜。然后用Q Sepharose Fast Flow交换柱层析技术进一步纯化。平衡缓冲液为20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0M NaCl的20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液，层析柱XK 16/20、Pharmacia AKTA FPLC层析系统。按照厂商提供的说明书装柱，平衡缓冲液平衡层析柱、流速5mL/min。上样完毕后用3倍柱体积的平衡缓冲液洗去未结合蛋白，以NaCl递增的线性梯度洗脱结合的抗体蛋白，线性梯度为0-1.0MNaCl/10倍柱体。检测A280，收集洗脱的抗体蛋白。SDS-PAGE检测纯度，抗体的含量用本领域常用的紫外分光光度法测定，用间接ELISA法检测抗体效价。
实施例3抗-HBeAg单克隆抗体的特异性用间接ELISA方法检测抗-HBeAg单克隆抗体的特异性。包被的抗原是重组HBeAg抗原(5μg/ml)，对照为牛血清白蛋白(10μg/ml)。实施例2的抗体S-29-3的浓度是5μg/ml。试验结果见图3。
从图3可以看出抗体S-29-3与重组蛋白HBeAg都有着很强的反应性，而与对照蛋白的反应性很低。表明抗体S-29-3具有很好的抗原特异性。
实施例4抗体S-29-3的结合表位的鉴定及性质分析为了研究所制备的单克隆抗体所识别的表位，设计合成了多肽，命名为LN18(见序列表Sequence ID No.2)。LN18肽的序列是根据文献资料和计算机模拟设计的，它所代表的是HBeAg抗原119-136的氨基酸序列所组成的一个表位。间接ELISA法检测抗体S-29-3与LN18的结合性，对照为一段无关的肽段，结果如图4。抗体S-29-3和LN18具有较好的结合性，表明抗体S-29-3所结合的表位很有可能是LN18所在的HBeAg的这段序列上。
为了进一步分析抗体S-29-3的结合表位，发明人对它们所结合的抗原表位进行了初步的定性分析，确定它们所识别的是线性表位还是构型表位。如果识别的是构型表位，那么在抗原变性之后，反应活性将大大的下降，一般来说＞50％；如果识别的是线性表位，那么活性下降幅度会比较小，一般来说＜50％。
首先将重组的HBeAg变性，用间接ELISA法检测抗体S-29-3和ewb对HBeAg变性前后的结合性，结果如表1。
表1单克隆抗体对抗原变性前后反应结果

从表中结果看出，抗体S-29-3对变性前后的HBeAg的反应活性分别下降了80％，这表明抗体S-29-3所识别的表位可能是构型表位；而ewb只下降了43％，这表明它所识别的表位可能是线性表位。进一步的研究发现抗体ewb对LN18具有一定的结合性，表明抗体S-29-3识别的表位为LN18代表的序列的构型表位。
实施例5抗体S-72-3的结合表位的鉴定及性质分析用杂交瘤细胞株S-72-3按照实施例2的方法制备抗体S-72-3。
间接ELISA法检测抗体S-72-3和ewb与LN18的结合性，结果如图5。ewb和LN18具有较好的结合性，而抗体S-72-3和LN18的结合是几乎没有的，表明，ewb所结合的表位很有可能是LN18所在的HBeAg的这段序列上，而抗体S-72-3结合的表位是119-136之外的区域。同时结果也可以很清晰的说明这两个抗体所结合的位置是不同的，位于HBeAg的不同区域上。
为了进一步研究抗体S-72-3所结合的具体位置，表达了一个新的抗原，一个HBeAg的肽段，标记为Ec(Sequence ID No.3)，这个抗原和HBeAg最大的不同是把HBeAgC端的氨基酸残基去掉，去掉的这段区域包含了LN18所在的序列，也就是Ec系HBeAg1-118氨基酸的序列。间接ELISA方法检测抗体S-72-3和ewb与Ec的结合，抗体浓度均为5μg/mL，结果见图6。可以看出，S-72-3与Ec有较好的结合，而ewb与Ec的结合是几乎没有的。前面的实验结果已经表明ewb的结合表位很可能是LN18所在的序列，所以去掉了LN18所在的序列之后的蛋白Ec与ewb的不反应也进一步验证了前面实验的结论，而S-72-3与Ec的反应表明S-72-3所结合的表位是Ec所在的区域，不同于ewb。
进一步分析抗体结合表位首先将重组的HBeAg变性，用间接ELISA法检测抗体S-72-3和ewb对HBeAg变性前后的结合性，结果如表2。
从表2中的结果看出，抗体S-72-3对变性前后的HBeAg的反应活性分别下降了89％，这表明抗体S-72-3所识别的表位可能是构型表位；而ewb只下降了43％，这表明它所识别的表位可能是线性表位。结合前面的实验结果，可以初步判断抗体S-72-3所识别的是HBeAg的1-118氨基酸所组成的一个构型表位，这个表位可能跨越了整个的Ec。
表2单克隆抗体对抗原变性前后反应结果

实施例6夹心法检测重组HBeAg用夹心ELISA法检测重组的HBeAg，其中用将抗体ewb包被在酶标板上，用过碘酸钠法将实施例2的抗体用辣根过氧化物酶标记，检测的抗原是重组HBeAg，对照为BSA。结果见图7。结果表明，辣根过氧化物酶标记抗体S-72-3可以和ewb进行配对特异检测重组E蛋白，进一步表明它和ewb识别的抗原表位是不同的。这个结果表明，单克隆抗体S-72-3是识别HBeAg优势b表位之外的其他表位的单克隆抗体，并且可以和已知抗体ewb进行配对检测HBeAg。
实施例7单克隆抗体S-29-3亲和常数的测定选择目前广泛采用的biocore技术测定亲和常数。
系统信息BIAcore 3000(上海生命科学研究院药物研究所)CM5 sensorchipAmine coupling(Directly immobilization)系统缓冲液20mM HEPEs150mM NaCl5mM EDTA0.1％P20实验结果见图8。其中抗体浓度梯度如下4，2，1，0.5，0.25，0.125，0μM。根据二价结合模型，反应动力学常数结果如下ka1＝1.24±0.187×104l/Ms kd1＝7.78±1.68×10-5l/ska2＝2.34±0.334×10-3l/Mskd2＝0.0836±0.001l/s亲和常数K＝Ka/Kd＝1.59×109M其中Ka结合常数；Kd解离常数。可见抗体S-29-3对HBeAg具有高度的亲和力。
实施例8单克隆抗体S-72-3亲和常数的测定测定方法与参数条件同实施例7，结果见图9。计算结果如下ka1＝1.14±0.129×103l/Mskd1＝2.49±0.168×10-5l/ska2＝1.46±0.187×10-3l/Ms kd2＝0.0651±0.002l/s亲和常数K＝ka/kd＝4.57×1010M其中Ka结合常数；Kd解离常数。可见抗体S-72-3对HBeAg具有高度的亲和力。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>抗-HBeAg单克隆抗体细胞株、制备方法和抗-HBeAg单抗<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>-10<211>149<212>PRT<213>乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)<220>
<221>SIGNAL<222>(-10)..(-1)<220>
<221>CHAIN<222>(1)..(149)<400>1Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp Pro Tyr-10 -5 -1 5Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp10 15 20Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr25 30 35Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala40 45 50Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr55 60 65 70Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp Leu Val Val75 80 85Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp90 95 100Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr105 110 115Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro120 125 130
Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val135 140 145<210>2<211>18<212>PRT<213>人工序列(Artificial)<400>2Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro1 5 10 15Pro Asn<210>3<211>118<212>PRT<213>人工序列(Artificial)<400>3Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr11权利要求
1.保藏号为CCTCC-C200516的杂交瘤细胞株。
2.保藏号为CCTCC-C200517的杂交瘤细胞株。
3.根据权利要求1或2的杂交瘤细胞株的制备方法，包括用抗原HBeAg免疫动物、分离脾脏B淋巴细胞并和骨髓瘤细胞融合、筛选杂交瘤细胞和杂交瘤检测的步骤，其特征在于在用HBeAg免疫动物前先静脉注射大量识别HBeAg的b表位的抗体。
4.根据权利要求3的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于每次免疫动物前将HBeAg和识别HBeAg b表位的抗-HBeAg单抗预先反应后再免疫动物。
5.根据权利要求4的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于免疫动物为BALB/C小鼠、骨髓细胞系为SP2/0。
6.根据权利要求5的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于免疫BALB/C小鼠前静脉注射0.1mg～2.0mg的识别HBeAg的b表位的抗体，每次免疫小鼠前使0.05mg～0.2mg HbeAg和0.1mg～1.0mg识别HBeAg的b表位的抗体混合、乳化，然后免疫小鼠。
7.根据权利要求6所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于包括如下(a)第一次免疫BALB/C小鼠用福氏完全佐剂与HBeAg混匀乳化后静脉注射，0.1mg/只；(b)第二次和第三次免疫用福氏不完全佐剂和HBeAg混匀乳化后静脉注射0.1mg/只，间隔一个月；(c)第三次免疫后回忆刺激小鼠。
8.根据权利要求1的细胞株产生的抗-HBeAg单克隆抗体。
9.根据权利要求2的细胞株产生的抗-HBeAg单克隆抗体。
10.根据权利要求8或9所述的单克隆抗体的制备方法，包括扩增所述的细胞株、腹腔注射动物、回收腹水并从腹水中分离抗-HBeAg单克隆抗体。
全文摘要
本发明抗－HBeAg单克隆抗体细胞株、制备方法和抗－HBeAg单抗涉及病毒免疫学检测技术领域。本发明的目的是解决现有技术中存在的缺乏识别HBeAg不同表位的单抗及难于制备识别HBeAg优势表位之外的抗原表位的单抗的技术缺陷。本发明公开了两株产生抗－HBeAg单抗的杂交瘤细胞株，通过免疫动物前预先注射HBeAg和/或免疫前将HBeAg和ewb反应后再免疫动物获得了识别b表位之外的抗原表位的单抗，并公开了两种抗－HBeAg单抗。本发明的抗体具有很好的特异性和亲和性，并识别不同的表位，可以分别与ewb配合或本发明的抗体相互配合用于双抗体夹心法ELISA检测HBeAg。
文档编号C07K16/18GK1786156SQ20051003085
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者孙兵, 靖彩英, 颜凌晨 申请人:中国科学院上海生命科学研究院