表达重组dsbc的细菌宿主菌株的制作方法

表达重组dsbc的细菌宿主菌株的制作方法
【专利摘要】本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含含有编码DsbC的重组多核苷酸的表达载体和一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
【专利说明】表达重组DSBC的细菌宿主菌株
[0001]本发明涉及重组细菌宿主菌株，特别地大肠杆菌(E.COli)。本发明还涉及用于在此类细胞中产生目标蛋白质的方法。
[0002]发明背景
[0003]细菌细胞例如大肠杆菌通常用于产生不需要糖基化的重组蛋白质。特别地，由于细菌细胞用作宿主细胞允许通过质粒进行基因插入的通用性质，因此使用细菌细胞例如大肠杆菌来产生重组蛋白质具有许多有利方面。大肠杆菌已被用于产生许多重组蛋白，包括人胰岛素。
[0004]尽管使用细菌细胞产生重组蛋白质有许多有利方面，但仍然存在重大限制，包括不良的细胞健康表型。 [0005]因此，仍然需要提供新型细菌菌株，所述菌株为产生重组蛋白质提供有利的工具。
[0006]体液和细胞介导的免疫的产生通过活化的辅助T细胞与抗原呈递细胞(“APC” )和效应T细胞的相互作用来进行协调。辅助T细胞的活化不仅依赖于抗原特异性T细胞受体(“TCR”)与其关联肽MHC配体的相互作用，而且还需要许多细胞粘附和共刺激分子的协同结合(coordinate binding)和活化。
[0007]结合⑶40的天然受体是⑶40配体(⑶40-L=⑶154)，一种以活化依赖性、时间限制的方式在⑶4+T细胞表面上表达的至关重要的共刺激分子。⑶154在活化后也在⑶8+T细胞的一个亚组，嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞和血小板上表达。CD40组成型地、广泛地在许多细胞类型包括B细胞和其它抗原呈递细胞的表面上表达。
[0008]在CD154结合后通过CD40进行的信号转导起始了细胞事件的级联，所述级联导致具有⑶40受体的细胞的活化和最优⑶4+T细胞初敏。更具体地，⑶154对⑶40的结合促进B细胞分化成抗体分泌细胞和记忆B细胞。
[0009]CD 154在调节体液和细胞介导的免疫应答的功能方面的中枢作用已激起人们对将该途径的抑制剂用于治疗性免疫调节的极大兴趣。因此，已显示抗-CD154抗体在众多的针对其它治疗性蛋白质或基因疗法、变应原、自身免疫和移植的免疫应答的模型中是有益的(参见，例如，US 5，474，771和WO 2008/118356，其通过引用整体并入本文)。
[0010]本领域需要高效且经济地产生大量干扰⑶40与⑶154的相互作用、且适合于治疗性应用的抗体或抗体片段。
[0011]发明概述
[0012]本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含:
[0013]a)编码DsbC的重组多核苷酸；和
[0014]b) 一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
[0015]更具体地，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其特征在于所述细胞:
[0016]a)包含编码DsbC的重组多核苷酸；
[0017]b)相较于野生型细胞具有减小的Tsp蛋白活性，和
[0018]c) 一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。[0019]在一个实施方案中，细胞包含野生型spr基因或突变的spr基因，其例如能够抑制具有减小的活性的Tsp表型。
[0020]根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞显示有利的生长和蛋白质生产表型。
[0021]更具体地，本发明 提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，所述细胞包含编码包含组氨酸(His)-标签的DsbC多肽的重组多核苷酸，优选地其中DsbC多肽包含序列his-his-his-his-his-his (6x 组氨酸)。
[0022]更具体地，本发明提供了重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸含有具有根据SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:51的序列的多核苷酸。
[0023]本发明还提供了包含编码DsbC和特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段的重组多核苷酸的表达载体。
[0024]更具体地，本发明提供了表达载体，所述表达载体包含编码含有组氨酸(His)-标签的DsbC多肽的重组多核苷酸，优选地其中DsbC多肽包含序列his-his-his-his-his-his (6x 组氨酸)。
[0025]更具体地，本发明提供了包含重组多核苷酸的表达载体，所述重组多核苷酸含有具有根据SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:51的序列的多核苷酸。
[0026]本发明还提供了用于产生特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的方法，包括:
[0027]a)在有效表达特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段以及编码DsbC的重组多核苷酸的条件下，在培养基中培养上文中定义的重组革兰氏阴性细菌细胞；和
[0028]b)从重组革兰氏阴性细菌细胞的周质和/或培养基回收特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段。
[0029]附图概述
[0030]图1显示用于产生根据本发明实施方案的细胞的载体的构建。
[0031]图2显示包含通过半胱氨酸残基共价地连接至赖氨酰-马来酰亚胺接头的修饰的Fab ’片段的化合物的结构，其中赖氨酰残基上的每一个氨基已共价地将甲氧基PEG残基(其中η为约420至450)连接至其。
[0032]图3显示抗-⑶154 Fab’表达菌株W3110的生长特征以及抗-⑶154 Fab’和重组DsbC表达菌株MXE016(W3110ATsp，spr C94A)的生长特征。可观察到，表达重组DsbC的MXE016菌株相较于W3110菌株,在初始分批相(initial batch phase)中显示改善的生长特征和生长速度。
[0033]图4显示相较于对照菌株W3110，来自表达重组DsbC的MXE016菌株的周质(实心符号)和上清液(空心符号)的总的Fab’产率(g/L)。DsbC表达菌株相较于W3110显示更高的周质Fab’表达。此外，表达DsbC的MXE016菌株相较于菌株W3110显示相等的细胞外Fab，水平。
[0034]图5显示发酵提取物的反向HPLC分析的结果。表达抗-⑶154 Fab’的野生型菌株W3110显示高水平的降解的K轻链(轻链[LC]片段)。相反地，表达重组DsbC和抗-⑶154Fab’的菌株MXE016(W3110ATsp，sprC94A)因Tsp蛋白酶活性的不存在而几乎未显示任何轻链片段。
[0035]图6显示来自菌株W3110和表达重组DsbC的菌株MXEO16 (W3110 Λ Tsp, sprC94A)的发酵物的抗-⑶154 Fab’的收获(g/L)。来自表达重组DsbC的菌株MXE016(W3110ATsp, spr C94A)的收获量显著更高，并且显示显著更少的细胞外Fab’，这是有益的，因为细胞外Fab’是细胞裂解风险的标志，并且细胞外Fab不易于使用与用于周质Fab’的方法相同的方法来回收。
[0036]图7显示(a)菌株W3110细胞和(b)表达重组DsbC的菌株MXE016(W3110ATsp, spr C94A)细胞在(a)和(b)都表达抗-CD154 Fab’ (g/L)的情况下的活力。表达重组DsbC的菌株MXE016细胞(W3110ATsp，spr C94A)显示更高的活力。
[0037]图8显示来自表达抗-⑶154 Fab’的MXE016菌株的发酵物的Fab’总产率(g/L)。右边的条棒表示额外地表达重组DsbC的MXE016菌株。表达重组DsbC的MXE016菌株显示更高的产率。
[0038]图9显示突变的ptr基因内的区域的多核苷酸和氨基酸序列。
[0039]图10显示突变的Tsp基因内的区域的多核苷酸和氨基酸序列。
[0040]图11显示突变的DegP基因内的区域的多核苷酸和氨基酸序列。
[0041]序列概述
[0042]SEQ ID NO:1显``示抗-CD154抗体的CDRHl的氨基酸序列。
[0043]SEQ ID NO: 2显示抗-CD154抗体的CDRH2的氨基酸序列。
[0044]SEQ ID NO: 3显示抗-CD154抗体的CDRH3的氨基酸序列。
[0045]SEQ ID NO:4显示抗-CD154抗体的CDRLl的氨基酸序列。
[0046]SEQ ID NO: 5显示抗-CD154抗体的CDRL2的氨基酸序列。
[0047]SEQ ID NO:6显示抗-CD154抗体的CDRL3的氨基酸序列。
[0048]SEQ ID NO: 7显示抗-CD154抗体(342)的可变轻链(gL4)的多核苷酸和氨基酸序列。
[0049]SEQ ID NO:8显示抗-⑶154抗体(342)的可变轻链(gL4)的氨基酸序列。
[0050]SEQ ID N0:9显示抗-CD154抗体(342)的可变重链(gHl)的多核苷酸和氨基酸序列。
[0051]SEQ ID NO: 10显示抗-⑶154抗体(342)的可变重链(gHl)的氨基酸序列。
[0052]SEQ ID NO: 11显示包含抗-⑶154抗体片段的轻链(gL4)的可变区和恒定区的多核苷酸和氨基酸序列。
[0053]SEQ ID NO: 12显示包含抗-⑶154抗体片段的轻链(gL4)的可变区和恒定区的氨基酸序列。
[0054]SEQ ID NO: 13显示在铰链区具有缺失的包含可变区和CHl区的抗-⑶154抗体的重链片段的多核苷酸和氨基酸序列。
[0055]SEQ ID NO: 14显示在铰链区具有缺失的包含可变区和CHl区的抗-⑶154抗体的重链片段的氨基酸序列。
[0056]SEQ ID NO: 15显示包含可变区、CHl区和铰链区的抗-⑶154抗体的重链片段的多核苷酸和氨基酸序列。
[0057]SEQ ID NO: 16显示包含可变区、CHl区和铰链区的抗-⑶154抗体的重链片段的氨
基酸序列。
[0058]SEQ ID NO: 17显示包含信号肽(氨基酸1_22)的抗-CD154抗体(342)的κ轻链的多核苷酸和氨基酸序列。
[0059]SEQ ID NO: 18显示包含信号肽(氨基酸1_22)的抗-CD154抗体(342)的κ轻链的氨基酸序列。
[0060]SEQ ID NO: 19显示糖基化的IgG4抗-⑶154抗体的整个重链的多核苷酸和氨基酸序列。
[0061]SEQ ID NO: 20显示糖基化的IgG4抗-⑶154抗体的整个重链的氨基酸序列。
[0062]SEQ ID NO: 21显示编码gL4和gHl (无铰链)的多核苷酸序列。
[0063]SEQ ID NO: 22显示编码gL4和gHl的多核苷酸序列。
[0064]SEQ ID NO: 23显示野生型大肠杆菌spr (GenBank目录号D86610)的多核苷酸和氨
基酸序列。
[0065]SEQ ID NO:24显示野生型大肠杆菌spr (GenBank目录号D86610)的氨基酸序列。
[0066]SEQ ID NO: 25显示具有信号序列的野生型大肠杆菌Tsp (GenBank登录号M75634)的多核苷酸和氨基酸序列。
[0067]SEQ ID NO: 26显示具有信号肽的野生型大肠杆菌Tsp (GenBank登录号M75634)的
氨基酸序列。
[0068]SEQ ID NO: 27显示野生型大肠杆菌DsbC(NCBI参照序列AP_003452)的氨基酸序列。
[0069]SEQ ID NO:28显示敲除突变的Tsp基因的多核苷酸序列。
[0070]SEQ ID NO: 29显示野生型大肠杆菌DegP的多核苷酸和氨基酸序列。
[0071]SEQ ID NO: 30显示野生型大肠杆菌DegP的氨基酸序列。
[0072]SEQ ID NO: 31显示包含点突变S210A和Ase I限制标记的DegP的多核苷酸和氨
基酸序列。
[0073]SEQ ID NO: 32显示包含点突变S210A和Ase I限制标记的DegP的氨基酸序列。
[0074]SEQ ID N0:33至36分别显示双顺反子基因间序列(IGS) IGS1、IGS2、IGS3和IGS4。
[0075]SEQ ID NO:37显示野生型大肠杆菌OmpT的多核苷酸和氨基酸序列。
[0076]SEQ ID NO:38显示野生型大肠杆菌OmpT的氨基酸序列。
[0077]SEQ ID NO: 39显示敲除突变的大肠杆菌OmpT的多核苷酸和氨基酸序列。
[0078]SEQ ID NO:40显示敲除突变的大肠杆菌OmpT的氨基酸序列。
[0079]SEQ ID NO:41显示包含点突变D210A和H212A的突变的大肠杆菌OmpT的多核苷酸和氨基酸序列。
[0080]SEQ ID NO:42显示包含点突变D210A和H212A的大肠杆菌OmpT的氨基酸序列。
[0081]SEQ ID NO:43显示野生型大肠杆菌DsbC的多核苷酸和氨基酸序列。
[0082]SEQ ID NO:44显示野生型大肠杆菌DsbC的氨基酸序列。
[0083]SEQ ID NO:45显示缺乏EcoRI限制位点的、具有His-标签的大肠杆菌DsbC的多核苷酸和氨基酸序列。
[0084]SEQ ID NO:46显示缺乏EcoRI限制位点的、具有His-标签的大肠杆菌DsbC的氨
基酸序列。
[0085]SEQ ID NO:47显示引物6283 Tsp3'的多核苷酸序列。
[0086]SEQ ID NO:48显示引物6283 Tsp5'的多核苷酸序列。[0087]SEQ ID NO:49显示野生型大肠杆菌ptr (根据GenBank登录号X06227的蛋白酶III)的多核苷酸和氨基酸序列。
[0088]SEQ ID NO: 50显示野生型大肠杆菌ptr (根据GenBank登录号X06227的蛋白酶III)的氨基酸序列。
[0089]SEQ ID NO: 51显示具有His-标签的野生型大肠杆菌DsbC的多核苷酸和氨基酸序列。
[0090]SEQ ID NO: 52显示具有His-标签的野生型大肠杆菌DsbC的氨基酸序列。
[0091]发明详述
[0092]Tsp (也称为Prc)是60kDa周质蛋白酶。Tsp的最早已知底物是青霉素结合蛋白-3 (PBP3)(参与大肠杆菌的青霉素结合蛋白3的C末端加工的切割位点的测定(Hara等人，4799-813 ；Nagasawa等人，5890-93)，但在后来发现Tsp也能够切割噬菌体尾蛋白，从而其更名为尾特异性蛋白酶(Tail Specific Protease, Tsp) (Silber, Keiler,和 Sauer295-99 ;Silber和Sauer 237-40)描述了 prc缺失菌株(KS1000)，其中通过用包含Kanr标记的片段置换Prc基因区段来产生突变。
[0093]期望减小Tsp (prc)活性，以减少目标蛋白质的蛋白水解。Fab蛋白水解可自身表现为杂质例如可称为轻链杂质的片段的存在。
[0094]然而，已发现，缺乏蛋白酶prc的细胞在低渗透性下显示热敏生长。Hara等人分离了包含基因外抑制子(spr)突变的抗热回复子(Hara等人63-72)。Spr是18kDa的膜结合周质蛋白酶，并且spr的底物为Tsp和外膜中的在细胞分裂过程中参与细胞壁水解的肽聚糖。Spr 基因被命名为 UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_EC0LI)。
[0095]蛋白质二硫化物异构酶是在蛋白质折叠时催化蛋白质内半胱氨酸残基之间的二硫键的形成和断裂的酶。已知共表达催化二硫键形成的蛋白质能够改善宿主细胞的蛋白质表达。WO 98/56930公开了用于在细菌细胞中产生含二硫键的异源多肽的方法，其中将原核生物二硫化物异构酶例如DsbC或DsbG与真核生物多肽共表达。US 6，673，569公开了用于产生外来蛋白的包含编码DsbA、DsbB、DsbC和DsbD的每一个的多核苷酸的人工操纵子。EP0786009公开了用于在细菌中产生异源多肽的方法，其中，在诱导编码异源多肽的核酸表达之前，诱导编码DsbA或DsbC的核酸表达。
[0096]DsbC是在大肠杆菌的周质中发现的原核生物蛋白质，其在大肠杆菌中催化二硫键的形成。DsbC具有236个氨基酸的氨基酸序列长度(包括信号肽)，分子量为25.6KDa (UniProt N0.P0AEG6)。DsbC 最早于 1994 年被鉴定(Missiakas, Georgopoulos 和Raina 2013-20 ；Shevchik, Condemine 和 Robert-Baudouy 2007-12)。
[0097]已令人惊讶地发现，DsbC在革兰氏阴性细菌细胞中的过表达在缺乏蛋白酶Tsp的细胞的培养过程中减小了裂解。因此，本发明人提供了对于产生目标蛋白质具有有利性质的新型菌株。
[0098]具有上述遗传修饰的特定组合的革兰氏阴性细菌细胞显示有利的生长和蛋白质生产表型。
[0099]在一个实施方案中，细胞的基因组优选对于野生型细菌细胞是等基因的，除了相较于野生型细胞减小Tsp蛋白活性所需的修饰外。
[0100]在其它实施方案中，根据本发明的细胞相较于野生型细胞具有减小的Tsp蛋白活性，并且包含编码DsbC和改变的spr蛋白的重组多核苷酸。在该实施方案中，细胞的基因组优选与野生型细菌细胞是等基因的，除了突变的spr基因和导致Tsp蛋白的表达减少或不存在(相较于野生型细胞)的修饰外。
[0101]除非上下文另外指出，否则术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。“肽”意指20个或更少的氨基酸。
[0102]除非上下文另外指出，否则术语“多核苷酸”包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA及其类似物，包括但不限于锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)等。
[0103]如本文中所用，术语“包含”在本说明书的上下文中应当解释为“包括”。
[0104]本发明背景中的非突变的细胞或对照细胞意指，与本发明的重组革兰氏阴性细胞是相同类型的细胞，其中所述细胞未被修饰以具有编码DsbC的重组多核苷酸和一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。例如，非突变的细胞可以是野生型细胞和可来源于与修饰(以引入任何重组多核苷酸)前本发明的细胞相同的宿主细胞群体。
[0105]表述“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和“菌株”可互换使用。 [0106]在本发明的背景中，术语“等基因的”意指，细胞相较于野生型细胞包含相同的或大体上相同的核酸序列，除了其中包含的表征本发明的元件外，所述元件例如编码DsbC的重组多核苷酸和一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及任选地导致Tsp蛋白的表达减少或不存在的修饰，以及任选地突变的spr基因。在该实施方案中，根据本发明的细胞不包含其它的、对其基因组的非天然存在的改变或基因工程改变。
[0107]在其中将编码DsbC的多核苷酸和/或一个或多个编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸插入细胞的基因组的一个实施方案中，根据本发明的细胞相较于野生型细胞，可具有大体上相同的基因组序列，除了编码DsbC的多核苷酸和/或一个或多个编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及任选地导致Tsp蛋白的表达减少或不存在、或具有减小的蛋白酶活性的Tsp蛋白的表达的修饰，以及任选地编码相较于野生型具有减小的活性的蛋白质的突变的spr基因外，并且考虑可能发生的任何天然存在的突变。在其中将编码DsbC的多核苷酸和/或一个或多个编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸插入细胞的基因组的一个实施方案中，根据本发明的细胞相较于野生型细胞，可具有完全相同的基因组序列，除了编码DsbC的多核苷酸和/或一个或多个编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸外。
[0108]编码DsbC的多核苷酸可存在于转化入细胞和/或整合入宿主细胞基因组的适当的表达载体上。在其中将编码DsbC的多核苷酸插入宿主细胞基因组的实施方案中，本发明的细胞因插入的编码DsbC的多核苷酸而与野生型细胞不同。在该实施方案中，宿主细胞基因组相较于野生型细胞基因组可以是等基因的，除了编码DsbC的重组多核苷酸外。
[0109]优选地，编码DsbC的多核苷酸在细胞中存在于表达载体上，从而对宿主细胞的基因组造成最小限度的破坏。
[0110]可将一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸包含在转化入细胞和/或整合入宿主细胞基因组的适当表达载体内。在其中将编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸插入宿主基因组的实施方案中，本发明的细胞因插入的编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸而与野生型细胞不同。在该实施方案中，宿主细胞基因组相较于野生型细胞基因组可以是等基因的，除了编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸外。优选地，编码目标蛋白的多核苷酸在细胞内中存在于表达载体中，从而对宿主细胞的基因组造成最小程度的破坏。
[0111]在一个实施方案中，将编码DsbC的重组多核苷酸和编码特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸插入宿主的基因组。在该实施方案中，本发明的细胞与野生型细胞相异在于，插入的编码DsbC的重组多核苷酸和一个或多个编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及任选地导致Tsp蛋白的减少的表达或无表达或具有减小的蛋白酶活性的Tsp蛋白的表达的修饰，以及任选地编码相较于野生型具有减小的活性的蛋白的突变的spr基因。在该实施方案中，宿主细胞基因组相较于野生型细胞基因组可以是等基因的，除了编码DsbC的重组多核苷酸和一个或多个编抗体或其抗原结合片段的多核苷酸外。
[0112]在优选实施方案中，编码DsbC的重组多核苷酸与编码特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸在细胞中存在于相同或不同的表达载体中，从而引起最小程度的对宿主细胞基因组的破坏。在该实施方案中，细胞的基因组相较于野生型细胞的基因组，可以是大体上相同的或完全相同的。
[0113]在一个实施方案中，提供了具有减小的Tsp活性和任选地spr基因或其突变体的重组大肠杆菌细胞，其中对Tsp活性的修饰和spr基因的任何突变通过细胞基因组的改变来实现。可用载体例如编码载体DsbC和特异性结合CD154的抗体或其结合片段的质粒转化根据该实施方案的细胞。在一个实施方案中，载体或质粒未整合入细胞的基因组。
[0114]在本发明的背景中 ，术语“野生型”意指，可天然存在或可从环境分离的革兰氏阴性细菌细胞的菌株，其不具有任何重组多核苷酸或基因工程突变。大肠杆菌的野生型菌株的实例是K-12菌株及其系谱菌株W3110。大肠杆菌菌株K-12现已培养了 90年(Bachmann525-57)。大肠杆菌菌株K-12及其系谱菌株例如W3110在本领域是公知的。菌株W3110可以例如在目录号27325下从美国典型培养物保藏中心(American Tissue CultureCollection, ATCC)获得。W3110 具有基因型:F' λ _、IN(rrnD-rrnE) 1、rph_l。
[0115]本发明人已提供了适合用于表达特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含编码DsbC的重组多核苷酸。
[0116]根据本发明的细胞包含编码DsbC的重组多核苷酸。如本文中所用，“重组多肽”是指，使用重组DNA技术构建和产生的蛋白质。编码DsbC的多核苷酸可与在野生型细菌细胞中发现的编码DsbC的内源多核苷酸相同。或者，编码DsbC的重组多核苷酸是野生型DsbC多核苷酸的突变形式，例如被改变以从DsbC蛋白除去限制位点例如EcoRI位点，和/或his-标签。用于本发明的示例性修饰的DsbC多核苷酸示于SEQ ID N0:45，其编码SEQID NO:46所示的his-标记的DsbC序列。
[0117]DsbC的特征在于，包含氨基酸-CXXC-的活性部位的存在，其中XX代表氨基酸GY。DsbC的变体包括其中每一个X代表独立地选择的氨基酸的变体(前提是XX不代表GY)。XX的实例包括 NY、SF、TF、MF、GF、HH、VH、SH、RF、FA、GA、MA、GI 或 AV。
[0118]在一个实施方案中，本发明的宿主细胞包含DsbC的变体，例如其中活性部位被改变的变体，特别地如上文中所描述的。
[0119]在一个实施方案中，DsbC的变体具有至少野生型蛋白质的生物学活性，例如如在体外测定中测量的。
[0120]在一个实施方案中，DsbC的变体具有比野生型蛋白质更高的生物学活性，例如如在体外测定中测量的。
[0121]在一个实施方案中，DsbC的变体在活性部位-CXXC-中具有改变，其中XX代表NY、SF、TF、MF、GF、HH、VH、SH。
[0122]在一个实施方案中，DsbC是野生型。
[0123]本发明人已发现，细菌细胞中编码DsbC的重组多核苷酸的表达的选择提供了用于表达特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的改善的宿主细胞。本发明提供的细胞相较于野生型细菌细胞，具有改善的细胞健康和生长表型。
[0124]如本文中使用的，改善的细胞健康意指，相较于不具有根据本发明的特征的细胞的一个或多个改善的性质，例如在生长期或在细胞中诱导异源蛋白质表达后更低的细胞裂解倾向性，或本领域技术人员已知的其它有益性质。
[0125]根据本发明的细胞相较于野生型细菌细胞，显示改善的蛋白质例如抗体或抗体片段生产产率。改善的蛋白质产率可以是，蛋白质产生速度和/或从细胞产生蛋白质的持续时间。改善的蛋白质产率可以是周质蛋白质产率和/或上清液蛋白质产率。重组细菌细胞能够加快蛋白质例如抗体或其片段的产生速度，从而相较于非突变的细菌细胞，可在更短的时间中产生相同量的目标蛋白质。更快的目标蛋白质产生速度可在细胞生长的初始期中(例如在诱导蛋白质表达后前5、10、20或30个小时中)是特别显著的。
[0126]根据本发明的细胞优选在周质和/或培养基中表达约1.0g/L、1.5g/L、1.8g/L、
2.0g/L、2.4g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L 或 4.0g/L 产率的抗体。
[0127]有利地，减小的Tsp蛋白质活性和/或DsbC的共表达导致在本文中称为轻链片段(LC)的不期望的杂质的减少的产生，参见例如图5。
[0128]本领域技术人员可容易地使用本领域公知的方法，包括发酵法、ELISA和蛋白质GHPLC来测试候选细胞克隆，以确定其是否具有期望的目标蛋白质产率。适当的发酵法描述于(Humphreys等人193-202;Backlund等人358-65,其通过引用整体并入本文)中。本领域技术人员还可容易地使用本领域公知的方法，例如蛋白质G HPLC、圆二色性、NMR、X射线晶体学和表位亲和力测量法来测试分泌的蛋白，以确定所述蛋白质是否正确折叠。
[0129]在一个实施方案中，根据本发明的细胞相较于对应的野生型细胞例如大肠杆菌W3110K-12菌株，还表达或过表达一种或多种如下的其它蛋白质:
[0130]?一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白质，例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD ；和/或
[0131]?一种或多种能够促进蛋白质分泌或转位的蛋白质，例如SecY、SecE, SecG,SecYEG, SecA、SecB, FtsY 和 Lep ;和 / 或
[0132]?一种或多种能够促进二硫键形成的蛋白质，例如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
[0133]可将一种或多种上述蛋白质整合入细胞的基因组和/或插入表达载体。
[0134]在一个实施方案中，根据本发明的细胞不表达或以比对应的野生型细胞例如大肠杆菌W3110 K-12菌株的水平低至少50%、75%或90%的水平表达一种或多种如下的其它蛋白质:
[0135]?一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白质，例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD ；[0136]?—种或多种能够促进蛋白质分泌或迁移的蛋白质，例如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY 和 Lep ;和
[0137].一种或多种能够促进二硫键形成的蛋白质,例如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
[0138]在一个实施方案中，根据本发明的细胞还表达一种或多种选自FkpA、Skp及其组合的其它蛋白质。
[0139]在一个实施方案中，细胞还包含下列突变的基因的一种或多种:
[0140]a)突变的spr基因；
[0141]b)突变的Tsp基因，其中突变的Tsp基因编码具有减小的蛋白酶活性的Tsp蛋白或为敲除突变的Tsp基因；[0142]c)编码具有伴侣分子活性和减小的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因；
[0143]d)突变的ptr基因，其中突变的ptr基因编码具有减小的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白或为敲除突变的Ptr基因；和
[0144]e)突变的OmpT基因，其中突变的OmpT基因编码具有减小的蛋白酶活性的OmpT蛋白，例如如SEQ ID N0:42中显示的，或为敲除突变的OmpT基因，例如如SEQ ID N0:40中显示的。
[0145]在本发明的基础实施方案中，革兰氏阴性细菌细胞不具有敲除突变的Tsp基因，例如缺乏染色体Tsp。
[0146]后一突变在特异性结合⑶154的抗体或其片段的产生中是特别重要的，因为Tsp蛋白酶活性可导致抗体产物在肘区域中发生切割，从而以显著的量产生副产物和减少期望
的产物的产率。
[0147]因此，在一个实施方案中，根据本发明的细胞包含突变的Tsp基因，其中突变的Tsp基因编码具有减小的蛋白酶活性的Tsp蛋白，或为敲除突变的Tsp基因，并且除了特异于⑶154的抗体或片段以外，还编码DsbC蛋白。
[0148]在本发明的实施方案中，细胞还包含突变的spr基因。spr蛋白是大肠杆菌膜结合周质蛋白酶。
[0149]Spr蛋白的野生型氨基酸序列示于SEQ ID NO: 24中，其在N末端具有信号序列(根据UniProt登录号P0AFV4的氨基酸1_26)。本发明的Spr蛋白序列的氨基酸编号包括信号序列。因此，Spr蛋白的氨基酸I是SEQ ID NO:24中显示的第一个氨基酸(Met)。
[0150]在其中根据本发明的细胞包含突变的spr基因的实施方案中，突变的spr基因优选是细胞染色体spr基因。突变的spr基因编码能够抑制与包含突变的Tsp基因的细胞相关的不利表型的Spr蛋白。具有突变的Tsp基因的细胞可具有良好的细胞生长速度，但这些细胞的一个限制是，它们易于裂解的倾向(尤其在高细胞密度下)。因此，包含突变的Tsp基因的细胞的表型为倾向于裂解，尤其在高细胞密度下。
[0151]具有突变的Tsp基因的细胞在低渗透性下显示热敏生长。然而，本发明的细胞所具有的spr突变,当被引入至具有减小的Tsp活性的细胞中时,抑制在低渗透性下的该热敏生长的表型，并且细胞显示减小的裂解，尤其在高细胞密度下。细胞的该“热敏生长”表型可在摇瓶或高细胞密度发酵技术中由本领域技术人员容易地测量。根据具有spr突变体和具有减小的Tsp活性的细胞(相较于具有Tsp突变体和野生型spr的细胞)所展示的改善的生长速度和/或重组蛋白产生(尤其在周质中)，细胞裂解的抑制很显著。[0152]根据本发明的细胞优选包含编码具有一个或多个选自N31、R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147、H157 和 W174的氨基酸的改变，更优选在一个或多个选自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147、H157和W174的氨基酸上的改变的spr蛋白的突变的spr基因。优选地突变的spr基因编码spr蛋白，所述spr蛋白具有一个或多个选自N31、R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147 和 H157 的氨基酸的改变，更优选在一个或多个选自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147和H157的氨基酸上的改变。在该实施方案中，spr蛋白优选不具有任何其它氨基酸改变。优选地，突变的spr基因编码spr蛋白，所述spr蛋白具有一个或多个选自N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144和G147的氨基酸的改变，更优选在一个或多个选自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的氨基酸上的改变。在该实施方案中，spr蛋白优选不具有任何其它氨基酸改变。
[0153]本发明人已鉴定了能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的生长表型的spr改变。
[0154]本发明人还令人惊讶地发现，相较于野生型细胞具有重组DsbC基因、突变的spr基因和具有减小的Tsp蛋白活性的细胞，相较于包含突变的Tsp基因的细胞，显示增加的细胞生长速度和增加的细胞存活持续时间。特别地，具有重组DsbC基因、spr蛋白的变化和具有减少的Tsp蛋白活性的细胞，相较于具有突变的Tsp基因的细胞，在培养过程中显示减小的细胞裂解。
[0155]—个或多个上述spr氨基酸的变化可以是对编码氨基酸的核苷酸的1、2或3个核苷酸的任何适当的错义突变的结果。所述突变将氨基酸残基改变成导致能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的突变的spr蛋白的任何适当的氨基酸。错义突变可将氨基酸改变成不同尺寸的和/或相较于野生型氨基酸具有不同化学性质的氨基酸。
[0156]在一个实施方案中，变化针对于C94、H145和H157氨基酸残基的催化三联体(triad)的1、2或3个氨基酸残基(Aramini等人,9715-17)。
[0157]因此，突变的spr基因可包含:
[0158]?影响氨基酸C94的突变；或
[0159]?影响氨基酸H145的突变；或
[0160]?影响氨基酸H157的突变；或
[0161]?影响氨基酸C94和H145的突变；或
[0162]?影响氨基酸C94和H157的突变；或
[0163]?影响氨基酸H145和H157的突变；或
[0164]?影响氨基酸C94、H145和H157的突变。
[0165]在该实施方案中，spr蛋白优选不具有任何其它氨基酸变化。
[0166]可将C94、H145和H157中的1、2或3个改变成导致能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白质的任何适当的氨基酸。例如，可将C94、H145和H157中的1、2或3个改变成小氨基酸例如Gly或Ala。因此，spr蛋白可具有，导致C94A( 即，位置94上的半胱氨酸改变成丙氨酸)、H145A(即，位置145上的组氨酸改变成丙氨酸)和H157A (即，位置157上的组氨酸改变成丙氨酸)的突变中的1、2或3个突变。优选，spr基因包含导致H145A的错义突变，已发现所述突变产生能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白。
[0167]本文中的置换突变体的命名由一个字母后跟一个数字然后再跟一个字母组成。第一个字母代表野生型蛋白质中的氨基酸。数字代表进行氨基酸置换的氨基酸位置，第二个字母代表用于替代野生型氨基酸的氨基酸。
[0168]在优选实施方案中，突变的spr蛋白包含一个或多个选自N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144 和 G147 的氨基酸的改变，优选一个或多个选自395、￥98、￥115、0133、￥135和6147的氨基酸的改变。在该实施方案中，spr蛋白优选不具有任何其它突变。因此，突变的spr基因可包含:
[0169]?影响氨基酸N31的突变；或
[0170]?影响氨基酸R62的突变；或
[0171]?影响氨基酸170的突变；或
[0172]?影响氨基酸Q73的突变；或
[0173]?影响氨基酸S95的突变；或
[0174]?影响氨基酸V98的突变；或
`[0175]?影响氨基酸Q99的突变；或
[0176]?影响氨基酸RlOO的突变；或
[0177]?影响氨基酸L108的突变；或
[0178]?影响氨基酸Yl 15的突变；或
[0179]?影响氨基酸D133的突变；或
[0180]籲影响氨基酸V135的突变；或
[0181]?影响氨基酸L136的突变；或
[0182]?影响氨基酸G140的突变；或
[0183]?影响氨基酸R144的突变；或
[0184]?影响氨基酸G147的突变。
[0185]在一个实施方案中，突变的spr基因包含影响下述氨基酸的多个突变:
[0186]籲595和丫115;或
[0187]籲N31、Q73、R100 和 G140 ;或
[0188].Q73、R100 和 G140 ;或
[0189]^RlOO 和 G140;或
[0190]?Q73 和 G140;或
[0191]籲Q73 和 R100;或
[0192].R62、Q99 和 R144 ;或
[0193]?Q99 和 R144。
[0194]可将氨基酸吧1、1?62、170、073、595、￥98、099、1?100、1^108、￥115、0133、￥135、1^136、G140、R144和G147中的一个或多个改变成导致能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白的任何适当的氨基酸。例如，可将N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、RlOO、L108、Y115、D133、V135、L136、G140和R144中的一个或多个改变成小氨基酸例如Gly或Ala。
[0195]在优选实施方案中，spr蛋白包含下列改变中的一个或多个:N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D 或 V135G、L136P、G140C、R144C和G147C。优选地，spr蛋白包含下列改变中的一个或多个:S95F、V98E、Y115F、D133A、V13?或V135G和G147C。在该实施方案中，spr蛋白优选地不具有任何其它氨基酸改变。
[0196]在一个实施方案中，spr蛋白仅具有一个选自N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Yl 15F、D133A、V135D 或 V135G、L136P、G140C、R144C 和 G147C 的氨基酸改变，特别地C94A。在该实施方案中，spr蛋白优选不具有任何其它氨基酸改变。
[0197]在其它实施方案中，spr蛋白具有选自下列的多个改变:
[0198]籲S95F 和 Y115F;
[0199]? N31Y、Q73R、R100G 和 G140C ;
[0200]? Q73R、R100G 和 G140C;
[0201]? R100G 和 G140C ;
[0202]?Q73R 和 G140C;
[0203]?Q73R 和 R100G;
[0204]? R62C、Q99P 和 R144C ;或
[0205]? Q99P 和 R14 4C。
[0206]优选，突变的spr基因编码具有选自C94A、D133A、H145A和H157A的氨基酸改变(特别地具有C94A)的spr蛋白。
[0207]在其它实施方案中，突变的spr基因编码具有氨基酸改变W174R的spr蛋白。在备选实施方案中，spr蛋白不具有氨基酸改变W174R。
[0208]根据本发明的细胞相较于野生型细胞具有减小的Tsp蛋白活性活性。表述“相较于野生型细胞减小的Tsp蛋白活性活性”意指，与野生型细胞的Tsp活性相比较，细胞的Tsp活性减小。可通过任何适当的方法修饰细胞以减小Tsp的活性。
[0209]在一个实施方案中，减小的Tsp活性由编码Tsp的内源多核苷酸和/或相关调控表达序列的修饰导致。修饰可减少或终止Tsp基因转录和翻译，或可提供相较于野生型Tsp蛋白具有减小的蛋白酶活性的表达的Tsp蛋白。
[0210]在一个实施方案中，修饰相关调控表达序列以减少Tsp表达。例如，可突变Tsp基因的启动子以阻止基因的表达。
[0211]在优选实施方案中，根据本发明的细胞具有编码具有减小的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因，或具有敲除突变的Tsp基因。优选突变染色体Tsp基因。
[0212]如本文中所用，“Tsp基因”意指，编码蛋白酶Tsp(也称为Prc)的基因，所述蛋白酶是能够作用于青霉素结合蛋白_3(PBP3)和噬菌体尾蛋白的周质蛋白酶。野生型Tsp基因的序列示于SEQ ID NO:25中，野生型Tsp蛋白的序列示于SEQ ID NO:26中。
[0213]除非另有所指，否则突变的Tsp基因或突变的编码Tsp的Tsp基因是指，编码具有减小的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因。
[0214]本发明背景中的表述“编码具有减小的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因”意指，突变的Tsp基因相较于野生型非突变的Tsp基因不具有完全蛋白酶活性。
[0215]优选地，突变的Tsp基因编码具有50%或更少，40%或更少，30%或更少，20%或更少，10%或更少或5%或更少的野生型非突变的Tsp蛋白的蛋白酶活性的Tsp蛋白。更优选，突变的Tsp基因编码不具有蛋白酶活性的Tsp蛋白。在该实施方案中，细胞不缺乏染色体Tsp,即Tsp基因序列未被缺失或突变以阻止任何形式的Tsp蛋白表达。[0216]可将任何适当的突变引入Tsp基因以产生具有减小的蛋白酶活性的蛋白质。从革兰氏阴性细菌表达的Tsp蛋白的蛋白酶活性可通过本领域内的任何适当的方法，例如Keiler等人(Keiler和Sauer 28864-68,其通过引用整体并入本文)描述的测试Tsp蛋白酶活性的方法，由本领域技术人员容易地测试。
[0217]Tsp在Keiler等人(同上)中已被报导为具有包含残基S430、D441和K455的活性部位，并且残基G375、G376、E433和T452对于维持Tsp的结构是非常重要的。Keiler等人(同上)报导了发现:导致氨基酸改变 S430A、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A和T452A的突变的Tsp基因不具有可检测的蛋白酶活性。还已报导，导致S430C的突变的Tsp基因显示约5-10%的野生型活性。因此，产生具有减小的蛋白酶活性的蛋白的Tsp突变可包含突变，例如导致残基S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452中的一个或多个的改变的错义突变。优选地，产生具有减小的蛋白酶活性的蛋白的Tsp突变可包含突变，例如影响活性部位残基S430、D441和K455中的1、2或所有3个的错义突变。
[0218]因此，突变的Tsp基因可包含:
[0219]?影响氨基酸S430的突变；或
[0220]籲影响氨基酸D441的突变；或
[0221]?影响氨基酸K455的突变；或籲
[0222]籲影响氨基酸S430和D441的突变；或
[0223]籲影响氨基酸S430和K455的突变；或
[0224]?影响氨基酸D441和K455的突变；或
[0225]?影响氨基酸S430、D441和K455的突变。
[0226]可将残基S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452中的一个或多个改变成导致具有减小的蛋白酶活性的蛋白质的任何适当的氨基酸。适当的改变的实例是S430A、S430C、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A 和 T452A。突变的 Tsp 基因可包含导致活性部位残基的改变的1、2或3个突变，例如基因可包含:
[0227]? S430A 或 S430C ;和 / 或
[0228]? D441A ;和 / 或
[0229]? K455A 或 K455H 或 K455R。
[0230]优选，Tsp基因具有导致S430A或S430C的突变。
[0231]在本发明背景中，表述“敲除突变的Tsp基因”意指，Tsp基因包含一个或多个阻止由野生型基因编码的Tsp蛋白的表达以提供缺乏Tsp蛋白的细胞的突变。敲除的基因可被部分或完全转录但不被翻译成编码的蛋白质。敲除突变的Tsp基因可以以任何适当的方式，例如通过一个或多个缺失、插入、点突变、错义突变、无义突变和移码突变来进行突变，以使蛋白质不表达。例如，可通过将外源DNA序列例如抗生素抗性标记插入基因编码序列来敲除基因。
[0232]在优选实施方案中，Tsp基因不通过将外来DNA序列例如抗生素抗性标记插入基因编码区来进行突变。在一个实施方案中，Tsp基因包含对基因起始密码子的突变，和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子，从而阻止Tsp蛋白表达。对起始密码子的突变可以是起始密码子的1、2或所有3个核苷酸的错义突变。备选地或此外，起始密码子可通过插入或缺失移码突变来进行突变。Tsp基因在编码序列的5’末端包含两个ATG密码子，所述ATG密码子的一个或两个可通过错义突变来进行突变。Tsp基因可在第二 ATG密码子(密码子3)上被突变成TCG，如图10中显示的。备选地或另外地，Tsp基因可包含一个或多个位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的终止密码子。优选地，敲除突变的Tsp基因包含对起始密码子的错义突变和一个或多个插入的终止密码子。在优选实施方案中，将Tsp基因突变以缺失第5密码子的“T”，从而引起在密码子11和16上产生终止密码子的移码，如图10中显示的。在优选实施方案中，将Tsp基因突变以插入Ase I限制位点，从而在密码子21上产生第三框内终止密码子，如图10中显示的。
[0233]在优选实施方案中，敲除突变的Tsp基因具有SEQ ID NO: 25的DNA序列，其包含起始密码子上游的6个核苷酸ATGAAT。已在SEQ IDNO: 25的敲除突变的Tsp序列中产生的突变示于图10中。在一个实施方案中，突变的Tsp基因具有SEQ ID NO: 25的核苷酸7至2048的DNA序列。 [0234]在本发明的实施方案中，细胞包含突变的DegP基因。如本文中所用，“DegP”意指，编码DegP蛋白(也称为HtrA)的基因，其具有作为伴侣分子和蛋白酶的双重功能。野生型DegP基因的序列示于SEQ ID NO: 29中，非突变的DegP蛋白的序列示于SEQ ID NO: 30中。
[0235]在低温下，DegP用作伴侣分子，在高温下，DegP具有用作蛋白酶的偏爱性。
[0236]在其中细胞包含DegP突变的实施方案中，细胞中的DegP突变提供了编码具有伴侣分子活性但不具有完全蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因。
[0237]在本发明的背景中，表述“具有伴侣分子活性”意指，突变的DegP蛋白相较于野生型非突变DegP蛋白，具有相同或大体上相同的伴侣分子活性。优选地，突变的DegP基因编码具有50%或更多，60%或更多，70%或更多，80%或更多，90%或更多或95%或更多的野生型非突变DegP蛋白的伴侣分子活性的DegP蛋白。更优选，突变的DegP基因编码具有与野生型DegP相同的伴侣分子活性的DegP蛋白。
[0238]在本发明的背景中，表述“具有减小的蛋白酶活性”意指，突变的DegP蛋白相较于野生型非突变DegP蛋白，不具有完全蛋白酶活性。优选地，突变的DegP基因编码具有50%或更少,40%或更少，30%或更少，20%或更少，10%或更少或5%或更少的野生型非突变DegP蛋白的蛋白酶活性的DegP蛋白。更优选，突变的DegP基因编码不具有蛋白酶活性的DegP蛋白。细胞不缺乏染色体DegP，即DegP基因序列未被删除或突变来阻止任何形式的DegP蛋白的表达。
[0239]可将任何适当的突变引入DegP基因，以产生具有伴侣分子活性和减小的蛋白酶活性的蛋白质。从革兰氏阴性细菌表达的DegP蛋白的蛋白酶和伴侣分子活性可通过任何适当的方法(例如，其中利用MalS(DegP的天然底物)测试DegP的蛋白酶和伴侣分子活性的方法)由本领域技术人员容易地测试。
[0240]DegP是丝氨酸蛋白酶，并且具有由氨基酸残基Hisl05、Aspl35和Ser210的催化三联体组成的活性中心。产生具有伴侣分子活性和减小的蛋白酶活性的蛋白质的DegP突变可包含突变，例如影响Hisl05、Aspl35和Ser210中的1、2或3个的错义突变。
[0241]因此，突变的DegP基因可包含:
[0242]?影响氨基酸Hisl05的突变；或
[0243]?影响氨基酸的突变；或[0244]?影响氨基酸的突变；或
[0245]?影响氨基酸Hisl05和Aspl35的突变；或
[0246]?影响氨基酸Hisl05和Ser210的突变；或
[0247]?影响氨基酸Aspl35和Ser210的突变；或
[0248]?影响氨基酸Hisl05、Aspl35和Ser210的突变。 [0249]可将Hisl05、Aspl35和Ser210中的1、2或3个改变成导致具有伴侣活性和减小的蛋白酶活性的蛋白质的任何适当的氨基酸。例如，可将His 105、Asp 135和Ser210中的1、2或3个改变成小的氨基酸例如Gly或Ala。其它适当的突变是将Hisl05、Aspl35和Ser210中的1、2或3个改变成具有相反性质的氨基酸，例如Aspl35被改变成Lys或Arg，极性Hisl05被改变成非极性氨基酸例如Gly、Ala、Val或Leu，以及小的亲水Ser210被改变成大的或疏水残基例如Val、Leu、Phe或Tyr。优选，DegP基因包含改变S210A，如图11中显示，已发现所述改变产生具有伴侣活性但无蛋白酶活性的蛋白质。
[0250]DegP具有两个PDZ结构域，PDZl (残基260-358)和TOZ2 (残基359-448)，其介导蛋白质间相互作用。在本发明的一个实施方案中，将DegP基因突变以删除H)Z1结构域和/或H)Z2结构域。rozi和H)Z2的缺失导致DegP蛋白的蛋白酶活性的完全丧失，和相较于野生型DegP蛋白降低的伴侣活性，然而rozi或H)Z2的缺失导致相较于野生型DegP蛋白，5%的蛋白酶活性和相似的伴侣活性。
[0251]突变的DegP基因还可包含沉默的非天然存在的限制位点例如Asel，以辅助鉴定和筛选方法，例如如图11中显示的。
[0252]包含点突变S210A和Ase I限制标记位点的突变的DegP基因的优选序列提供于SEQ ID N0:31中，编码的蛋白质序列示于SEQ ID N0:27中。已在SEQ ID N0:32的突变的DegP序列中产生的突变示于图11中。
[0253]在其中细胞包含编码具有伴侣活性和减小的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因的本发明的实施方案中，本发明提供的一种或多种细胞，相较于其中DegP基因已被突变以敲除DegP (从而阻止DegP表达)例如缺乏染色体DegP的突变细胞，可提供改善的来自细胞的正确折叠的蛋白质的产率。在包含敲除突变的DegP基因(从而阻止DegP表达)的细胞中，DegP的伴侣活性完全丧失，然而在根据本发明的细胞中，DegP的伴侣活性得以保留，同时丧失完全蛋白酶活性。在这些实施方案中，根据本发明的一种或多种细胞具有更低的蛋白酶活性以阻止蛋白质的蛋白水解，同时维持伴侣活性以允许蛋白质在宿主细胞中的正确折叠和转运。
[0254]在一个实施方案中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不具有敲除突变的OmpT基因，例如缺乏染色体OmpT SEQ ID N0:39。
[0255]在一个实施方案中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不具有敲除突变的DegP基因，例如缺乏染色体degP。在一个实施方案中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不具有突变的DegP基因。
[0256]在一个实施方案中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不具有有敲除突变的ptr基因，例如缺乏染色体Ptr。
[0257]在一个实施方案中，根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞不具有突变的spr基因。
[0258]任何适当的革兰氏阴性细菌可用作产生本发明的重组细胞的亲代细胞。适当的革兰氏阴性细菌包括，鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、突光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、志贺菌属(Shigella)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团病杆菌(Legionellapneumophila)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)和大肠杆菌。优选地，亲代细胞是大肠杆菌。任何适当的大肠杆菌菌株可用于本发明，但优选使用野生型W3110菌株例如K-12 W3110。
[0259]与先前产生的和用于表达重组蛋白质的菌株相关的缺点包括，在大肠杆菌菌株中使用参与细胞代谢和DNA复制的基因(例如phoA、fhuA、lac、rec、gal、ara、arg、thi和pro)的突变。这些突变可对宿主细胞具有许多有害作用，包括对细胞生长、稳定性、周质渗漏、重组蛋白质表达产率和毒性的影响。具有一个或多个此类基因突变的菌株，特别地具有许多此类突变的菌株，可显示将细菌生长速度降至不适合于工业蛋白质生产的水平的适合性的丧失。此外，任何上述基因突变可以以不可预测的有害方式顺式和/或反式地影响其它基因，从而改变菌株的表型、适合性和蛋白质特征谱。此外，严重突变的细胞通常不适合用于产生商业用途的重组蛋白质(特别地治疗剂)，因为此类菌株通常具有缺陷型代谢途径，从而在基本培养基或化学成分确定的培养基中可不良地生长或完全不生长。
[0260]在优选实施方案中，细胞仅具有最小突变来引入编码DsbC的重组多核苷酸和一个或多个编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及任选地导致减小的Tsp蛋白酶活性的突变，和任选地spr基因或其突变体。
[0261]在其中将编码DsbC的多核苷酸和/或一个或多个编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸插入细胞的基因组的一个实施方案中，仅对细胞基因组进行最小突变来引入编码DsbC和/或抗体的重组 多核苷酸。在其中编码DsbC的重组多核苷酸和编码抗体的多核苷酸存在于相同或不同表达载体中的其它实施方案中，基因组优选对于野生型细胞基因组是等基因的。
[0262]在一个实施方案中，细胞不具有可对细胞的生长和/或表达目标蛋白质的能力具有有害作用的任何其它突变。因此，本发明的一种或多种重组宿主细胞，相较于包含对基因组序列的基因工程突变的细胞，可显示改善的蛋白质表达和/或改善的生长特征。本发明提供的细胞相较于包含对细胞基因组的破坏的细胞，更适合用于产生治疗性蛋白质。
[0263]在优选实施方案中，除了编码DsbC的重组多核苷酸和一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸，以及任选地导致减小的Tsp蛋白酶活性的突变和任选地spr基因或其突变体外，细胞对于野生型大肠杆菌细胞是等基因的。
[0264]在一个实施方案中，提供了与适合于表达DsbC和特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段的质粒一起使用的细胞，所述细胞除了减小的Tsp活性以及spr基因或其变体外，与大肠杆菌菌株W3110是等基因。
[0265]更优选，根据本发明的细胞，除了编码DsbC的重组多核苷酸和一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸外，对于大肠杆菌菌株W3110是等基因的。
[0266]本发明提供的细胞包含一个或多个编码具有对于CD154的特异性的抗原结合抗体片段的多核苷酸。
[0267]如本文中使用的，“细胞包含”意指，相关实体被整合入细胞的基因组，或细胞包含含有所述实体且通常用于表达所述实体的载体，例如质粒。
[0268]抗体或抗体片段可以是多价的、多特异性的、人源化的、完全人的或嵌合的。抗体或抗体片段可来自任何物种，但优选来源于单克隆抗体、人抗体或人源化片段。抗体片段可来源于免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG，IgE, IgM, IgD或IgA)或亚类，且可获自任何物种，包括例如小鼠、大鼠、鲨鱼、兔、猪、仓鼠、骆骑、美洲驼羊、山羊或人。抗体片段的部分可获自超过一个物种，例如抗体片段可以是嵌合的。在一个实例中，恒定区来自一个物种且可变区来自另一个物种。
[0269]抗体片段可以是VH，VL, VHH, Fab,修饰的Fab, Fab’，F(ab’)2或Fv片段；轻链或重链单体或二聚体；以及双链抗体；三链抗体；四链抗体；微型抗体(minibody);结构域抗体或单链抗体，例如其中重链和轻链可变结构域通过肽接头连接的单链Fv、Fab-Fv或双异性抗体例如Fab-dAb，如WO 2009/040562中描述的。类似地，适当时，可将重链和轻链可变区与其它抗体结构域组合。抗体片段在本领域是已知的(Holliger和Hudsonl 126-36)。 [0270]特异性结合CD154的抗体优选为WO 2008/118356 (其内容通过引用并入本文)中描述的抗体342，或包含WO 2008/118356中描述的抗体342的⑶R或重链和轻链可变区。特异性结合CD154的抗体片段优选来源于W02008/118356中描述的抗体342和/或包含所述抗体的CDR或重链和轻链可变区。
[0271]在一个实施方案中，特异性结合CD154的抗体或抗体片段包含其中可变结构域包含3个CDR的重链，其中所述CDR选自SEQ ID NO:1 (对于CDRH1)、SEQ ID NO:2 (对于CDRH2)和 SEQ ID NO: 3 (对于 CDRH3)。
[0272]在一个实施方案中，特异性结合CD154的抗体或抗体片段包含其中可变结构域包含3个CDR的轻链，其中所述CDR选自SEQ ID勵:4(对于0)虬1)、5￡0 ID NO:5 (对于CDRL2)和 SEQ ID N0:6(对于 CDRL3)。
[0273]在一个实施方案中，特异性结合CD154的抗体或抗体片段包含重链，所述重链包含 SEQ ID NO:1 的序列(对于 CDRH1)、SEQ ID NO: 2 的序列(对于 CDRH2)和 SEQ ID NO: 3的序列(对于CDRH3)。
[0274]在一个实施方案中，特异性结合CD154的抗体或抗体片段包含轻链，所述轻链包含 SEQ ID N0:4 的序列(对于 CDRL1)、SEQ ID N0:5 的序列(对于 CDRL2)和 SEQ ID NO:6的序列(对于CDRL3)。
[0275]在一个实施方案中，特异性结合⑶154的抗体或抗体片段包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:1的序列(对于CDRH1)、SEQ ID NO: 2的序列(对于CDRH2)和SEQ IDNO: 3的序列(对于CDRH3)，所述轻链包含SEQ ID NO: 4的序列(对于CDRL1)、SEQ ID NO: 5的序列(对于CDRL2)和SEQ ID NO:6的序列(对于CDRL3)。
[0276]抗体优选是⑶R移植的抗体分子，并且通常地可变结构域包含人受体构架区和非人供体⑶R。
[0277]优选，抗体包含轻链可变结构域(SEQ ID N0:7)和重链可变结构域(SEQ IDNO:9)。
[0278]优选,抗体是Fab片段。优选，Fab片段具有包含SEQ ID N0:14所示的序列或由SEQ ID NO: 14所示的序列组成的重链和包含SEQ ID NO: 12所示的序列或由SEQ ID NO: 12所示的序列组成的轻链。SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 12所示的氨基酸序列优选分别由SEQID NO: 13和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列编码。
[0279]或者，优选抗体片段是修饰的Fab片段，其中修饰是向其重链的C末端添加一个或多个氨基酸以允许连接效应分子或报道分子。优选，额外的氨基酸形成包含一个或两个半胱氨酸(可将效应分子或报道分子连接至所述半胱氨酸)的修饰的铰链区，如本领域已知的(参见例如，WO 98/25971，其通过引用整体并入本文)。
[0280]根据本发明的细胞包含编码抗体的DNA序列。优选，DNA序列编码抗体的重链和轻链。
[0281]在一个优选实施方案中，DNA序列编码轻链并且包含本文中显示的序列。
[0282]DNA序列可包括合成的DNA (例如通过化学加工产生的)、cDNA、基因组DNA或其任何组合。
[0283]可根据抗体分子的期望的功能(特别地可能需要的效应子功能)选择抗体的恒定区结构域(如果存在的话)。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。具体地，当抗体分子意欲用于治疗性应用且需要抗体效应子功能时，可使用人IgG恒定区，特别地IgG1和IgG3同种型的恒定区。或者，当抗体分子意欲用于治疗性目的且不需要抗体效应子功能，例如仅用于阻断CD154活性时，可使用IgG2和IgG4同种型。
[0284]抗体可用于治疗疾病或障碍，包括炎性疾病和障碍、免疫疾病和障碍、纤维化障碍和癌症。
[0285]术语“炎性疾病”或“自身免疫障碍”和“免疫疾病或障碍”包括类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、幼年型关节炎、斯蒂尔病、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、干燥综合征、古德帕斯彻氏综合征、阿狄森病、脉管炎包括ANCA-相关脉管炎和Wegener氏肉芽肿、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、格-巴二氏综合征、抗磷脂综合征、特发性血小板减少、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、寻常型天疱疮、皮肌炎、大疱性类天疱疮、Henoch-Schdnlein紫癜、Muckle Wells病、银屑病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、SLE(系统性红斑狼疮)、乳糜泻、哮喘、变应性鼻炎、异位性皮炎、多发性硬化、脉管炎、I型糖尿病、移植和移植物抗宿主病。
[0286]如本文中所用，术语"纤维化障碍"是指，特征在于器官或组织中过度纤维性结缔组织的形成或发展(通过作为修复或反应性过程)的障碍。纤维化障碍可影响单个器官例如肺(例如但不限于，特发性肺纤维化、间质性肺病)、肝、肠、肾、心脏或皮肤，或影响多个器官例如但不限于系统性硬化。术语纤维化障碍还涉及皮肤的结瘢。皮肤的结瘢包括但不限于瘢痕疙瘩、在例如但不限于皮肤烧伤后发生的挛缩瘢痕、肥大性瘢痕和粉刺瘢痕。
[0287]本发明的宿主细胞还可包含编码一种或多种其它目标蛋白质的其它多核苷酸。
[0288]根据本发明的重组革兰氏阴性细菌细胞可通过任何适当的方法来产生。
[0289]本领域技术人员已知可用于插入编码DsbC的重组多核苷酸和编码抗体的多核苷酸的适当技术。可使用适当的载体，例如Link等人(其通过引用整体并入本文，Link, Phillips和Church 6228-37)中描述的pK03，将编码DsbC的重组多核苷酸和/或编码抗体的多核苷酸整合入细胞的基因组。
[0290]备选地或此外，编码DsbC的重组多核苷酸和/或编码抗体的多核苷酸可以是非整合的，存在于重组表达盒中。在一个实施方案中，将表达盒用于本发明以携带编码DsbC的多核苷酸和/或编码抗体的多核苷酸，所述表达盒通常包含编码DsbC的蛋白质编码序列、一个或多个编码抗体的蛋白质编码序列以及一个或多个表达调控序列。一个或多个表达调控序列可包括启动子。一个或多个表达调控序列还可包括3’非翻译区例如终止序列。适当的启动子在下文中进行了更详细的描述。
[0291]在一个实施方案中，将编码DsbC和/或抗体或其片段的基因整合入宿主细胞的基因组以产生稳定的细胞系。
[0292]在一个实施方案中，根据本发明的细胞包含一个或多个表达载体例如质粒。载体优选包含一个或多个上文中定义的表达盒。宿主细胞优选包含含有编码特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段的DNA的表达载体，如上文中描述的。优选，表达载体包含编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的轻链的多核苷酸序列和编码其重链的多核苷酸序列。
[0293]在优选实施方案中,表达载体是大肠杆菌表达载体。
[0294]在一个实施方案中，将编码抗体的多核苷酸序列和编码DsbC的多核苷酸插入分开的表达载体。
[0295]为了产生包含重链和轻链的产物，可用两个载体转化细胞系，第一载体编码轻链多肽并且第二载体编码重链多肽。或者，可使用单个载体，所述载体包含编码轻链和重链多肽的序列。
[0296]或者，将编码抗体的多核苷酸序列和编码DsbC的多核苷酸插入一个载体。优选，载体包含编码抗体的轻链和重链多肽的序列。
[0297]本发明还提供了包含编码DsbC和特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的重组多核苷酸的表达载体。表达载体是包含编码DsbC的多核苷酸序列和编码抗体的多核苷酸序列的多顺反子载体。
[0298]多顺反子载体可通过有利的克隆法来产生，所述克隆法允许将多核苷酸序列连续重复克隆入载体。该方法使用一对限制位点的相容性粘性末端例如Ase I和Nde I限制位点的“AT”末端。可将包含编码序列和具有相容性粘性末端的多核苷酸例如Ase1-NdeI片段克隆入载体的限制位点例如Nde I。多核苷酸序列的插入破坏了 5’限制位点但产生了新的3’限制位点例如Ndel，随后将其用于插入其它包含相容性粘性末端的多核苷酸序列。随后重复方法以插入其它序列。插入载体的每一个多核苷酸序列在终止密码子的3’端包含非编码序列，所述非编码序列可包含Ssp I位点(用于筛选)、Shine Dalgarno核糖体结合序列、富含A的间隔子以及编码起始密码子的NdeI位点。
[0299]包含编码抗体的轻链(LC)、抗体的重链(HC)的多核苷酸序列、DsbC多核苷酸序列和其它多核苷酸序列的载体的产生的示意图示于图1中。
[0300]根据本发明的细胞优选包含上文中定义的表达载体。
[0301]在其中细胞还表达一种或多种如下的其它蛋白质的实施方案中:
[0302]?一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白质，例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD ；和/或
[0303]?一种或多种能够促进蛋白质分泌或转运的蛋白质，例如SecY、SecE, SecG,SecYEG, SecA, SecB, FtsY 和 Lep ;和 / 或
[0304]?一种或多种能够促进二硫键形成的蛋白质，例如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG ；
[0305]可从一个或多个多核苷酸表达所述一种或多种其它蛋白质，所述一个或多个多核苷酸插入与编码DsbC的多核苷酸和/或一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸相同的载体。或者，可将所述一个或多个多核苷酸插入分开的载体。
[0306]可通过将一个或多个上文中定义的表达盒插入适当的载体来产生表达载体。或者，可将用于指导多核苷酸序列表达的表达调控序列包含在表达载体中，从而可仅需要多核苷酸的编码区来完成表达载体。
[0307]可将编 码DsbC的多核苷酸和/或编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸适当地插入可复制的载体，通常地自主复制的表达载体，以在细胞中在用于该细胞的适当的启动子的控制下进行表达。用于该目的的许多载体在本领域是已知的，并且适当的载体的选择可取决于核酸的尺寸和具体的细胞类型。
[0308]可用于将根据本发明的多核苷酸转化入宿主细胞的表达载体的实例包括:
[0309]?质粒例如 pBR322 或 pACYC184，和 / 或
[0310]?病毒载体例如细菌噬菌体
[0311]?转座遗传元件例如转座子
[0312]此类表达载体通常包含质粒DNA复制起始点、抗生素选择标记、通过多克隆位点(表达盒)分隔的启动子和转录终止子以及编码核糖体结合位点的DNA序列。
[0313]可将本发明中使用的启动子直接连接至相关多核苷酸，或可选择地所述启动子可例如在载体中位于适当的位置，从而当将相关多肽插入时，相关启动子可作用于所述多肽。在一个实施方案中，启动子位于其所作用的多核苷酸的编码部分之前，例如相关启动子位于多核苷酸的每一个编码部分之前。如本文中所用，“之前”意指，启动子相对于编码多核苷酸部分位于5’末端。
[0314]启动子对于宿主细胞可以是内源的或外源的。适当的启动子包括lac、tac、trp、phoA、Ipp、Arab、tet 和 T7。
[0315]使用的一个或多个启动子可以是诱导型启动子。在其中将编码DsbC的多核苷酸和编码抗体的多核苷酸插入一个载体的实施方案中，编码DsbC和抗体的核苷酸序列可在单个启动子或分开的启动子的控制之下。在其中编码DsbC和抗体的核苷酸序列在分开的启动子控制下的实施方案中，启动子可独立地是诱导型启动子。
[0316]用于细菌系统的启动子通常还包含可操作地连接于编码目标多肽的DNA的Shine-Dalgamo (S.D.)序列。可通过限制性酶消化从细菌来源的DNA取出启动子，随后将其插入包含期望的DNA的载体中。
[0317]表达载体优选还包含用于产生抗体或其抗原结合片段的双顺反子信息，如WO03/048208或WO 2007/039714 (其内容通过引用整体并入本文)中描述的。优选，上游顺反子包含编码抗体轻链的DNA并且下游顺反子包含编码对应重链的DNA，双顺反子基因间序列(IGS)优选包含选自 IGSl (SEQ ID NO: 33)、IGS2 (SEQ ID NO: 34)、IGS3 (SEQ ID NO: 35)和 IGS4(SEQ ID NO:36)的序列。
[0318]优选地表达载体包含上述用于产生抗体或其抗原结合片段的轻链和重链的三顺反子信息和用于产生重组DsbC(优选包含his-标签)的信息。
[0319]终止子对于宿主细胞可以是内源的或外源的。适当的终止子是rrnB。
[0320]其它适当的转录调控子(包括启动子和终止子)和蛋白质祀向法可见于Makrides等人(其通过引用整体并入本文，Makrides 512-38)。[0321]插入表达载体的DsbC多核苷酸优选包含编码DsbC信号序列和DsbC编码序列的核酸。还可通过基因融合至其它信号肽(例如来自下述蛋白质的那些信号肽:0mpA、MalB、PelB、PhoA、PhoS、LppA、DsbA)来将DsbC蛋白导向周质。载体优选包含使得载体能够在一种或多种选择的宿主细胞中复制，优选独立于宿主染色体复制的核酸序列。对于多种细菌，此类序列是公知的。
[0322]在一个实施方案中，DsbC和/或目标蛋白质在N末端和/或C末端包含组氨酸_标签。
[0323]可通过适当的信号序列从细胞分泌抗体分子或将其靶向周质。或者，抗体分子可在细胞的细胞质中积累。优选，将抗体分子靶向周质。
[0324]可将编码抗体的多核苷酸表达为与另一种多肽(优选信号序列或在成熟多肽的N末端具有特定切割位点的其它多肽)的融合蛋白。选择的异源信号序列应当是被宿主细胞识别和加工的信号序列。对于不识别和加工天然或真核多肽信号序列的原核宿主细胞，利用原核信号序列来置换所述信号序列。适当的信号序列包括OmpA、PhoA、LamB, PelB、DsbA和DsbC。在其中细胞包含编码抗体重链的多核苷酸和编码抗体轻链的多核苷酸的实施方案中，每一个多核苷酸可包含信号序列，例如OmpA。
[0325]包含一个或多个上文所列组件的适当的载体的构建可使用标准连接技术。将分离的质粒或DNA片段切割、裁剪，且以期望的形式再连接以产生需要的质粒。可籍以构建载体的一般方法、转染法、培养法对于本领域技术人员来说是公知的。
[0326]可将分子生物学 的标准技术用于制备编码抗体的DNA序列。期望的DNA序列可使用寡核苷酸合成技术来完全或部分地合成。适当时，可使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
[0327]本文中针对多核苷酸所描述的本发明实施方案同样地可用于本发明的可选择的实施方案，例如包含本文中使用的组件的载体、表达盒和/或宿主细胞，只要相关方面可用于所述实施方案。
[0328]本发明还提供了用于产生特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的方法，包括:
[0329]在有效表达特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段以及编码DsbC的重组多核苷酸的条件下，在培养基中培养上文中定义的重组革兰氏阴性细菌细胞；和
[0330]从重组革兰氏阴性细菌细胞的周质和/或培养基中回收特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段。
[0331]优选用于本发明方法的革兰氏阴性细菌细胞和抗体在上文中进行了详细描述。
[0332]可使用本领域已知的任何适当方法，将编码DsbC的重组多核苷酸和编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸整合入宿主细胞。如上文中论述的，通常地将编码DsbC的多核苷酸和编码抗体的多核苷酸整合为相同或分开的表达载体的部分，并将所述表达载体转化入细胞。
[0333]可使用标准技术，例如使用氯化铷、PEG或电穿孔，将编码DsbC的多核苷酸和编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸转化入细胞。
[0334]根据本发明的方法还可使用选择系统，以促进选择已成功地用编码目标蛋白的多核苷酸进行了转化的稳定细胞。选择系统通常利用编码选择标记的多核苷酸的共转化。在一个实施方案中，每一个转化入细胞的多核苷酸还包含编码一个或多个选择标记的多核苷酸。因此，编码DsbC和特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸以及一个或多个编码标记的多核苷酸的转化一起进行，并且可将选择系统用于选择产生期望的蛋白质的那些细胞。
[0335]能够表达一个或多个标记的细胞，由于包含在其中的选择系统的多肽/基因或多肽组件所赋予的性质(例如抗生素抗性)，而能够在某些人工施加的条件(例如添加毒素或抗生素)下存活/生长/增殖。不能表达一个或多个标记的那些细胞不能在人工施加的条件下存活/生长/增殖。可根据需要选择更严苛或较不严苛的人工施加的条件。
[0336]可将任何适当的选择系统用于本发明。通常地，选择系统可基于将一个或多个提供针对已知抗生素的抗性的基因例如四环素、氯霉素、卡那霉素或青霉素抗性基因包含在载体中。可选择在相关抗生素存在的情况下生长的细胞，因为它们表达提供对抗生素的抗性的基因和期望的蛋白质。[0337]可将诱导型表达系统或组成型启动子用于本发明，以表达抗体和/或DsbC。适当的诱导型表达系统和组成型启动子在本领域是公知的。
[0338]在其中编码DsbC的多核苷酸和编码抗体的多核苷酸在相同或分开的诱导型启动子控制之下的一个实施方案中，编码抗体的多核苷酸和编码DsbC的重组多核苷酸的表达通过向培养基中添加诱导剂而被诱导。
[0339]可将任何适当的培养基用于培养转化的细胞。培养基可经改造以适用于特定选择系统，例如培养基可包含抗生素，以仅允许已被成功转化的那些细胞在培养基中生长。
[0340]可根据需要将获自培养基的细胞经历进一步的筛选和/或纯化。需要时，该方法还可包括提取和纯化目标蛋白质的一个或多个步骤。
[0341]可从菌株，包括从细胞质、周质或上清液回收和纯化抗体或其抗原结合片段。适当的方法包括，在免疫亲和或离子交换柱上进行的分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC ;疏水相互作用层析；在硅土上进行的层析；在离子交换树脂例如S-SEPHAR0SE和DEAE上进行的层析；层析聚集；硫酸铵沉淀；和凝胶过滤。
[0342]在一个实施方案中，该方法还包括，将抗体或其抗原结合片段与DsbC分离。
[0343]可通过常规抗体纯化法，适当地将抗体或其抗原结合片段从培养基和/或细胞质提取物和/或周质提取物中分离，所述方法例如蛋白A-Sepharose、蛋白G层析、蛋白L层析、嗜硫、混合模式树脂、His-标签、FLAG标签、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、亲和层析、硫酸铵、乙醇或PEG分级分离/沉淀、离子交换膜、膨胀床吸附层析(EBA)或模拟移动床色谱。
[0344]所述方法还可包括，测量目标蛋白质的表达量和选择具有高目标蛋白质表达水平的细胞的进一步步骤。
[0345]可在适当的容器例如生物反应器中组合地进行本文中描述的一个或多个方法步骤。
[0346]在表达后，可以进一步加工抗体，例如通过缀合至另一种实体例如效应分子。因此，根据本发明的方法可包括，将效应分子连接至抗体的进一步步骤。
[0347]如本文中所用，术语效应分子包括例如，抗肿瘤剂、药物、毒素(例如细菌或植物来源的酶促活性毒素及其片段，例如蓖麻蛋白及其片段)、生物学活性蛋白例如酶、其它抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段、放射性核素特别地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团例如荧光化合物或可通过NMR或ESR光谱法检测的化合物。可通过任何适当的方法将效应分子连接至抗体或其片段，例如可如WO 2005/003171或WO 2005/003170 (其内容通过引用整体并入本文)中所述，修饰抗体片段以连接至少一种效应分子。WO 2005/003171或WO 2005/003170还描述了适当的效应分子。
[0348]抗体可具有用于螯合重金属原子的大环，或通过共价桥连结构连接至其的毒素例如蓖麻蛋白。或者，重组DNA技术的方法可用于产生抗体分子，其中完整免疫球蛋白分子的Fe片段(CH2、CH3和铰链结构域)、CH2和CH3结构域或CH3结构域已被功能性非免疫球蛋白(例如酶或毒素分子)替代，或已通过肽键连接至所述功能性非免疫球蛋白。在其中抗体是在其重链的C末端具有一个或多个允许连接效应分子或报道分子的氨基酸的修饰的Fab片段的实施方案中，额外的氨基酸优选形成包含一个或两个半胱氨酸残基(可将效应分子或报道分子连接至所述半胱氨酸残基)的修饰的铰链区。
[0349]优选的效应基团是聚合物分子，其可被连接至修饰的Fab片段以增加其体内半衰期。
[0350]聚合物分子通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如任选地取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基(polyalkenylene)或聚氧化烯聚合物或分支或未分支的多糖例如同聚多糖或异聚多糖。
[0351]可存在于上述合成的聚合物上的特定任选的取代基包括，一个或多个羟基、甲基或甲氧基。合成聚合物的具体实例包括，任选地取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任选地取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。具体的天然存在的聚合物包括，乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。如本文中所用，“衍生物”意欲包括反应性衍生物，例如巯基选择性反应性基团例如马来酰亚胺等。反应性基团可直接或通过接头区段连接至聚合物。应理解，此类基团的残基在一些情况下作为抗体片段与聚合物之间的连接基团构成产物的部分。
[0352]聚合物的尺寸可根据需要变化，但通常在500Da至50000Da，优选5000Da至40000Da和更优选25000Da至40000Da的平均分子量范围内。特别地，可基于产物的期望用途选择聚合物尺寸。因此，例如，当期望产物离开循环和渗入组织，例如用于治疗炎症时，可有利地使用小分子量聚合物(例如具有约5000Da的分子量)。对于其中产物保留在循环中的应用，可有利地使用更高分子量的聚合物(例如具有在25000Da至40000Da的范围内的分子量)。
[0353]特别优选的聚合物包括，聚亚烷基聚合物例如聚(乙二醇)或，尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，尤其是具有约25000Da至约40000Da的分子量。
[0354]可将每一个连接至修饰的抗体片段的聚合物分子共价地连接至位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价连接通常是二硫键或特别地硫-碳键。
[0355]当需要时，抗体片段可具有一个或多个连接至其上的效应分子或报道分子。效应分子或报道分子可通过任何可获得的位于片段中的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团，例如任何游离氨基、亚胺基、羟基或羧基连接至抗体片段。可将一个或多个效应分子或报道分子连接至抗体的重链和/轻链的C末端上的或朝向C末端的氨基酸。[0356]活化的聚合物可在上述聚合物修饰的抗体片段的制备中用作起始材料。活化的聚合物可以是，包含巯基反应性基团例如a -卤代羧酸或酯例如碘乙酰胺、二酰亚胺例如马来酰亚胺、乙烯基砜或二硫化物的任何聚合物。此类起始材料可商购获得(例如获自Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA)或可使用常规化学法从商购可得的起始材料制备。
[0357]当期望获得连接至效应分子或报道分子的抗体片段时，这可通过标准化学法或重组DNA法来制备，在所述方法中，根据需要，在与活化的聚合物反应之前或之后，将抗体片段直接或通过偶联剂连接至效应分子或报道分子。具体的化学方法包括例如WO 93/62331和WO 92/22583中描述的那些方法。或者，当效应分子或报道分子是蛋白质或多肽时，连接可使用重组DNA法，例如WO 86/01533和EP-A-0392745中描述的方法来实现。
[0358]优选，按照EP-A-0948544中公开的方法，对通过本发明方法提供的修饰的Fab片段进行PEG化(即，共价地连接PEG (聚(乙二醇))。优选地，抗体为PEG化的修饰的Fab片段，如图2中显示的。如图2中所示，修饰的Fab片段将赖氨酰-马来酰亚胺-衍生基团连接至重链的修饰铰链区的C末端上的半胱氨酸残基之一，其中，赖氨酰残基的两个氨基的每一个已共价地连接具有约20000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)残基，从而甲氧基聚(乙二醇)残基的总的平均分子量为约40000Da，更优选赖氨酰-马来酰亚胺-衍生基团为[1_[ [ [2-[[3-(2, 5- 二氧-1-吡咯烷基)-1-氧丙基]氨基]乙基]氨基]-羧基]-1，5-戍二基]双(亚胺羰基)。赖氨酸残基共价地连接至马来酰亚胺基。赖氨酸残基上的每一个氨基连接至具有约20000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。整个效应分子的总分子量从而为约40000Da。 [0359]因此，根据本发明的方法优选包括，将赖氨酰-马来酰亚胺基团连接至重链C末端上的半胱氨酸残基之一，其中赖氨酰残基的每一个氨基已共价地连接具有约20000Da的分子量的甲氧基聚(乙二醇)残基。
[0360]在一个实施方案中，通过将氨基酸标签添加至C末端或N末端来改变污染性宿主蛋白质的物理性质。在优选实施方案中，被改变的物理性质是等电点，氨基酸标签是连接至C末端的聚天冬氨酸标签。在一个实施方案中，通过添加所述标签而被改变的大肠杆菌蛋白质是二肽结合蛋白(DppA)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白和磷酸结合蛋白(PhoS/PstS)。在一个具体实施方案中,通过向C末端添加聚天冬氨酸标签(polyD)(包含6个天冬氨酸残基)来使大肠杆菌磷酸结合蛋白(PhoS/PstS)的pi从7.2降至5.1。
[0361]还优选的是，污染性大肠杆菌蛋白的特定残基的修饰，其单独地或与N或C末端标签的添加组合地改变所述蛋白的物理性质。此类改变可包括，改变蛋白质尺寸的插入或缺失，或改变Pl或疏水性的氨基酸置换。在一个实施方案中，这些残基位于蛋白质的表面上。在优选实施方案中，改变PhoS蛋白的表面残基以降低蛋白质的pi。优选地，避免已被认为在磷酸结合中是非常重要的残基(US 5，304，472)，以维持功能性PhoS蛋白质。
实施例
[0362]细胞系
[0363]对于所有实验，将大肠杆菌细胞系W3110用作亲代野生型细胞系。
[0364]产生具有下列突变的细胞系:[0365]a.突变的Tsp基因；
[0366]b.突变的Tsp基因和具有重组DsbC;
[0367]c.突变的Tsp基因和突变的spr基因；
[0368]d.突变的Tsp基因和突变的spr基因以及具有重组DsbC。
[0369]实施例1具有突变的Tsp基因的细胞系MXE001 ( A Tsp)的产生
[0370]如下产牛MXE001菌株:
[0371]将Tsp盒作为Sal I, Not I限制性片段移入相似地限制性消化的pK03质粒。pK03质粒使用PSClOl复制起始点(RepA)的温度敏感型突变体以及氯霉素标记，用于施加压力和选择染色体整合事件。编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因对于在蔗糖中生长的大肠杆菌是致命的，因此(与氯霉素标记和PSClOl起始点一起)用于施加压力和选择去整合和质粒消除事件(plasmid curing event)。该方法先前已进行了描述(Hamilton等人4617-22 ;Blomfield等人1447-57)。pK03系统，除了插入的基因外，从宿主基因组中除去了所有选择
[0372]构律下列质粒: [0373]DMXE191,其包含SEQ ID NO: 28中显示的敲除突变的Tsp基因，包含EcoR I和AseI限制性标记。
[0374]随后将质粒转化入电感受态大肠杆菌W3110细胞，所述细胞使用Miller和Nickoloff (其通过引用整体并入本文，Miller和Nickoloff 105-13)中描述的方法来制备。
[0375]第I天:在于2500V, 25 ii F和200 Q下进行电穿孔之前，将40 iU大肠杆菌细胞与(IOpg) I u I pK03DNA在冷冻的BioRad 0.2cm电穿孔杯中混合。立即添加1000 u I 2xPY,通过在培养箱中于30°C下以250rpm振荡I小时来恢复细胞。将细胞在2xPY中以1/10连续稀释，随后将100 u I等分试样涂铺在以30°C和43°C预温热的含有20 u g/ml的氯霉素的2xPY琼脂板上。将板在30°C和43°C温育过夜。
[0376]第2天:在30°C生长的菌落的数目提供了电穿孔效率的评估，而在43°C存活生长的菌落代表潜在整合事件。挑选来自43°C板的单个菌落，将其重悬浮于IOml的2xPY中。将100 u I的该悬浮液涂铺在预温热至30°C的包含5%(w/v)的蔗糖的2xPY琼脂板上，以产生单独的菌落。将板在30°C温育过夜。
[0377]第3天:此处的菌落代表潜在的同时存在的去整合和质粒消除事件。如果去整合和消除事件在生长早期发生，则菌落团块是克隆性的。挑选单个菌落，将其重复涂铺于包含20 u g/ml的氯霉素或5%(w/v)蔗糖的2xPY琼脂上。将板在30°C温育过夜。
[0378]第4天:在蔗糖上生长且死于氯霉素的菌落代表潜在染色体置换和质粒消除事件。挑选这些菌落，且利用突变特异性寡核苷酸通过PCR进行筛选。将产生正确尺寸的阳性PCR条带的菌落在含有5%(w/v)蔗糖的2xPY琼脂上划线，以产生单个菌落，且将板在30°C温育过夜。
[0379]第5天:将PCR阳性、氯霉素敏感性和抗蔗糖的大肠杆菌单菌落用于制备甘油原液，化学感受态细胞，以及用作利用5’和3’侧翼寡核苷酸引物的PCR反应的PCR模板，以产生用于使用Taq聚合酶的直接DNA测序的PCR产物。
[0380]使用寡核苷酸引物，通过PCR扩增包含非天然存在的Ase I限制位点的Tsp基因的区域(SEQ ID N0:28)，测试细胞菌株MXE001，以确认具有突变的Tsp基因的基因组DNA的成功修饰。随后在用Ase I限制性酶温育之前和之后，通过凝胶电泳分析DNA的扩增区域，以确认非天然存在的Ase I限制位点在突变的基因中的存在。如下进行该方法:
[0381]使用PCR，将下列寡核苷酸用于扩增来自从MXE001和W3110制备的大肠杆菌细胞裂解物的基因组DNA:
[0382]6284 Tsp 3' 5，-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3’ (SEQ ID NO:47)
[0383]6283 Tsp 5' 5’ -GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3，(SEQ ID NO:48)
[0384]通过在95°C于20 U I Ix PCR缓冲液中加热单个菌落的细胞10分钟来制备裂解物。使混合物冷却至室温，随后以13，200rpm离心10分钟。取出上清液，标记为‘细胞裂解物，。
[0385]使用Tsp寡核苷酸对扩增每一个菌株。
[0386]使用标准PCR法扩增DNA。
[0387]
【权利要求】
1.一种重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含: a)包含编码DsbC的重组多核苷酸的表达载体；和 b)一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
2.权利要求1的革兰氏阴性细菌细胞，其中DsbC在N末端或C末端上包含组氨酸-标签。
3.权利要求1或2的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述表达载体包含具有SEQID NO:45或SEQ ID NO:51中所示的序列的多核苷酸。
4.权利要求1至3的任一项的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包含3个CDR，所述CDR对于CDRHl具有SEQ ID NO:1中所示的序列、对于CDRH2具有SEQ ID NO: 2中所示的序列和对于⑶RH3具有SEQ ID NO:3中所示的序列，以及所述轻链可变结构域包含3个⑶R，所述⑶R对于CDRLl具有SEQ ID NO:4中所示的序列，对于CDRL2具有SEQ ID NO:5中所示的序列和对于CDRL3具有SEQ ID NO:6所示的序列。
5.权利要求4的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述一个或多个多核苷酸编码抗体，所述抗体包含SEQ ID N0:8中所示的轻链可变区序列和SEQ ID NO: 10中所示的重链可变区。
6.权利要求1至5的任一项的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述抗体是Fab或Fab’片段。
7.权利要求6的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述Fab或Fab’片段包含具有SEQIDNO: 12中所示的序列的轻链和具有SEQ ID NO: 14或16中所示的序列的重链。
8.权利要求1至7的任一项的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述革兰氏阴性细菌细胞包含第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体包含编码DsbC的重组多核苷酸，并且所述第二表达载体包含一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
9.权利要求1至7的任一项的革兰氏阴性细菌细胞，其中包含编码DsbC的重组多核苷酸的表达载体额外地包含一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
10.权利要求1至9的任一项的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细胞相较于野生型细胞具有减小的Tsp蛋白活性，并且包含编码改变的spr蛋白的重组多核苷酸。
11.权利要求10的革兰氏阴性细菌细胞，其中编码Tsp的多核苷酸包含敲除突变，并且编码改变的spr蛋白的多核苷酸包含影响氨基酸C94的突变。
12.权利要求11的革兰氏阴性细菌细胞，其中编码改变的spr蛋白的多核苷酸的突变导致，位置94上的氨基酸半胱氨酸改变成丙氨酸(C94A)。
13.权利要求1至12的任一项的革兰氏阴性细菌细胞，其中除了编码DsbC的重组多核苷酸和一个或多个编码特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸外，所述细胞对于野生型细菌细胞是等基因的。
14.权利要求1至13的任一项的革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细胞是大肠杆菌。
15.—种表达载体，其包含编码DsbC的重组多核苷酸和用于产生特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段的双顺反子信息，其中上游顺反子包含编码抗体轻链的DNA并且下游顺反子包含编码对应重链的DNA，其特征在于所述双顺反子信息包含选自IGS1(SEQ IDNO:33), IGS2(SEQ ID NO: 34)、IGS3 (SEQ ID NO:35)和 IGS4 (SEQ ID NO:36)的序列。
16.权利要求15的表达载体，其中特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段如权利要求4至7的任一项中所定义。
17.权利要求15或16的表达载体，其中所述DsbC如权利要求2或3中所定义。
18.权利要求1至14的任一项的革兰氏阴性细菌细胞，其包含权利要求15至17的任一项中定义的表达载体。
19.一种用于产生特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段的方法，包括: a)在有效表达特异性结合⑶154的抗体或其抗原结合片段和编码DsbC的重组多核苷酸的条件下，在培养基中培养权利要求1至14或18的任一项中定义的重组革兰氏阴性细菌细胞；和 b)从所述重组革兰氏阴性细菌细胞的周质和/或培养基中回收特异性结合CD154的抗体或其抗原结合片段。
20.权利要求19的方法，其中所述方法还包括，将效应分子连接至抗体的重链和/或轻链的C末端上的或朝向所述C末端的氨基酸的步骤。
21.权利要求20的方法，其中所述效应分子包含聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)。
22.权利要求21的方法，其中所述方法包括，将赖氨酰-马来酰亚胺基团连接至重链C末端上的半胱氨酸残基之一，其中所述赖氨酰残基的每一个氨基共价地连接具有约`20，OOODa的分子量的甲氧基聚(乙二醇)残基。
【文档编号】C07K16/28GK103649124SQ201280034512
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年7月13日 优先权日:2011年7月13日
【发明者】M·爱丽丝, D·P·汉弗莱斯 申请人:Ucb医药有限公司