专利名称：一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法
技术领域：
本发明涉及一种应用高速逆流色谱法联用高效液相色谱从植物叶子提取分离聚戊烯醇类脂化合物的方法，属于天然药物分离和医药保健品应用领域。
背景技术：
目前国际上对于天然产物的分离技术大多采用超临界萃取技术、大孔树脂柱层析技术、分子蒸馏技术、膜分离技术等，但对于含量很低且生物活性高的天然产物，面对社会的进步和人类对高科技含量精制产品的要求，极其缺乏既能实现高纯度物质的分离纯化，又能实现相当量级制备能力的新技术。如果没有这样的新技术，就很难实现新一代产物的研发与生产，就不能实现高纯度标准物质的制备和高精度质量检定与控制方法的建立。因此，面对分离技术这一技术瓶颈，高速逆流色谱技术(HSCCC)的出现，为天然药物活性成分的分离纯化与制备带来了更优的解决方案。高速逆流色谱技术(HSCCC)，是一种以液液分配为基本原理，不采用任何固态的支撑体(如柱填料、吸附剂、亲和剂、板床、筛膜，等)，因此，对于天然产物复杂混合物中某些特定成分的高纯度单体的分离纯化与制备中有如下优势特点:1.高分离效率:分离在旋转运动中进行，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场甩成微小的颗粒，样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并能在这些颗粒振荡与对流的环境中有效地传递。实现成千上万次地、高效连续溶剂萃取过程，达到高分辨度的分离与纯化。能将样品中有效成分一步分离提纯至98%以上。2.低使用成本:分离过程不是吸附与淋洗的过程，而是对流穿透的过程，节省昂贵的填料的费用，节约溶剂的消耗；配制溶剂中大部分为水相，有机溶剂消耗少；大规模生产中可实现溶剂回收再利用。运行使用中的后续投入很低。3.易工艺放大:工艺重复性100%。从小型仪器上工艺摸索到大型仪器放大生产容易实现。4.高回收率:免除了支撑体在柱内所占空体积，无不可逆吸附、污染、变性、失活等影响，样品理论回收率100%。
5.洁净环保:整个实验生产过程封闭进行，避免溶剂挥发造成环境污染及对操作人员造成身体伤害。聚戍烯醇(polyprenols)广泛存在于绿色针叶、银杏和桑叶等植物中，是以C5异戍烯基为结构单一的类脂化合物，从结构上可分:桦木醇型《-(trans)2-(cis)n-0H、菲卡醇型《-(trans)3-(cis)n_0H和全反式爺尼醇型co -(trans)n_0H。如附图1所示。聚戊烯醇类脂对人体无毒、无致突变、无致畸和无致癌作用，具有明显的生理、药理作用。生理学研究表明，聚戊烯醇类脂对细胞膜的结构和功能具有调节作用，可改善膜的流动性、稳定性和渗透性，从而可增强膜的融合。外源性聚戊烯醇类脂在体内可代谢为多萜醇，以补充体内多萜醇的不足，对提高免疫功能、肝细胞再生、抑制癌细胞转移和辅助放、化疗等具有明显作用，也可作为癌症病人的诊断剂。拉脱维亚等国已批准用于保健食品生产和药品开发，制备了“R0PREN”系列药物。国内外对于植物聚戊烯醇的分离纯化已有文献报道，主要纯化路线是通过几次硅胶柱层析将聚戊烯醇粗提物纯度提高到90%以上。此外，还有一些其他纯化方法，如采用极性介质树脂(氧化铝或聚酰胺等)吸附，溶剂萃取和结晶，得到纯度为70% 75%的聚戊烯醇产品，得率1.0%左右。采用石油醚-乙酸乙酯冷冻脱杂后再进行硅胶柱层析纯化，制备纯度92.7%聚戊烯醇。但产品中仍含有大量的类胡萝卜素等黄色素，Tetsuo Takigawa等曾采用活性炭一种脱色剂对聚戊烯醇粗提物脱色，但活性炭用量大，脱色效果差，聚戊烯醇损失大HSCCC分离效率高、操作简单，样品不需要严格的预处理；可从极复杂的粗制样品中一步分离得到高纯度的组分，可以分离黄酮、生物碱、醌类、类脂等小分子化合物，也可以分离多肽、多糖、蛋白质等高分子化合物，重现性良好。目前还没有文章和专利报道采用高速逆流色谱法分离聚戊烯醇。
本发明将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子，通过室温浸泡，或经微波提取或超声波提取，制备含量5 20%聚戊烯醇类脂软膏，再采用高速逆流色谱技术，制备60% 90%聚戊烯醇类脂，为高纯度聚戊烯醇批量制备和医药品的开发提供技术。
发明内容
为实现上述目的，发明了一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，由以下步骤组成:第一步，聚戊烯醇类脂提取将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子，室温阴干，破碎至100目以下粉末，加入无水丙酮或Cl C3醇中任一种溶剂，叶子与溶剂按质量比为1: 8 30，优选1: 8 15，在室温 80°C浸泡10 72小时，如25 50°C，静泡30 50小时；或经微波提取或超声波提取10 60分钟，提取功率100W 1000W，两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率4 10%，聚戊烯醇类脂含量5 20% ；第二步，高速逆流色谱分离I)按体积比选择正己烷:乙腈:丙酮=3 4: 0.5 1: 0.8 1.5溶液作为高速逆流萃取溶剂体系，三种溶剂混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气；2)取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试样品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比(g/mL)为1: 20 80 ;3)将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，高速逆流色谱仪分离条件在500 1000r/min转速下，以I 5mL/min的流速注入流动相,在波长210 230nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始供试样品溶液进样，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min，用自动馏分收集器收集馏出液；第三步，高效液相色谱检测将第二步自动馏分收集器收集馏出液，用高效液相色谱进行检测聚戊烯醇类脂部位集分，合并聚戊烯醇类脂集分，回收有机溶剂，浓缩物为黄色聚戊烯醇类脂油状物，聚戊烯醇类脂含量60 % 90 %。本专利采集的新鲜叶子为银杏叶、针叶和桑叶中任一种，银杏叶为8月至12月期间采集的新鲜叶子，3 10年树龄的银杏叶于8 10月采集，10年以上树龄银杏叶在10 12月采集，含有异戊烯基单元数为15 23聚戊烯醇类脂。松针为2月 8月期间从马尾松、湿地松、黑松、雪松、海岸辐射松和油松中任一种采集的新鲜叶子，富有异戊烯基单元数为13 19聚戊烯醇类脂。桑叶为8月10月期间采集的新鲜叶子，含有异戊烯基单元数为10 12聚戊烯醇类脂。传统提取方法采用石油醚、正己烷、氯烷、乙酸乙酯、丙酮等作为非极性或弱小极性的提取剂提取植物聚戊烯醇类脂化合物，提取率一般3 6%，本公利首次采用极性较大的无水醇溶剂作为提取剂，如公开的Cl C3醇提取剂为甲醇、乙醇、正丙醇中任一种，同时采用无水丙酮作为提取剂，扩大了聚戊烯醇提取极性，也明显提高了聚戊烯醇提取率和收率。本专利公开在室温 80°C浸泡10 72小时，如25 50°C，静泡30 50小时；或经微波提取或超声波提取10 60分钟，提取功率100W 1000W，两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率4 10%，聚戊烯醇类脂含量5 20 %，与传统方法相对，提取效果明显提高。传统分离方法通过多次硅胶柱层析将聚戊烯醇粗提物纯度提高到90%以上，不但时间长，而且溶剂和硅胶多，尤其硅胶不能再生利用，成本高；采用极性介质树脂(氧化铝或聚酰胺等)吸附，溶剂萃取和结晶，只能得到纯度为70% 75%的聚戊烯醇产品，不能满足新药开发中对聚戊烯醇高含量(>90%)的要求。相比传统分离方法，本专利首次采用高速逆流色谱从银杏叶、松针和桑叶提取的聚戊烯醇类脂软膏中制备高纯度聚戊烯醇类月旨，尤其整个离心过程首次采用正相离心旋转和反相离心旋转相结合方法，整个过程时间为210 300min，能批量制备，每批聚戊烯醇类脂软膏的进样量为10 500mg。本专利一步法，步骤少，简单可行，制备的聚戊烯醇纯度明显提高，能满足新药的开发需求。本专利首次采用高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，高效液相色谱检测参数ODS C18column (0x L,4.6 mm><250 mm),填料的粒度2.5 lOiim，柱温20 30°C，流动相:甲醇:异丙醇:正己烷:水=
`0.18: 0.32: 0.04: 0.01v/v，流速:0.6 1.ZmL/mirT1，检测波长:210nm。高速逆流色谱制备的黄色聚戊烯醇类脂油状物，经高效液相色谱分析，聚戊烯醇类脂含量60% 90%。
本发明的有益效果表现为:1.针对传统提取方法，首次采用无水醇作为提取剂，采用微波提取或超声波提取聚戊烯醇类脂，不仅聚戊烯醇提取率明显提高，而且醇比石油醚、正己烷等非极性溶剂更安全，提取过程中损失更少，成本低。2.首次采用正相离心旋转和反相离心旋转相结合方法，首次采用高速逆流色谱从银杏叶、松针和桑叶提取的聚戊烯醇类脂软膏中制备高纯度聚戊烯醇类脂。3.首次采用高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂，聚戊烯醇类脂含量60% 90%。
图1聚戊烯醇类脂结构图2标准品的高速逆流色谱3标准品的高速逆流色谱分离后HPLC
图4聚戊烯醇类脂的高速逆流色谱5聚戊烯醇类脂的经高速逆流色谱分离后的HPLC
五具体实施例方式以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。实施例1高速逆流色谱标准样品分离1.实验仪器:FastChrome分析型 高速逆流色谱仪(江阴逆流科技有限公司)；分离柱体积:25mL ;值范围:0.56 0.91 ;0ptiChrOmeA半制备型高速逆流色谱仪(江阴逆流科技有限公司)；螺旋管分离柱(公转半径:80cm ;值范围:0.50 0.80 ;螺旋管内径:1.59mm)，单柱体积180mL,双柱体积360mL。2.实验材料:分析纯同分异构体酚类样品邻苯二酚，间苯二酚，对苯二酚；正己烷、乙酸乙酯、甲醇、蒸馏水3.配制溶剂与样品:配制酚类样品的甲醇混合溶液，混合样品浓度:邻苯二酚20mg/mL+间苯二酚20mg/mL+对苯二酹10mg/mL ;以80%甲醇溶液为溶剂，分别配制200mg/mL邻苯二酹溶液、200mg/mL间苯二酹溶液、和100mg/mL对苯二酹溶液，充分溶解后，各取ImL,加入7mL的80%甲醇溶剂，混匀，制成待分离的混合样品。溶剂体系:正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水=3: 5:1: 5。将300mL正己烷、500mL乙酸乙酯、IOOmL甲醇、与500mL蒸懼水充分混合后,分液漏斗分相。4.实验参数:邻苯二酚、间苯二酚、和对苯二酚的混合物进行分离，分离条件为:溶剂体系:正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(3: 5: I: 5);固定相:上相；流动相:下相。分析型仪器分离条件:柱体积:34mL ;流速:lmL/min ;室温:22°C ;转速:1800rpm ；检测波长:254nm。进样体积:lmL ;进样浓度:邻苯二酹2mg/mL+间苯二酹2mg/mL+对苯二酚lmg/mL(混合样品1: 10溶于流动相中)制备型仪器分离条件:双柱分离，柱体积360mL ;流速:5mL/min ;室温:22°C;转速:1200rpm ;检测波长:254nm,进样体积:20mL ;样品浓度:邻苯二酹2mg/mL+间苯二酹2mg/mL+对苯二酹lmg/mL(混合样品1: 10溶于流动相中)。5.实验步骤:5.1.固定相注入:开启恒流泵，以最大流速将固定相通过入口注入分离柱中，充满分离柱管路，至出口端流出后，继续泵I分钟之后停泵。确定有足够的固定相用于注满分离柱(分析柱应准备多于50mL，制备柱应多于400mL)，此过程中小心不要进空气或者流动相。5.2.接通外电源，合上仪器后背板左下角的电源开关，设置离心旋转参数；设置恒流泵分离流速(分析型lmL/min,制备型5mL/min)5.3.系统平衡:确认离心参数正确，且分离柱中已经注满液体(固定相)。将恒流泵进口的滤器头插入流动相。按照预设流速启动恒流泵，同时按下离心控制面板上面绿色的“Run”按键，启动离心。5.4.溶剂系统平衡，即出口的流出溶液全部为清澈的流动相，或者在线检测仪信号平稳后，记录固定相的排出体积，以计算固定相保留率；Sf =(管路总体积-排出的固定相体积)/分离柱体积*100%本实验以50mL/min速度泵满固定相，以5mL/min速度泵入流动相，启动0ptiChrome A-300正向离心，观察UV3000输出达到系统平衡，计算固定相保留率65%。5.5.样品配制:取50mg/mL酹类样品混合液(邻苯二酹20mg/mL+间苯二酹20mg/mL+对苯二酹10mg/mL)以1: 10稀释于溶剂体系的流动相(分析型:0.1mL稀释于0.9mL流动相；制备型:2mL稀释于ISmL流动相)，混匀；5.6.上样:将相应分离柱的上样阀旋至“loading”位置，将注射器插如连有注射器接头的抽样孔，观察上样环及进样管，推注射器以排出进样管中的空气，使进样管内充满从上样环中流出的流动相。然后将进样管插入配制好的样品试管(注意插到底部避免进气泡)，抽吸注射器将样品吸入上样环。可以将样品注满上样环，也可以部分充满上样环，但是注意不能有空气进入上样环。然后将上样阀旋回竖直零位置，样品将随泵入的流动相进入分离柱。5.7.点击色谱工作站中的“数据采集”，记录混合样品的分离曲线。5.8.分离结束时，按离心控制面板上的“停止”按键停止离心，并将恒流泵停止。点击色谱工作站中的“停止采集”键，并保存图谱。5.9.可以选择用氮气或者压缩空气吹出分离柱中所剩的溶液和保留的组分；或者选择用固定相将柱内溶液以及保留的组分高速推出。5.10.管路清洗:用恒流泵泵入约1/3柱体积的甲醇，然后用氮气吹出；重复三次。最后一次清洗并吹出甲醇清洗液后，继续吹气的同时，按下离心控制面板上的“转向”键，显示屏“运转”项将显示“反向离心停止”，然后将转速设为400rpm，启动离心，有利于管路中残存溶剂的清空。6.分离结果:邻苯二酚、对苯二酚和间苯二酚实现了良好分离，如图2和图3。实施例2高速逆流色谱和高效液相色谱联用方法第一步，聚戊烯醇类脂提取将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子，室温阴干，破碎至100目以下粉末，加入无水丙酮或Cl C3醇中任一种溶剂，优选无水丙酮或乙醇，叶子粉未与溶剂按质量比为I: 8 30，优选1: 8 15，在室温 80°C浸泡10 72小时，如25 50°C，静泡30 50小时；或经微波提取或超声波提取10 60分钟，提取功率100W 1000W，两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，软膏相对于植物叶子粉末收率4 10%，聚戊烯醇类脂含量5 20% ；第二步，高速逆流色谱分离(I)按体积比选择正己烷:乙腈:丙酮=3 4: 0.5 1: 0.8 1.5溶液作为高速逆流萃取溶剂体系，三种溶剂混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气；(2)取聚戊烯 醇类脂软膏溶于下相中作为供试样品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比(g/mL)为1: 20 80，优选1: 30 60 ;(3)将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，高速逆流色谱仪分离条件在500 1000r/min转速下，以I 5mL/min的流速注入流动相,在波长210 230nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始供试样品溶液进样，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min，用自动馏分收集器收集馏出液；第三步，高效液相色谱检测将第二步自动馏分收集器收集馏出液，用高效液相色谱进行检测聚戊烯醇类脂部位集分，合并聚戊烯醇类脂集分，回收有机溶剂，浓缩物为黄色聚戊烯醇类脂油状物，聚戊烯醇类脂含量60 % 90 %。本实施例中新鲜植物叶子为银杏叶、松针和桑叶中的任一种，银杏叶为8月至12月期间采集的新鲜叶子，3 10年树龄的银杏叶于8 10月采集，10年以上树龄银杏叶在10 12月采集，含有异戊烯基单元数为15 23聚戊烯醇类脂；松针为2月 8月期间从马尾松、湿地松、黑松、雪松、海岸辐射松和油松中任一种采集的新鲜叶子，富有异戊烯基单元数为13 19聚戊烯醇类脂，桑叶为8月10月期间采集的新鲜叶子，含有异戊烯基单元数为10 12聚戊烯醇类脂。本实施例中植物原料经过无水丙酮或乙醇微波提取和高速逆流色谱分离，整个离心过程采用正相离心旋转和反相离心旋转相结合方法，整个过程时间为210 300min，能批量制备，每批聚戊烯醇类脂软膏的进样量为10 500mg。本实施例用高效液相色谱检测高速逆流色谱分离聚戊烯醇类脂萃取部位及其含量，高效液相色谱检测参数为色谱 柱采用ODS C18column (0x L,4.6 mmx250 mm),填料的粒度2.5 ΙΟμπι，柱温20 30°C，流动相:甲醇:异丙醇:正己烷:水=
0.18: 0.32: 0.04: 0.01v/v，流速:0.6 1.ZmL/mirT1，检测波长:210nm。经 HPLC 分析，高速逆流色谱分离的聚戊烯醇类脂含量60 % 90 %。实施例3高速逆流色谱聚戊烯醇分离实验1.溶剂准备:正己烷:乙腈:丙酮=3: I: I按体积比配制2000mL，以上相为固定相，以下相为流动相。2.样品准备:取实施例1中聚戍烯醇类脂软膏50mg,溶于流动相50mL。3.系统平衡:以50mL/min速度泵满固定相，以5mL/min速度泵入流动相，启动4.0ptiChrome A-300正向离心，观察UV3000输出达到系统平衡，计算固定相保留:60%5.上样:将样品通过上样阀注入0ptiChrome A-300中。正向离心:将OptiChrome A-300设定为正向离心旋转，设定。6.反向离心:将分离流速为5mL/min，经过180分钟的正向离心。OptiChrome A-300设定为反向离心旋转,设定分离流速为10mL/min,经过30分钟的反向离心。7.上述步骤(5)和(6)中，样品经检测器得到图谱，如附图4。8.HPLC分析:取图3检测器吸收最大处分离出的液体置于HPLC进行检测，通过与标准的聚戊烯醇样品的图谱进行对比，得到聚戊烯醇类脂图谱。如附图5.从图4的HPLC图谱可以清晰的看到，Opt iChrome A-300成功的将聚戍烯醇混合物中部分混合物分离出来。实施例4高速逆流色谱制备银杏叶聚戊烯醇类脂1.原料收集，银杏叶为8 12月期间采集的新鲜叶子，其中3 10年树龄的银杏叶于8 10月采集，10年以上树龄银杏叶在10 12月采集，室温阴干，破碎至100目以下粉末，备用。2.聚戊烯醇类脂提取:取银杏叶粉末1kg，加入无水丙酮，叶子与溶剂按质量比为I: 25，在室温浸泡60小时，重复提取两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，共5g，HPLC析纯度为8% ；3.取IOOmg采用高速逆流色谱仪进行分离，取体积比为3: 0.5: 0.8的正己烷、乙腈和丙酮作为高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比为Ig: 50mL;将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在800r/min转速下，以2mL/min的流速注入流动相，在波长210nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动馏分收集器收集馏出液，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min。收集得到的馏出液采用旋转蒸发去除溶剂，得到样品29.8mg.
4.高效液相色谱进行检测，银杏叶聚戊烯醇类脂纯度为75%，含有异戊烯基单元数为15 23。实施例5高速逆流色谱制备针叶聚戊烯醇类脂1.原料收集，松针为2月 8月期间从马尾松、湿地松、黑松、雪松、海岸辐射松和油松中任一种采集的新鲜叶子，室温阴干，破碎至100目以下粉末，备用。2.聚戊烯醇类脂提取:取松针粉末1kg，加入无水乙醇，叶子与溶剂按质量比为I: 20，在超声波提取50分钟，重复提取两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，共5.8g，HPLC析纯度为15% ；3.取IOOmg聚戊烯醇类脂软膏，采用高速逆流色谱仪进行分离，取体积比为4:1: 1.5的正己烷、乙腈和丙酮作为高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比为Ig: 50mL ;将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在1000r/min转速下，以2mL/min的流速注入流动相，在波长210nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动馏分收集器收集馏出液，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min。收集得到的馏出液采用旋转蒸发去除溶剂，得到样品20.5mg。4.高效液相色谱进行检测，针叶聚戊烯醇纯度为86%，含有异戊烯基单元数为13 19。实施例6高速逆流色谱制备桑叶聚戊烯醇类脂1.原料收集，桑叶为8月10月期间采集的新鲜叶子，室温阴干，破碎至100目以下粉末，备用。
2.聚戊烯醇类脂提取:取桑树叶粉末1kg，加入无水甲醇，叶子与溶剂按质量比为I: 15，在50°C微波提取60分钟，重复提取两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，共3.8g，HPLC析纯度为18% ；3.取500mg采用高速逆流色谱仪进行分离，取体积比为4: I: 1.5的正己烷、乙腈和丙酮作为高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比为Ig: 50mL;将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在1000r/min转速下，以5mL/min的流速注入流动相，在波长210nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动馏分收集器收集馏出液，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min。收集得到的馏出液采用旋转蒸发去除溶剂，得到样品172.3mg04.高效液相色谱进行检测，桑叶聚戊烯醇类脂纯度为73%，含有异戊烯基单元数为10 12。实施例7高速逆流色谱制备银杏叶聚戊烯醇类脂1.原料收集，银杏叶为8月至12月期间采集的新鲜叶子，其中3 10年树龄的银杏叶于8 10月采集，10年以上树龄银杏叶在10 12月采集，室温阴干，破碎至100目以下粉末，备用。2.聚戊烯醇类脂提取:取银杏叶粉末1kg，加入无水甲醇，叶子与溶剂按质量比为I: 10，在60°C微波提取60分钟，重复提取两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，共4.5g，HPLC析纯度为18% ；
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3.取IOOmg采用高速逆流色谱仪进行分离，取体积比为4: I: 1.5的正己烷、乙腈和丙酮作为高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比为Ig: 50mL;将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在1000r/min转速下，以lmL/min的流速注入流动相，在波长210nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动馏分收集器收集馏出液，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min。收集得到的馏出液采用旋转蒸发去除溶剂，得到样品37mg。4.高效液相色谱进行检测，银杏叶聚戊烯醇类脂为90%，含有异戊烯基单元数为15 23。实施例8高速逆流色谱制备针叶聚戊烯醇类脂1.松针为2月 8月期间从马尾松、黑松和雪松中任一种采集的新鲜叶子，室温阴干，破碎至100目以下粉末，聚戊烯醇类脂含量1.75%。2.聚戊烯醇类脂提取:取松针粉末1kg，加入无水丙酮，叶子与溶剂按质量比为I: 25，在室温浸泡60小时，重复提取两次，合并提取液，真空回收有机溶剂，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，共5.8g，HPLC析纯度为25% ；3.取300mg采用高速逆流色谱仪进行分离，取体积比为3: I: 1.5的正己烷、乙腈和丙酮作为高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气，取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比为Ig: 50mL;将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，在600r/min转速下，以5mL/min的流速注入流动相，在波长230nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始取供试品作为样品溶液进样，同时开始用自动馏分收集器收集馏出液，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min。收集得到的馏出液采用旋转蒸发去除溶剂，得到样品108.75mg0
4.高效液相色谱进行检测，针叶聚戊烯醇类脂纯度为86%，含有异戊烯基单元数为13 19。
权利要求
1.一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，其特征在于由以下步骤组成: 第一步，聚戊烯醇类脂提取 将富含聚戊烯醇类脂的新鲜植物叶子，室温阴干，破碎至100目以下粉末，加入无水丙酮或Cl C3醇中任一种溶剂，叶子与溶剂按质量比为1: 8 30，在室温 80°C浸泡10 72小时，或经微波提取或超声波提取10 60分钟，提取两次，合并提取液，真空回收有机溶齐U，浓缩物为聚戊烯醇类脂软膏，聚戊烯醇类脂含量5 20% ; 第二步，高速逆流色谱分离 1)按体积比选择正己烷:乙腈:丙酮=3 4: 0.5 1: 0.8 1.5溶液作为高速逆流萃取溶剂体系，三种溶剂混合充分后静置，按上下两相分开，取上相为固定相，下相为流动相，超声脱气； 2)取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试样品，所述聚戊烯醇的软膏与下相的质量体积比(g/mL)为1: 20 80 ; 3)将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，高速逆流色谱仪分离条件在500 1000r/min转速下，以I 5mL/min的流速注入流动相,在波长210 230nm的紫外检测器检测，当明显有流动相流出时，开始供试样品溶液进样，整个离心过程先采用正相离心旋转，时间为180 240min，再采用反相离心旋转，时间为30 60min，用自动馏分收集器收集馏出液；第三步，高效液相色谱检测 将第二步自动馏分收集器收集馏出液，用高效液相色谱进行检测聚戊烯醇类脂部位集分，合并聚戊烯醇类脂集分，回收有机溶剂，浓缩物为黄色聚戊烯醇类脂油状物，聚戊烯醇类脂含量60% 90%。
2.根据权利要求1所述一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，其特征在于第一步聚戊烯醇类脂提取中的新鲜植物叶子为银杏叶、松针和桑叶中的任一种。
3.根据权利要求1所述一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，其特征在于第一步聚戊烯醇类脂提取中Cl C3醇为甲醇、乙醇、正丙醇中任一种。
4.根据权利要求1所述一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，其特征在于第二步高速逆流色谱分离中聚戊烯醇类脂软膏的进样量为10 500mgo
5.根据权利要求1所述一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，其特征在于第三步高效液相色谱检测参数ODSC18column (0X L, 4.6 mmx250 mm)，填料的粒度 2.5 10 y m，柱温 20 30°C，流动相:甲醇:异丙醇:正己烷:水=0.18: 0.32: 0.04: 0.01v/v，流速:0.6 1.2mL/min-1,^测波长:210nm。
6.根据权利要求2所述的银杏叶，其特征在于银杏叶为8月至12月期间采集的新鲜叶子，银3 10年树龄的银杏叶于8 10月采集，10年以上树龄银杏叶在10 12月采集，含有异戊烯基单元数为15 23聚戊烯醇类脂。
7.根据权利要求2所述的松针，其特征在于松针为2月 8月期间从马尾松、湿地松、黑松、雪松、海岸辐射松和油松中任一种采集的新鲜叶子，富有异戊烯基单元数为13 19聚戊烯醇类脂。
8.根据权利要求2所述的桑叶，其特征在于桑叶为8月10月期间采集的新鲜叶子，含有异戊烯基单元数 为10 12聚戊烯醇类脂。
全文摘要
本发明公开了一种高速逆流色谱和高效液相色谱联用制备高纯度聚戊烯醇类脂的方法，以银杏叶、松针叶和桑叶为原料，用无水丙酮或无水C1～C3的醇为提取溶剂，在低温微波或超声波提取，制备聚戊烯醇软膏。以正己烷、乙腈和丙酮等溶剂按比例混合作为高速逆流溶剂体系，混合充分后静置，上相为固定相，下相为流动相，取聚戊烯醇类脂软膏溶于下相中作为供试品，将固定相充满高速逆流色谱仪的分离柱，设定在500～1000r/min转速下，以1～5mL/min的流速注入流动相，在波长210～230nm的紫外检测器检测，离心过程先用正相离心旋转180～240min，再用反相离心旋转30～60min，待流动相开始流出色谱柱时，收集馏出液，将不同组分收集合并，经HPLC检测，制备纯度为60～90％的聚戊烯醇类脂。
文档编号C08F116/04GK103145528SQ20131002813
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月24日
发明者王成章, 闵凡芹, 何源峰, 原姣姣, 陈虹霞, 叶建中, 周昊 申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所