一种含有动物固醇和天然精氨酸结构片段的合成阳离子脂质、合成方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种含有动物固醇和天然精氨酸结构片段的合成阳离子脂质、合成方法及其应用。采用常温高效化学偶联反应方法，将作为疏水砌块的动物固醇和作为阳离子砌块的天然精氨酸通过氨基酸连接砌块分别进行偶联制得，方法简便、高效、易操作，且起始原料为市售试剂，易于模块化制备。本发明获得的阳离子脂质具有水溶性、两亲性、低细胞毒性、良好生物相容性等优点，能在缓冲液中高效结合基因物质形成纳米尺度的、稳定的复合体。通过相关细胞生物学评价发现该类阳离子脂质载体负载的绿色荧光蛋白报告基因(eGFP)在人肺癌细胞株H1299内能够高效转染、表达目标蛋白,较市售参比转染试剂明显较低的细胞毒性。能作为低毒、高效的基因输送载体生物材料。
【专利说明】一种含有动物固醇和天然精氨酸结构片段的合成阳离子脂质、合成方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及面向有机生物功能材料的制备方法与生物医药应用领域，特别涉及到一种含有天然动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质及其在制备基因转染载体试剂中的应用。
技术背景
[0002]天然产物作为次级代谢产物广泛分布在动物、植物和微生物中，其具有维持生理活动、介导自身防御和调控生物生殖的功能。天然产物中，除生物大分子如蛋白质(多肽)、核酸、聚糖之外，还有许多生物小分子化合物，包括氨基酸、核苷酸、糖类、脂类(脂肪和甾体)、萜类化合物等，其复杂的结构骨架和特殊的功能基团赋予了这些天然产物丰富多样的生物活性。近年来随着对生物相容性材料研究的深入，一些来源丰富、具有独特分子结构和多修饰位点的天然产物分子被逐步应用于构建具有基因、药物传输性能的纳米生物材料。目前，基于天然阳离子脂质、类脂质来构建生物相容性基因载体材料受到了人们的广泛关注，该系列阳离子脂质、类脂质基因载体的作用原理是借助其所携带的正电荷与负电性的治疗基因(DNA、RNAi)通过静电相互作用，形成结构与形态稳定的复合体(complex),保护复合体中DNA或RNAi在体内长时间血液循环中不易被核酸酶特异性降解，同时防止复合体团聚形成更大尺寸的聚集体，实现治疗用基因药物高效率输送与细胞内重组转染表达。因此，作为基因输送载体的天然脂质材料既要满足自身的低毒性、无免疫原性、生物可降解性，还需要能够与治疗用外源基因DNA或RNAi有效地复合形成稳定的纳米尺度的聚集体(通常在50-400nm)，使其具有血液长循环周期，减少器官的选择性滤出和与血液成份的非特异性相互作用。一般情 况下，为了实现阳离子分子载体和基因间有较强的结合能力(Binding Affinity),需要保证载体分子有较高的电荷密度。然而,现有的大量研究发现，在提高现有脂质体、类脂质体中阳离子片段分子量和电荷密度的同时，其作为基因输送载体应用时的细胞毒性显著增大，不能满足临床基因治疗的实际应用要求。因此，如何运用分子工程手段，研发生物相容性好、并具有高效基因复合、负载性能的新型脂质基因载体是发展高效、低毒基因转染试剂的重要方向。
[0003]动物固醇类化合物是一类具有重要生理功能的天然留族化合物，在动物体内多种脂质如低密度脂蛋白(LDL)中广泛存在，具有较强的疏水性和良好的生物相容性，因此，基于天然动物固醇类化合物的骨架结构，通过进一步化学修饰连接水溶性天然产物阳离子片段，制备得到系列动物固醇衍生的两亲类脂质体功能分子，将有可能同时具有较低细胞毒性和水溶性。近年来，国内外已经报道了一些由动物留醇衍生的两亲性阳离子功能分子(Bioconjugate Chem, 2013, 24，487 - 519),具体的如胆固醇-生物素偶联的阳离子脂质(Chem Biol Drug Des, 2013，82，376 - 383)，大环取代胺类(ChemPlusChem, 2012，77，584 - 591)等，其性能已经在构建功能基因载体中得到了初步研究。本发明人在前期的相关工作中开发了系列基于二硫键的胆固醇脂质基因载体(Biomaterials2011，11,3507;ZL201010182428.4)，发现二硫化学键的引入对降低合成脂质载体的细胞毒性具有重要作用。进一步还发展了系列基于天然生物相容性胆固醇的类脂质阳离子有机功能分子作为基因转染试剂(CN201110040189.3)，并成功应用于质粒DNA的高效细胞转染。此外，还发展了用“Click”方法在温和的条件下快速偶联制备功能阳离子脂质体的方法(ZL201110040189.3)。上述工作为研究开发由天然产物胆固醇衍生的新型载体生物功能材料与生物相容性功能基因转染试剂提供了新的途径。
[0004]然而，总体上国内外基于动物固醇的两亲阳离子类脂质分子的研究与应用开发的相关报道较少。另一方面，从药物载体或者治疗基因药物的载体实际应用考虑，现有已经报道的基于天然留醇结构的基因载体功能分子普遍存在合成步骤繁琐，产率较低、制备成本高等现实问题。因此，基于上述考虑，有必要发展新型高效率、反应条件温和、易操作、结构高度模块化的天然留醇类功能阳离子分子的制备方法，为大量、低成本合成制备基于天然甾醇类天然产物、且具有分子结构多样性的新型生物相容性阳离子功能基因载体分子提供可能，并在此基础上，通过细胞层次上的生物学性能评价，进一步反馈指导上述基于天然甾醇类天然产物生物功能载体的设计和制备，从而促进其作为基因、药物等生物功能载体材料(或试剂)的应用，这也是本发明所致力解决的目标。 [0005]发明的内容
[0006]本发明的要解决的问题之一在于提供一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质。
[0007]本发明要解决的问题之二在于提供一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，即运用常温化学偶联方法高效制备得到所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质。
[0008]本发明要解决的问题之三是提供一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质作为基因载体材料的用途。尤其是在制备基因转染载体试剂中的应用。
[0009]依据本发明所提供的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质，其结构式(I )可以表示如下:
[0010]
【权利要求】
1.一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质，其具有如下结构式(i):
2.如权利要求1所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子 脂质的合成方法，由以下三步骤组成: 第一步骤:将动物固醇溶于脱水干燥的有机溶剂中，在催化量的碱存在的条件下加入到溶于有机溶剂中的末端氨基Boc保护的氨基酸中，在室温下反应10-24h得到具有末端氨基Boc保护的动物固醇中间体，其化学结构如式(II)所示；所述的动物固醇、碱和末端氨基Boc保护的氨基酸的摩尔比为1.0:1.0~2.0 ；1.0~1.5 ;所述的动物固醇为胆固醇或氢化胆固醇；
3.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是步骤一、二、三中，所述有机溶剂是乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4_ 二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2_ 二氯乙烷、乙腈、丙酮、苯或甲苯。
4.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是步骤一或二中所述合成中使用的碱是二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醇钠、甲醇钾、1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷、1，8-二氮杂环[5，4，O] 十一烯-7、吡啶、甲基吡啶或4- 二甲氨基吡啶。
5.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是步骤一中使用的末端氨基Boc保护的氨基酸是ω-氨基乙酸
6.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是所述步骤二、三中使用的酸为盐酸、高氯酸、三氟甲磺酸或三氟乙酸。
7.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是所述步骤一或二的产物经过蒸馏、柱层析纯化。
8.如权利要求2所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的合成方法，其特征是所述步骤三的产物经过蒸除有机溶剂、加入醚进行沉淀好过滤干燥纯化；所述的醚是乙醚、丙醚、异丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇二甲醚或二苯醚。
9.如权利要求7所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质的方法，其特征是所述柱层析纯化使用的有机溶剂是乙酸乙酯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯、或者它们的混合溶剂。
10.一种如权利要求1所述的一种含有动物固醇和天然精氨酸化学结构片段的合成阳离子脂质作为基因 传输载体材料的应用。
【文档编号】C07C51/41GK103772469SQ201410060042
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】曹阿民, 盛瑞隆, 王昭, 李明睿 申请人:中国科学院上海有机化学研究所