抗CD3单域抗体的制作方法

本发明涉及抗CD3单域抗体（sdAb）及其氨基酸、核苷酸编码序列。本发明还涉及包含该核苷酸编码序列的表达载体和宿主细胞。
背景技术：
：自1975年单克隆抗体技术问世之后，抗原特异性的抗体已改变了生物学和医学的多个方面。除了作为重要性的研究工具，单克隆抗体的可用性为发展人类疾病的诊断和新疗法开辟了道路。然而，单克隆抗体在应用范围上有技术上的限制和缺点，例如基于哺乳动物表达系统较昂贵。在过去的几十年，一系列的新技术和方法用于改善传统抗体的性能，尤其是在肿瘤治疗中。例如，给现有抗体加有毒的化合物，包括放射性同位素被链接到单克隆抗体。然而，甚至直到今天，临床使用单克隆抗体量仍然很少。另一个提高肿瘤杀灭效率的方法是使用双特异性的抗体，将免疫细胞引到肿瘤细胞，从而杀死肿瘤细胞。而最常用的是使用抗CD3抗体将T细胞引到肿瘤细胞。它是通过同时绑定CD3和肿瘤细胞的表面抗原(TAA)，这种双特异性抗体可以能够触发T细胞介导的肿瘤细胞溶解。CD3（群集分化3）T细胞受体有助于激活细胞毒性T细胞。它是由四个不同的链组成的一种复杂的蛋白质。在哺乳动物中，包含CD3γ链、CD3δ链和两个CD3ε链。很多双特异性抗体使用单链抗体。单链抗体是从传统的IgG分子得到的完整的最小的抗原结合片段。不幸的是，细菌表达的scFvs产量很低。骆驼和羊驼包含一种独特类型的抗体，这类抗体缺乏轻链。因为比常规抗体缺失CH1，这些所谓的重链抗体有较低的分子量。这类免疫球蛋白可变的重链简称VHH，以区别于经典的重链可变区。因此，单个域VHH是最小可用完整抗原结合15kDa片段，被称为纳米抗体。纳米抗体与Fab、Fv或单链抗体相比，有一些独特的优势，如更稳定、更易于在细菌表达。现有技术中抗CD3抗体形式单一并且不能满足实际需求，因此有必要开发出更多的抗CD3抗体，从而为生产和设计功能蛋白提供更多的选择。技术实现要素：本发明一方面涉及一种抗CD3单域抗体，其氨基酸序列选自SEQIDNO.1和SEQIDNO.3。本发明另一方面涉及一种编码本发明的抗CD3单域抗体的核苷酸序列。在一个实施方式中，该核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在另一个实施方式中，该核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本发明再一个方面涉及一种表达载体，其包含本发明的核苷酸序列。本发明还涉及包含该表达载体的宿主细胞。在一个实施方式中，该宿主细胞是大肠杆菌。本发明还涉及一种双特异性抗体，其包含本发明所述的任一CD3单域抗体。本发明提供的抗CD3单域抗体拮抗人CD3εN-末端部分，这些抗体可以用于比如CD3的测定，以及其他需要CD3的功能蛋白，例如双特异性抗体。附图说明图1是sdAb噬菌体展示库的骨架图。图2显示了血清效价实验结果。图3.淋巴细胞分离的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。M泳道，DNA标记物MarkerIII；第1-3泳道，分离自第一次抽血的淋巴细胞的总RNA；第4-7泳道，分离自第二次抽血的淋巴细胞的总RNA；第8-10泳道，分离自第三次抽血的淋巴细胞的总RNA。图4.纯化的VHHPCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M泳道，DNA标记物MarkerIII；第1-8泳道，使用8对引物从第一次抽血的PBMC得到的纯化的VHHPCR产物；第9-16泳道，使用8对引物从第二次抽血的PBMC得到的纯化的VHHPCR产物；第17-24泳道，使用8对引物从第三次抽血的PBMC得到的纯化的VHHPCR产物。图5.sdAb噬菌体展示库的插入率。使用M13R(-48)和M13F(-47)引物通过PCR扩增96个随机选取的文库克隆。具有~1100bpDNA条带的克隆具有VHH插入物。具体实施方式本发明现将结合以下实验及附图进一步阐释，需要说明的是，这些实验例及附图不应解释为对本发明的限制。1策略本发明通过噬菌体展示技术开发出了抗CD3的单域抗体，并且进行了以下步骤：动物免疫和免疫响应测试、sdAb噬菌体展示库的构建、噬菌体展示淘选以及FASEBA筛选和FACS验证。2材料抗原蛋白：CD3-His蛋白(MP-5)抗原细胞系:Jurkat靶标细胞,KPCN对照细胞TRIzol®Reagent(Ambion,Cat.No.:15596-026)PrimeScriptTM1stStrandcDNA合成试剂盒(Takara,Cat.No.:6110A)SfiI酶(NEB,Cat.No.:R0123S)宿主菌:E.coliSS320氨苄青霉素,100mg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),1MPBS:137mMNaCl,2.7mMKCl,4.3mMNa2HPO4,1.4mMKH2PO4,pH7.4ELISA微滴定板(Corning,Cat.No.:9018)包被缓冲液:0.05MNaHCO3,pH9.6封闭缓冲液(PBST):PBS缓冲液,pH7.4,加入5%脱脂奶粉洗涤缓冲液:PBS缓冲液,pH7.4,,加入0.05%Tween20M13KO7辅助噬菌体(NEB,Cat.No.:N0315S)HRP/抗M13单克隆抗体(GEHealthcare,Cat.No.:27-9421-01)羊抗驼IgG[HRP](NovusBiological,Cat.No.:NB7242)兔抗驼IgG[HRP](GenScript)FACSCalibur(BDBioscience,SanJose,CA)Flowjo:Flowjo7.6.1Minsoftware2×YT:16g胰蛋白胨,10g酵母提取物,5gNaCl溶解于1LddH2O.OctetRED96(ForteBio)SuperStreptavidin(SSA)DipandReadTMBiosensors(ForteBio)10mM甘氨酸-HCl,pH2.03方法3.1动物免疫和免疫响应测试3.1.1动物免疫将CD3-His免疫原与佐剂或PBS混合并注射到美洲驼（llama）。在整个项目过程中，动物被免疫五次。分别在免疫之前以及第4次和第5次免疫之后采集外周血样品。梯度分离法分离出淋巴细胞。细胞中加入RNAlater并储存于-80°C。离心加入了抗凝剂的血液得到血清，并储存于-80°C。3.1.2免疫响应测试使用血清样品通过ELISA评价针对固定的免疫原的免疫响应。评价了免疫前以及第4次和第5次免疫后的血清。抗原(CD3-His和CD34-Fc)分别稀释于4μg/ml的包被缓冲液中。使用稀释的抗原对微滴定板包被过夜，4°C。随后，以洗涤缓冲液洗涤微滴定板3次，再于37°C用封闭缓冲液封闭2小时。再用洗涤缓冲液洗涤微滴定板4次。将一系列稀释的血清加入板上，在37°C孵育2小时。随后用洗涤缓冲液洗涤微滴定板4次。加入羊抗驼IgG[HRP]或兔抗驼IgG[HRP]，在37°C孵育1小时。洗涤后，反应物中加入TMB底物反应10分钟，随后加入1MHCl终止反应。MK3分光计测定每孔在450nm的吸收值。3.2sdAb噬菌体展示库的构建3.2.1RNA提取根据TRIzol试剂手册从分离的淋巴细胞（见3.1.1）中提取总RNA。凝胶电泳法以及OD260/280法对总RNA进行定性和定量。3.2.2RT-PCR和VHH扩增根据PrimeScriptTM1stStrandcDNA合成试剂盒的手册使用oligo(dT)20引物将总RNA逆转录为cDNA。设计四个正义和两个反义特异性简并引物来扩增VHH片段，引入两个SfiI限制性位点。根据GenScript标准操作程序（SOP）扩增VHH片段。3.2.3展示库扩展使用不同引物对扩增获得VHHPCR产物。使用SfiI消化该PCR产物并且通过凝胶纯化。凝胶纯化的片段被插入到GenScript自有的噬菌粒载体（图1）中。构建实验性展示库以优化连接和转化条件。优化的连接和转化条件被用来开发实际展示库。一小部分转化细胞被稀释并划线于具有100μg/ml氨苄青霉素的2×YT平板上。对菌落进行计算以计算文库大小。随机挑取阳性克隆并测序，以评估文库的质量。其余转化细胞被划线于具有100μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的Ø15cm2×YT平板上。从平板上刮去菌苔。小部分细胞被用于文库质粒分离。其余加入甘油，保存于-80°C备用。3.3噬菌体库淘选3.3.1生物淘选使用GenScript开发的标准程序对所构建的sdAb噬菌体库进行CD3-His蛋白的淘选。含有7.4×108个克隆（CFU）的大sdAb噬菌体展示库被用于该筛选。文库生长于对数期，用M13KO7辅助噬菌体回收，并在具有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2×YT培养板中于振荡器上在30°C扩增过夜。用PEG/NaCl使噬菌体沉淀，并重悬于PBS中，储存于-80°C。为进行噬菌体淘选，将微孔板(Pierce,Prod#15100)包被CD3-His，这是通过将它们以100μg/ml在PBS(pH7.0)中于4°C孵育过夜而实现的。同时，噬菌体颗粒被与含有2%脱脂奶粉的PBS封闭缓冲液在室温下孵育1小时以阻断非特异性结合。在用PBS漂洗3次后，将噬菌体颗粒加入微孔中，并在振荡器上于室温孵育1小时。孵育之后，通过用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）漂洗小孔6次随后再用PBS漂洗2次来洗去未结合的以及非特异性结合的噬菌体。结合的噬菌体立即被用来在37°C感染对数生长期的E.coliTG1细胞（OD600约为0.5）1小时。每个淘选循环之后，将被感染的细胞与10%甘油混合，随后储存于-80°C。在进行下一个循环的淘选时，将10ml的感染的E.coliTG1细胞储液加入30ml含有200μg/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的培养基中，并生长至对数期。培养物用M13KO7辅助噬菌体回收，扩增并沉淀噬菌体，以用于下一轮筛选。如上所述重复常规噬菌体展示淘选。3.3.2噬菌体ELISA单个的输出噬菌体克隆生长于96深孔平板中并通过噬菌体ELISA筛选以确认CD3-His特异性克隆。使用2μg/mlCD3-His包被96孔平板（在包被缓冲液中于4°C孵育过夜），以含有2%脱脂奶粉的PBS封闭。每孔加入约50μl的来自过夜细胞培养物的噬菌体上清液，并在4°C孵育2小时，随后用PBST洗涤四次。未结合的sdAb噬菌体通过与HRP标记的抗M13单抗在37°C孵育1小时来检测。用PBST再洗涤孔四次，每个孔中加入底物溶液。在450nm处测定吸收值。3.4FASEBA筛选和FACS验证3.4.1FASEBA筛选和亲和分级扩增输出噬菌体的编码sdAb片段的DNA并插入到pFASEBA载体中以筛选出先导抗体。在96深孔平板中接种单个的FASEBA文库克隆并诱导表达。进行ELISA筛选以分离特异性识别CD3-His蛋白的sdAb，并且选择用于Octet的亲和分级的表达培养基。在OctetRED96仪器（ForteBio）上进行解离速率筛选（Off-ratescreening）。所有测试都在30°C进行。表达培养基中的sdAb-SASA蛋白被捕获至包被BSA的生物传感器并与CD3蛋白在溶液（1xPBS,pH7.4,0.05%Tween-20）中一起孵育。其中一种浓度（100nM）的CD3被用于解离速率分级。基线和解离步骤仅在缓冲液（1xPBS,pH7.4,0.05%Tween-20）中进行。使用Fortebio数据处理软件以动力学数据分析模式通过1:1Langmuir结合模式来测定结合动力学。与CD3以高亲和力相互作用的结合物被筛选出并进行DNA测序。3.4.2FACS验证为了筛选出结合Jurkat细胞而不结合KPCN细胞的sdAb，对培养物上清液进行流式细胞分析。Jurkat细胞和KPCN细胞生长至70-80%融合率时通过离心来收集细胞。每孔接种约4×105个细胞，以PBS洗涤2次。向细胞中加入200µl的培养物上清液并在室温下孵育1小时。用PBS洗涤后，向细胞中加入抗体以检测结合的sdAb。30分钟孵育后，用PBS洗涤细胞两次，并将细胞重悬于PBS。使用FACSCalibur(BDBioscience,SanJose,CA)和Flowjo软件分析细胞的sdAb结合。4.结果4.1免疫响应测试图2显示了血清效价实验结果。免疫后第一次和第二次测试血清的效价比免疫前血清高得多。免疫后第一次和第二次测试血清的效价之间没有观察到显著差异。4.2sdAb噬菌体展示库构建4.2.1总RNA提取从所有获得淋巴细胞中分离出约449µg总RNA（图3），约一半的总RNA被用来构建高质量文库。4.2.2RT-PCR和VHH扩增根据GenScript的SOP使用8对引物（4个正义引物x2个反义引物）进行RT-PCR。使用不同引物对获得的产物被混合在一起并进行凝胶纯化（图4）。一共获得约24µg纯VHHPCR产物。一般的PCR产物被用于文库构建。4.2.3文库扩展至少7.4×107个转化子可从一组电转化中获得，所以平行地进行了10次转化，以获得最终的文库。文库大小约~7.4×108为。根据菌落筛选，插入率为97.92%(94/96)（图5）。一共测序了72个克隆，64个克隆位于框内。没有一个具有相同的氨基酸序列（数据未示出），表明sdAb文库具有高度的多样性。4.3噬菌体文库淘选进行了两轮淘选和噬菌体ELISA，表1列出了相关细节。表1.淘选和噬菌体ELISA实验的详细信息轮次输入(pfu)输出(pfu)噬菌体ELISA阳性率1st2.0×10113.0×105~5%2nd3.5×10109.7×107~51%4.4FASEBA筛选和FACS验证4.4.1FASEBA筛选和亲和分级扩增第二轮输出噬菌体的编码sdAb片段的DNA，并插入pFASEBA载体中以通过ELISA筛选先导抗体。通过FASEBAELISA筛选得到32个克隆。该32个克隆都进行DNA测序，并进行与CD3的结合测试，随后通过OctetRED96进行解离速率分析。结合FACS的结果（4.4.2），利用FortteBio数据分析软件选择出曲线中低解离部分的单独克隆。表2显示了所选择的sdAb克隆的动力学数据。表2.sdAb克隆的动力学数据SampleID序列号koff(1/s)C62SEQIDNO.15.32E-05C84SEQIDNO.32.84E-054.4.2FACS验证通过FACS来验证阳性培养物（来自4.4.1）上清液的Jurkat细胞结合，KPCN用作阴性对照细胞系。结合亲和分级的结果（4.4.1），结合MFI列于表3。表3.培养物上清液与Jurkat细胞和KPCN细胞*的结合MFISampleC62C84NC-sdAbTG1Jurkat细胞283312115.03132.03KPCN细胞82945154.5*:NC-sdAb(相同形式的非相关性sdAb)的培养物上清液被设置为阴性对照，TG1的培养物上清液被设置为背景对照。SEQUENCELISTING<110>中山大学<120>抗CD3单域抗体<130>16512CN<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>119<212>PRT<213>人工序列<400>1GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgThrPheSerAsnTyr202530HisMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluLeuVal354045AlaAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrThrAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAsnAsnAlaLysAsnThrMetSer65707580LeuGlnMetSerAsnLeuLysProGluAspThrGlyValTyrTyrCys859095ThrThrProThrGluLysGlySerSerIleAspTyrTrpGlyGlnGly100105110ThrGlnValThrValSerSer115<210>2<211>405<212>DNA<213>人工序列<400>2caggtgcagctgcaggagtctgggggaggtttggtgcaggctgggggctctctgagactc60tcctgtgcagcctctggacgcacctttagtaactatcacatgggctggttccgccaggct120ccagggaaggagcgtgagttggtagcagctattagcgggagtggcggtagtacatactac180acagactccgtgaagggccgattcaccatctccagaaacaacgccaagaacacgatgtcc240ctgcaaatgagcaacctgaaacctgaggacacgggcgtttattattgtacaacacccacg300gaaaaggggagctcgattgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctccagcggc360cgctacccgtacgacgttccggactacggttccggccgagcatag405<210>3<211>124<212>PRT<213>人工序列<400>3GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnAlaGlyGly151015TyrLeuArgLeuSerCysAlaValSerGlyArgThrPheSerSerTyr202530AlaMetGlyTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluPheVal354045AlaAlaIleAsnTrpSerGlyGlySerThrTyrTyrValAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaSerGlyLeuGlyTyrThrIleValSerAlaSerGluTyrAsp100105110TyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120<210>4<211>420<212>DNA<213>人工序列<400>4caggtgcagctgcaggagtctgggggaggattggtgcaggctggggggtatttgagactc60tcctgtgcagtctctggacgcaccttcagtagttatgccatgggctggttccgccaggct120ccagggaaggagcgtgaatttgtagcagctattaactggagtggtggtagcacatactat180gttgactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtgtat240ctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttattactgtgcagcttccggc300cttgggtatactatagtttccgccagcgagtatgactactggggccaggggacccaggtc360accgtctccagcggccgctacccgtacgacgttccggactacggttccggccgagcatag420当前第1页1 2 3