技术领域本发明涉及一种重组酶介导等温核酸扩增反应实时检测装置，具体是对等温核酸扩增产物进行实时定量检测。
背景技术：
在生物学研究和分子诊断中，DNA扩增是一种基本和必要的技术手段，其中最常用的是利用聚合酶链式反应(英文全称：PolymeraseChainReaction，简称PCR)进行核酸体外扩增，该技术于1983年由美国科学家PE(PerkinElmer珀金-埃尔默)公司遗传部的Dr.Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖，目前已被广泛运用于现代化的农业和医学以及食品工业等领域。通过这一技术，可以实现微量核酸的高效扩增，将极少量的特异核酸序列分子扩增到仪器可以检测到的水平。PCR技术核酸扩增分三个基本反应步骤，分别是变性、退火(复性)和延伸；具体为：①模板DNA变性：模板DNA经加热至90-95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解旋，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55-60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70-75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火——延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时才能将目的基因扩增放大几百万倍。为了检测是否对目标靶基因成功扩增，人们开发了多种用于检测扩增产物的方法和仪器，传统的方法是采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，这种方法只能对扩增产物进行一个定性的分析，不能对扩增模板进行定量，也不能对核酸扩增进行实时监控，且在低浓度扩增时容易产生假阴性，灵敏度低，因此对PCR扩增产物的检测方法一直在不断的发展和更新，到目前为止，PCR检测仪器已发展到第七代荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR)；这种分析仪器最先是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，通过荧光染料或荧光标记特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，反应结束后结合相应的软件对产物进行分析，并利用已测定的标准曲线对待测样品模板的初始浓度进行定量计算，实现定量分析；但其设计原理也是根据PCR技术的扩增反应特征进行特定设计开发的，在反应温度上需要90-95℃变性、55-60℃退火(复性)、70-75℃延伸三个阶段，并经过若干的扩增循环才能完成，检测仪器设计复杂，仪器价格昂贵，且需要消耗大量电力，只适用于有电力供应的实验室，操作过程要求高，需要有专业技术人员支持，因此这种仪器的成本和应用范围均受到一定限制。因此近十年来，模拟微生物体内的DNA扩增技术悄然兴起，使核酸体外扩增变得更加简单和方便，如TMA技术(转录介导的核酸扩增技术)、SDA技术(链置换核酸扩增技术)、LAMP(环介导核酸扩增技术)、HDA(解旋酶依赖等温核酸扩增技术)、RAA(重组酶介导等温核酸扩增技术)等均可在等温条件下扩增DNA。本发明是针对重组酶介导等温核酸扩增技术而发明的用于实时检测核酸扩增产物的定量检测装置。重组酶介导等温核酸扩增技术能实现在更低的等温条件(25-45℃)下，更快的核酸扩增，过程简便，本发明就是利用该技术的这一反应特性而设计的，实现实时定量检测扩增产物的装置。该检测装置具有灵敏度高、体积小、快速简便等优点。与实时定量PCR仪比价格低，仪器控制的反应温度低，不需要大量电力，操作简便，不需要专业技术人员操作支持，检测时间大大缩短，一般在5-30分钟内就可以得到检测结果，使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用，可以应用于核酸分子实验室研究、医疗诊断和现场检测等领域。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于测量重组酶介导等温核酸扩增产物的实时定量检测装置，具有灵敏度高、反应控制温度低、自动化程度高、操作过程简单、快速简便、成本低等优点，实现对核酸扩增产物的快速检测。重组酶介导等温核酸扩增过程温度控制在25-45℃，最佳反应时间为37℃，与现有的任何一种核酸扩增反应比，反应温度更低，反应效率更快，为了配合这种核酸扩增技术对扩增产物的实时检测而发明了本装置。重组酶介导等温核酸扩增技术是一种利用RecQ蛋白、UvsY蛋白和UvsX蛋白在等温(25-45℃)条件下，最佳反应时间为37℃，使模板双链解旋、稳定单链并使引物和模板之间发生链替换，从而能够替代传统PCR的变性(94℃)和退火(50-60℃)步骤，同时，在DNA聚合酶的催化下合成核酸，在单链结合蛋白SSB以及缩合剂聚乙二醇存在的条件下合成产物，并且可以不断重复这一过程，在5-30分钟内就可以实现核酸的高效扩增。在原理上，重组酶介导等温核酸扩增反应是一个指数扩增，扩增反应只与时间和扩增效率相关；这与PCR的扩增与循环数和扩增效率相关是不一样的。为了快速的使扩增出来的DNA能够得到检测并提高检测灵敏度，在重组酶介导等温核酸扩增反应试剂中加入一对扩增目标靶基因引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当目标靶基因成功扩增时，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭基团发生能量传递作用，从而能发出荧光，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与扩增产物形成完全同步，荧光量强弱与扩增产物成正比；因此，荧光量与扩增产物之间存在一一对应关系，通过对荧光量的检测就可以实现对扩增产物的检测，这就是本发明的实现原理；具体的实现是利用特定的激发光源对特定的荧光探针进行激发，产生特定的荧光，再通过光探测器将荧光采集并进行光电转换，得到可采集和处理的光电信号，微处理器收到信号后进行处理，将处理后的信号显示在PC显示屏上即得到实时扩增曲线；再根据事先标定好的标准曲线通过分析软件计算就可以得到被检样品的初始含量。根据以上的原理，发明一种用于重组酶介导等温核酸扩增产物检测的装置，包含：a.一个能对采集的数据进行处理分析及对所控制的单元进行反馈的微处理器；b.一个能实现温度控制范围在25-45℃，精度±0.1℃的反应恒温控制系统；c.装载样品反应室；d.一组包括LED光源、激发光学装置、发射光学装置及光探测器的光电模块；e.一个能对反应时间进行控制的时间微控制器；f.一个震动模块；g.包含至少一个通信接口，能与上位机进行交互；上位机可以是PC机或其他智能装置；通过以上的模块和单元，实现对反应时间、反应温度、反应震动控制，实现光电信号采集及转换；并通过微处理器采集及处理，最终在上位机上显示扩增反应的即时信号并绘制出即时扩增曲线，完成对扩增产物的检测。其中微处理器至少包含温度微控制器、反应时间微控制器、光电模块微控制器，且具有数据采集及处理功能；可以根据用户通过上位机操作系统，来进行温度控制、反应时间控制、反应震动控制、LED光源控制并能进行信号采集及处理。反应恒温控制系统由温度微控制器、PID控制器、PWM控制电路、加热器、加热器及辅助装置控制电路及温度传感器组成；加热器为金属或陶瓷材料制作的加热装置，包含有加热器及辅助装置控制电路及至少一组金属散热片和风扇，并能利用接收温度微控制器反馈的指令自动实现温度调节，实现温度控制范围25-45℃，精度±0.1℃；温度传感器具有采集温度及将所采集信号转换成数字信号传输给温度微控制器的功能。温度微控制器能根据温度传感器反馈的信号通过PID控制器运算后对PWM控制电路进行控制，如温度低于设定的反应温度，则使加热器通电升温；如温度高于设定的反应温度，则断电并起动风扇通过散热片进行降温，实现恒温控制。装载样品反应室能同时进行多个样品测试，也可以进行单个样品测试；样品能量可以根据实现需要进行设计。光电模块包括LED光源、激发光学装置和光探测系统。激发光学装置由一组或多组透镜、滤光镜、二色镜、反射镜组成。光探测系统由发射光学装置和光电倍增管组成；发射光学装置包括一组或多组透镜、滤光镜、二色镜、反射镜；光探测器接收来自被测样品反应后的荧光信号，通过光电倍增管对接收到的荧光信号进行放大和光电转换，成为可识别的电信号，反馈给微处理器。震动模块由震动马达和震动马达驱动器组成；当样品完成了用户设定的预热时间后时间微控制器根据设定的程序自动起动震动马达驱动器，使震动马达对反应样品进行震动混匀，加快反应速度。震动马达与反应样品室相连接，在震动马达工作时，对反应样品能产生震动的作用。反应时间微控制器主要控制反应时间和震动起始、停止时间，用户可以通过上位机上的操作系统对反应时间和震动起始时间进行设置，并可以根据实际的反应对数据采集时间间隔进行设置；用户可以通过上位机上的显示屏清晰的观察到设置结果。用户通过上位机上的操作系统能设定该检测装置的反应时间、反应温度、数据采集时间间隔、震动起始时间和停止时间。上位机上的显示系统是用于显示用户设定的反应时间、反应温度、数据采集时间间隔，并能显示即时反应时间和反应温度；该检测装置上保留有通信接口，通信接口可以从包括串口、USB、蓝牙、Wifi或其组合中选出，也可以保留多个接口。该检测装置使用方法包括以下步骤：a.接通外置电源或内置电源，开启装置；b.通过通信接口在所述检测装置与上位机之间建立通信；c.通过上位机的操作系统设置检测装置的反应时间、反应温度、震动起始时间和停止时间、数据采集时间间隔等反应参数；d.将重组酶介导等温核酸扩增反应试剂放入反应室，起动检测程序按用户设定的参数进行反应；e.反应开始后把光探测系统检测到的电信号发送到微处理器，上位机调用这些数据并分析处理。以上的操作过程用户可以通过上位机的操作系统创建、修改或删除检测装置的反应时间、反应温度、震动起始时间和停止时间、数据采集时间间隔，这些参数针对重组酶介导等温核酸扩增技术装置内均设置有默认值，但用户可以自定义这些反应条件和数据采集时间间隔。用户可以通过上位机显示出扩增反应的即时信号并由此绘制出即时扩增曲线。附图说明图1为本发明的原理结构示意图；图中101-PC机或其它处理装置，即说明书中提到的上位机；102-通讯接口(串行/蓝牙/USB接口/Wifi)；103-微处理器；104-温度微控制器；105-加热器；106-温度传感器；107-时间微控制器；108-震动模块；109-LED光源；110-激发光学装置；111-光探测器；112-发射光学装置；113-样品反应室；114-光电模块微控制器；115-电池组或外接电源；图2为本发明反应恒温控制系统的一个实施例的原理示意图；图中201-0-24V电源；104-温度微控制器(P89V51)；204-PWM控制电路；105-加热器；106温度传感器(DS18B20)；103-微处理器；图3为本发明一个实施例的光电模块原理示意图；图中109-LED光源；302-透镜；303-滤光镜(激发光)；304-二色镜(激发光)；305-反射镜(激发光)；306-透镜(聚光)；307-被测样品；308-透镜；309-反射镜(发射光)；310-二色镜(发射光)；311-滤光镜(发射光)；312-透镜(聚光)；111-光探测器；114-光电模块微控制器；103-微处理器；图4为本发明实施例的装置外观示意图；图中401-主机(内含微处理器103)；402-震动马达；105-加热器；113-样品反应室；405-反应室盖；406-反应孔；102-通讯接口；408-液晶触摸屏；409-电源开关；410-外接电源接口；图5为实施例中对大豆DNA的扩增图；图中是实时测定的数据显示未经过分析软件处理。其中L9、L5、L4、L3、L2、L1分别是目标扩增DNA不同浓度下的扩增曲线、NTC是阴性对照；具体实施方式以下结合实施例对本发明做详细的说明。本发明涉及一种用于重组酶介导等温核酸扩增产物检测的装置，包含：a.一个能对采集的数据进行处理分析及对所控制的单元进行反馈的微处理器103；b.一个能实现温度控制范围在25-45℃，精度±0.1℃的反应恒温控制系统，如图2所示；c.本实施例中的装载样品的反应室113具有8个样品反应孔；d.一组包括LED光源109、激发光学装置110、发射光学装置112、光探测器111及光电模块微控制器111的光电模块；e.一个能对反应时间进行控制的时间微控制器107和震动模块108；f.采用至少一个USB作为通信接口102，实现与PC机101交互；本实施例中上位机选择PC机。g.通过PC机101上的操作系统，实现对微处理器103的控制；h.主机401的下部有内置电池组，同时保留有外接电源接口410；微处理器103由温度微控制器104、时间微控制器107、光电模块微控制器114组成，具有数据采集及处理功能；可以通过PC机101的操作系统对微处理器103进行控制，能进行反应温度、反应时间、数据采集时间、震动起始、LED光源的设置及控制。并能进行信号采集及处理设置温度微控制器104、时间微控制器107、光电模块微控制器114均采用可根据实际需要编程、数据采集和处理的微控制器。反应恒温控制系统由温度微控制器104、PWM控制电路204、加热器105、加热器及辅助装置控制电路及温度传感器106组成；加热器105选择金属材料制作的加热装置，内部包含有加热器及辅助装置控制电路以及二组金属散热片和一台风扇，具有接收温度微控制器104反馈的指令自动实现温度调节功能，温度控制范围25-45℃，精度±0.1℃；本实例温度微控制器104选用型号为P89V51的微控制器，具有64kBFlash和1024字节的数据RAM，具备ISP和IAP编程功能，还具有3个16位定时器/计数器，PWM和捕获/比较功能的PCA，SPI和UART等功能，满足对温度的准确控制。温度传感器106具有采集温度及将所采集信号转换成数字信号传输给温度微控制器104的功能。本实例中温度传感器106选用型号为DS18B20的温度传感器，该型号将传感器和数字转换电路都集中在一起，测温范围-55℃-+125℃，可编程分辨率为9-12位，最小可分辨率为0.0625℃，达到装置设计要求；按以上的组合，温度微控制器104根据温度传感器106反馈的信号通过PID控制运算后对PWM控制电路204进行控制，当温度低于设定的反应温度，则使加热器105通电升温；当温度高于设定的反应温度，则断电并起动风扇通过散热片进行降温，实现恒温控制。温度控制系统实现闭路装载样品反应室113能同时进行8个样品测试，也可以进行单个样品测试。光电模块包括LED光源109、激发光学装置110、发射光学装置112和光探测111组成。LED光源选用MOLDLEDLAMPL490系列器件，该LED光电功率，照度及温度性能满足要求。激发光学装置由透镜302、306、滤光镜303、二色镜304、反射镜305组成。发射光学装置包括透镜308、312、滤光镜311、二色镜310、反射镜309组成。本实例中重组酶介导等温核酸扩增反应试剂设计的荧光探针激发光源波长为492nm，受激发发射光波长为518nm，按此要求设计激发光学装置和发射光学装置。实际可以按荧光探针激发光源波长和发射光波长来设计激发光学装置和发射光学装置。LED光源109发出激发光源经透镜302汇聚成平行光，经激发光滤光镜303窄带滤光后，剩下492nm激发光经二色镜304、反射镜305反射，再经过聚光镜306汇聚到被测样品307上，被测样品307受激发产生发射光；发射光经透镜308汇聚成平行光，经反射镜309反射、二色镜310和滤光镜311窄带滤光后，剩下波长为518nm的发射光，经聚光镜312汇聚到光探测器111。光探测器111接收来自被测样品307反应后的荧光信号，通过光电倍增管对接收到的荧光信号进行放大和光电转换，成为可识别的电信号，反馈给光电模块微控制器114。光电模块微控制器114将探测到的信号传送给检测装置的微处理器103。震动模块108由震动马达和震动马达驱动器组成，震动马达驱动器由时间微控制器107控制。本实施例选择设定样品预热时间为4分钟，预热温度为37℃。时间微控制器107根据设定的程序在4分钟后自动起动震动马达驱动器，使震动马达对反应样品307进行震动混匀，加快反应速度；根据反应的实际情况也可以在PC机的操作系统中取消震动功能，反应不进行震动混匀步骤。震动马达与反应样品室113相连接，在震动马达工作时，对反应样品能产生震动的作用。反应时间微控制器107主要控制反应时间和震动起始、停止时间，用户可以通过PC机上的操作系统对反应时间和震动起始时间进行设置，并可以根据实际的反应对数据采集时间间隔进行设置。用户可以通过PC机上的操作系统设定反应时间、反应温度、数据采集时间间隔、震动起始时间和停止时间。本实施例中检测装置上保留有USB通信接口102，保留了两个通信接口。该检测装置使用方法包括以下步骤：a.接通外置电源或内置电源115，开启装置；b.通过通信接口102与PC机101之间建立通信；c.通过PC机101操作系统设置反应时间、反应温度、震动起始时间和停止时间、数据采集时间间隔等反应参数；本实施例中的反应时间为30分钟、反应温度为37℃、预热时间为4分钟，震动起始时间为4分钟，震动时长为30秒，数据采集时间间隔为20秒。d.在重组酶介导等温核酸扩增反应试剂中加入不同浓度的大豆DNA作为模板，浓度代号分别为L9、L5、L4、L3、L2、L1及阴性对照品代号为NTC，在以上的7个样品中分别加入设计好的引物和荧光探针，放入样品反应室113，起动检测程序；e.每隔20秒检测装置探测到一组数据，数据发送到微处理器114，PC机101调用这些数据并分析处理。通过PC机可以显示出扩增反应的即时信号并由此绘制出即时扩增曲线，如图5所示。以上所述仅为本发明实施范例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。