一种高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用与流程

文档序号:12346418阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体,其核苷酸序列如SEQ ID No 64所示。

2.根据权利要求1所述的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体,其特征在于,所述多位点突变体编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 65所示。

3.如权利要求1所述的L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

1)DNA分子重排

通过基因合成方法合成来源于淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因,以合成的L-谷氨酸氧化酶基因为模板,扩增L-谷氨酸氧化酶基因,回收1974bp的基因片段,以DNase I进行不完全酶解,并回收小片段;

再,对回收的酶解片段进行无引物PCR扩增,然后以无引物PCR产物为模板,SDLG1、SDLG49为引物扩增重排L-谷氨酸氧化酶基因片段,并回收1974bp基因片段;

2)高比活L-谷氨酸氧化酶基因高通量筛选

将回收的重排L-谷氨酸氧化酶基因片段经BamHI和Sac I双酶切后,构建入原核表达载体pG251启动子和t1t2终止子之间,电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库,而后进行质粒提取;将提取的质粒转入大肠杆菌,涂板于含有氨苄青霉素抗生素的培养基上培养,获得抗性转化子;

以40个抗性转化菌落为一个单元,挑入40孔细菌培养板;利用溶菌酶破碎细胞,加入酶测定液,挑取显黄色的加样孔,对该加样孔中的40个单菌进行再一轮的筛选,并对筛选出的突变单菌进行比活以及对谷氨酸底物的专一性测定,从中挑选5个比活性高且对谷氨酸底物专一的突变体;

对上述5个突变基因进行DNA序列分析,显示其氨基酸突变有9个位点即D32A,H54P,Y144F,G155D,T166K,T319K,A362V,S567F,K600R;

3)多位点突变

以L-谷氨酸氧化酶基因为模版,将上述9个位点同时突变即D32A,H54P,Y144F,G155D,T166K,T319K,A362V,S567F,K600R,获得所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体。

4.根据权利要求3所述的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体的制备方法,其 特征在于,步骤(3)中,以氨基酸突变3个位点:D32A、Y144F、K600R的L-谷氨酸氧化酶基因为模版,将其氨基酸第54、155、166、319、362、567位进行突变,完成9个位点同时突变即D32A,H54P,Y144F,G155D,T166K,T319K,A362V,S567F,K600R,获得所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体;所述突变所用引物如下:

H54P突变引物:

54Z:GCCGCCTCGGCCCCACCCCCCA

54F:TGGGGGGTGG GGCCGAGGCG GC

G155D突变引物:

155Z:TGGGCCCCTCCACCGGCAGCGAC

155F:GTCGCTGCCG GTGGAGGGGC CCA

T166K突变引物:

166Z:CGTACCCCCGGTGACGTACAAC

166F:GTTGTACGTC ACCGGGGGTACG

T319R突变引物:

319Z:CGCAGCGACATCAACCCCAAG

319F:CTTGGGGTTGATGTCGCTGCG

A362V突变引物:

362Z:ACGACCCCAGCCGCGACGTC

362F:GACGTCGCGG CTGGGGTCGT

S569F突变引物:

569Z:GACGCCGCGCGCTGGGACTTG

569F:CAAGTCCCAG CGCGCGGCGTC。

5.如权利要求1-4任一项所述的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体在检测食物中L-谷氨酸含量的应用。

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