专利名称：针对小分子甲萘威建立的配对单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种针对小分子甲萘威建立配对单克隆抗体的方法，并将其应用于甲萘威胶体金免疫层析双抗夹心法试纸条的制备。
背景技术：
在世界人口急剧膨胀的今天，合理的使用农药可以提高粮食产量，但过量使用会造成严重的环境污染，并导致许多遗传疾病。近年来，由于农药在食品中残留超标而造成的中毒事件时有发生。因此，在食品安全这个全球关注的热点问题中，如何快速、准确地检测农副产品中残留的农药问题就成为了重中之重的问题。
甲萘威是小分子物质，分子量201.13，是一种新的农业杀虫药。它杀虫选择性强，作用快，因此使用较广。但存于植物中残毒不易清除，接触此类农药就会使人中毒。发病特点是快、猛，抢救不及时会造成死亡。中毒症状为流涎、恶心、呕吐、腹痛，心跳迟缓，血压下降，大汗，尿失禁，呼吸困难，瞳孔縮小，面色苍白等，严重致人死亡。
根据中华人民共和国的国家标准，并参考其他国家或地区的检测标准，检测甲萘威残留的分析方法主要是液相色谱补充GC方法，其它检测方法主要是依靠、气相色谱法(GC)或气相色谱与质谱(MS)联用法(GC/MS)。这些方法普遍存在着样品前处理过程复杂，灵敏度受样品的净化、浓縮等步骤的影响很大，耗时，检测设备昂贵，并要求有专业的技术人员及较长的分析周期。
为了降低检测成本、降低操作难度，应用免疫胶体金法检测农药甲萘威残留是较好的一种技术。依据传统定义，小分子物质只能采用胶体金免疫竞争法进行检测，如发明专利200410071941.0农药西维因快速检测用试纸条及其制作方法与应用、发明专利200510013371.4胶体金标记法快速检测西维因试纸条及其制作方法与应用、实用新型专利200520008931.2 —种快速检测甲萘威残留的胶体金试纸，免疫竞争法技术使小分子检测成本明显降低、操作也明显简单，但它的敏感度比双抗夹心法低，对于检测限低的小分子无法检测。而双抗夹心法虽然是常用的检测技术，但未见报导将它应用于小分子检测，相关文献和方法学阐述均认为小分子物质分子量小、结构简单，因此很难同时和两个大分子抗体相结合。
本发明用不同方法修饰不同的间隔臂，暴露出不同的抗原位点，从而免疫经过精心筛选获得配对的甲萘威单克隆抗体，进行双抗夹心法胶体金免疫检测，此方法具有特异性强，灵敏度高，批间差小等优点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种针对小分子甲萘威建立配对单克隆抗体的方法，并将其应用于快速免疫检测产品，使用双抗夹心法检测小分子甲萘威，获得更高的敏感度、良好的特异性。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的
通过分析甲萘威分子结构，用活性酯法和琥珀酸酐法两种方法形成不同的间隔臂，暴露出不同的抗原位点，再连接大分子蛋白，形成甲萘威小分子人工免疫原，利用杂交瘤技术制备针对不同抗原决定簇的单克隆抗体，之后按双抗体夹心方式筛选出配对的两种抗体I 、 II，配对单抗可以用于胶体金双抗夹心法的构建，其中一株抗体称为I用于包被试验线，另一株
种抗体称为II用于胶体金标记。
胶体金双抗夹心法的原理为在硝酸纤维素膜上的检测区包被甲萘威单克隆抗体I ，对照区包被羊抗鼠多克隆抗体。当待测物中有即甲萘威时，待测物中的抗原物质就会与标记胶体金的甲萘威单克隆抗体II形成Ag-Ab-Au复合物，由于毛细管层析作用，复合物沿膜带移
动，可与包被在硝酸纤维素膜上的甲萘威单克隆抗体I形成双抗夹心免疫复合物，这时检测
线处可看到一条明显色带(T线)，残余的标记胶体金的甲萘威单克隆抗体II会继续移动，由于它来源于鼠，因此可与羊抗鼠多克隆抗体结合形成一条明显色带(C线)，因此当检测试纸上可看到两条线(C线和T线)时，证明样品中含有甲萘威，结果为阳性，说明被检测的样品中农药甲萘威超标；而当待测物质中没有被测的甲萘威时，就不能在检测线处(T线)形成双抗夹心免疫复合物，仅会在C线处出现一条色带，结果为阴性，说明被检测的样品中农药甲萘威未超标。
由于采用上述技术方案，本发明所提供的采用甲萘威配对单抗制成的双抗夹心快速免疫检测产品具有特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，结果易读等优点。
具体实施例方式
实施例一小分子农药甲萘威免疫原的合成
通过两种不同的反应可合成不同臂长的半抗原
反应l:萘酸与过量的酰氯在溶剂存在条件下回流反应2—10小时，冷却逐滴加入过量的氨基酸溶液(该溶液为由碱和氨基酸配成水溶液)，搅拌反应2—10小时，可得到产物，经
纯化可得到半抗原I。
反应2:萘酚与稍过量的酸酐在溶剂存在的条件下避光回流反应5—20小时，得到产物，经纯化可得到半抗原II。将半抗原i、 n分别与大分子蛋白相连接，得到合成免疫原i、 n。
实施例二甲萘威单克隆抗体的制备
用合成的免疫原I、 n免疫BALB/c小鼠，用SP2/0细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。提取小鼠腹水纯化筛选，获得针对甲萘威不同抗原决定簇的单克隆抗体I、 II 。
实施例三甲萘威胶体金免疫层析双抗夹心法检测试纸条的制备
1. 胶体金溶液的制备取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到90 95°C，加入适量枸橼酸三纳继续加热搅拌至沸腾5分钟，冷却后避光保存备用。
2. 金溶液与甲萘威单克隆抗体II的结合将甲萘威单克隆抗体II标记的胶体金液吸附纤维材料上，干燥后备用。
3. 膜的制备制膜机制膜，利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的甲萘威单克隆抗
体I溶液量相等。
4. 试纸条的制作
试纸底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水层，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸
水层和单克隆抗体金标垫相互交叠连接(交叠连接部分在1—2毫米范围)，在单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。用切条机切成3mm的膜条，即为胶体金检测试纸条。
5. 使用方法把试纸的样品吸液层端放入蔬菜浸汁中，l分钟后取出试纸平放，由于毛细管
和虹吸作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，5分钟时观察结果。
6. 结果判断根据国家颁布的蔬菜农药残留检测标准制定界限值，样品中甲萘威浓度超过界
限值，反应线颜色为红色，即显色区为两条红色线时为阳性，反之只有一条红色控制线时为阴性。
权利要求
1.针对小分子甲萘威建立的配对单克隆抗体及其应用，其特征在于针对小分子甲萘威，采用活性酯法和琥珀酸酐法两种方法形成不同的间隔臂，暴露出不同的抗原位点，再连接大分子蛋白，形成甲萘威小分子人工免疫原I、II，利用杂交瘤技术制备针对不同抗原决定簇的单克隆抗体，之后按双抗体夹心方式筛选出配对的两种抗体I、II，配对单抗可以用于胶体金双抗夹心法的构建，其中一株抗体称为I用于包被试验线，另一株种抗体称为II用于胶体金标记。
2. 根据权利要求i所述的针对小分子甲萘威建立的配对单克隆抗体及其应用，其特征在于连接的大分子包括任何可以和小分子的全部或部分结构结合产生免疫原性的分子。
3. 根据权利要求i所述的针对小分子甲萘威建立的配对单克隆抗体及其应用，其特征在于采用甲萘威小分子人工免疫原i、 n分别免疫小鼠，获得能同时与小分子甲萘威结合的，即针对小分子甲萘威不同抗原决定簇的两种甲萘威单克隆抗体i、 n。
4. 根据权利要求i所述的针对小分子甲萘威建立的配对单克隆抗体及其应用，其特征在于获得配对的甲萘威单克隆抗体可用于甲萘威双抗夹心免疫层析试纸条的制备。
全文摘要
针对小分子甲萘威建立的配对单克隆抗体及其应用，通过分析甲萘威分子结构，用活性酯法和琥珀酸酐法两种方法形成不同的间隔臂，暴露出不同的抗原位点，再连接大分子蛋白，形成甲萘威小分子人工免疫原，利用杂交瘤技术制备针对不同抗原决定簇的单克隆抗体，之后按双抗体夹心方式筛选出配对的两种抗体I、II，配对单抗可以用于胶体金免疫层析双抗夹心法的构建，其中一株抗体称为I用于包被试验线，另一株种抗体称为II用于胶体金标记。本发明所提供的采用甲萘威配对单抗制成的快速免疫检测产品具有特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，结果易读等优点。
文档编号C07K16/44GK101633697SQ20081011718
公开日2010年1月27日 申请日期2008年7月25日 优先权日2008年7月25日
发明者万积成 申请人:万积成