一种制备MC4R基因敲除猪的方法与流程

本发明涉及基因工程和遗传修饰领域，具体地说，涉及利用CRISPR/Cas9系统对MC4R基因进行编辑，并通过体细胞核移植技术获得MC4R基因敲除猪。

背景技术：

PVN是食欲调节的一把钥匙，主要表达MC4R。在PVN区，MC4R的活性受弓状核不同神经元分泌的激素调节(如激动剂α-MSH和拮抗剂Agrp等)。MC4R与配体结合后被活化，细胞外的信号传到细胞内，激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP浓度增高。最终激活cAMP应答元件(cAMPresponseelement，CRE)调控的基因转录，从而调节细胞的物质代谢和基因表达。MC4R除参与经典的信号调节通路外，它还调节MAPK信号通路中某些信号因子的活性，发挥减少体重的功能。

MC4R可以作为大动物育种的一个候选基因。该基因的突变与体重及脂肪性状的呈现显著的相关性。如猪MC4R基因高度保守区内发生一个错义突变Asp298Asn，该位点多态性与猪的许多经济性状显著相关：MC4R基因型为298Asp时，猪表现为背膘厚减少、增长速度变慢、采食量降低，MC4R基因型突变为298Asn时，猪表现为背膘厚增多、增长速度加快、采食量提高等相关性状。

MC4R基因突变是最常见的单基因肥胖病因，占早期开始的严重儿童期肥胖的4％。

因而MC4R基因对于农业上大动物的育种改良，以及医学上的治疗早发性肥胖具有重要的意义。

因而通过制作基因敲除猪，在此模型的基础上阐明MC4R在猪脂肪发育中信号通路的作用，具有重要的意义。

CRISPR/Cas9是一种存在于细菌和古生菌中的适应性免疫系统。利用人工合成的sgRNA序列与基因组DNA的碱基互补配对，Cas9核酸内切酶可以实现基因组的定点切割，从而产生DNA的双链断裂。DNA双链断裂可以通过两种方式进行修复：其一是采取非同源末端连接修复方式(NHEJ)，这种方式会在双链断裂处产生随机类型的插入/缺失修复，可能会造成基因的移码突变，造成基因功能缺失。另一种修复方式是在以单链寡核苷酸或者双链Donor质粒载体为模板的指导下，通过同源重组(HR)的方式实现预期的精准修复。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种制备MC4R基因敲除猪的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供特异性靶向MC4R基因的sgRNA，其靶向MC4R基因CDS区6133-6152bp序列或7127-7146bp序列。

进一步地，当所述sgRNA靶向MC4R基因CDS区6133-6152bp序列时，其核苷酸序列为5’-ttctggaaccgcagcaccta-3’。

当所述sgRNA靶向MC4R基因CDS区7127-7146bp序列时，其核苷酸序列为5’-gactttctccttacacagtc-3’。

其次，本发明还提供了含有前述sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体。作为优选，其为连接有sgRNA的px-330质粒，所述pX330质粒购于Addgene公司。

所述CRISPR/Cas9打靶载体，是通过以下方法制备得到的：以合成引物的方式，合成sgRNA及其互补的寡核苷酸序列。将寡核酸序列进行退火操作，步骤为在94℃，5min；37℃，10min；冰上，5min。用限制性内切酶BbsⅠ酶切pX330质粒，切胶回收载体骨架，利用T4DNA连接酶与退火后的寡核苷酸产物进行连接。

进一步地，本发明还提供了一种制备MC4R基因敲除细胞的方法，将含有靶向MC4R基因CDS区6133-6152bp序列的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体，与含有靶向MC4R基因CDS区7127-7146bp序列的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体共转染细胞，从而敲除细胞的MC4R基因。

与此同时，本发明还提供了一种制备MC4R基因敲除猪的方法，即同时利用靶向MC4R基因CDS区6133-6152bp序列的CRISPR/Cas9打靶载体与靶向MC4R基因CDS区7127-7146bp序列的CRISPR/Cas9打靶载体，对MC4R基因实现敲除。

具体而言，所述方法包括如下步骤：

(1)将含有靶向MC4R基因CDS区6133-6152bp序列的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体、含有靶向MC4R基因CDS区7127-7146bp序列的sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体、与PL452-Neo质粒分别进行酶切，得到线性化片段；所述pl452-Neo质粒购于Addgene公司；

(2)将步骤(1)得到的线性化片段共转染猪的胎儿成纤维细胞，通过G418(遗传霉素)筛选具有抗性的单细胞克隆；

(3)选取状态良好的阳性单细胞克隆作为核移植的供体细胞，卵母细胞作为核移植的受体细胞，利用体细胞核移植技术构建克隆胚胎，将优质的克隆胚胎移植到代孕母猪的输卵管内，经过全期发育获得MC4R基因敲除猪。

其中，CRISPR/Cas9打靶载体pX330(包括靶向MC4R基因CDS区不同序列的两种CRISPR/Cas9打靶载体pX330)与PL452-Neo基因进行共转猪的胎儿成纤维细胞的方法为：pX330质粒的总量为4μg(两种pX330各2μg)，PL452-Neo基因线性载体与pX330质粒按照摩尔比1:3混合，利用lonza核电转仪及成纤维细胞电转试剂盒进行转染。

进一步地，本发明还提供了前述sgRNA或前述CRISPR/Cas9打靶载体在CRISPR-Cas9特异性敲除猪MC4R基因中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明首次针对猪MC4R基因的CDS区的两个位点设计的sgRNA，并借助CRISPR-Cas9系统对两个位点同时进行切割，实现了MC4R基因的大片段删除，并且获得了大片段删除的敲除猪个体，这种制备MC4R基因敲除猪的方法在国内外之前是没有报道的。为研究猪MC4R基因提供了一种切实可行的方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中针对MC4R基因设计的靶向序列位置。

图2为本发明实施例7中对单克隆细胞进行测序后，序列比对的结果。

图3为本发明实施例9中使用PCR方法鉴定新生猪的突变类型；其中，1号为820，2号为11502，3号为11501，4号为11503，5号为死胎，WT为野生型。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

其中：

pX330载体，pl452-Neo质粒购于Addgene公司；

T4DNA连接酶、Q5超保真酶、BbsⅠ及T7EN1购于NEB公司；

引物合成由上海生工完成；

测序由美吉生物公司合成。

质粒去内毒素提取试剂盒及基因组提取试剂盒购于QIAGEN公司。

胶回收试剂盒购于GENSTAR公司。

酶切、连接、切胶回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

实施例1、CRSIPR/Cas9打靶载体cas-1-3、cas-3-3的构建

根据CRISPR/Cas9的作用原理，在猪MC4R基因的CDS区设计sgRNA序列，如图1所示。

选取cas9靶点1-3：

sgRNA序列为5’-ttctggaaccgcagcaccta-3’，根据碱基互补配对的原则，其反向互补序列为5’-taggtgctgcggttccagaa-3’；

选取cas9靶点3-3：

sgRNA序列为5’-gactttctccttacacagtc-3’，根据碱基互补配对的原则，其反向互补序列为5’-gactgtgtaaggagaaagtc-3。

pX330载体骨架需要使用BbsⅠ进行酶切，所以需要在sgRNA序列上补出BbsⅠ酶切位点的粘性末端，以利于其连入pX330载体骨架。加入BbsⅠ粘性末端的sgRNA序列及其互补序列。

a.将设计好的加入BbsⅠ酶切位点粘性末端的sgRNA及其互补序列以合成引物的方式进行合成。将合成的寡核苷酸进行退火操作，使其形成带有粘性末端的DNA双链。退火程序如下：94℃，5min；37℃，10min；冰上，5min。

b.pX330载体骨架使用BbsⅠ酶切，37℃水浴4h。然后进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的条带。

c.载体骨架与sgRNA序列连接。将回收的载体骨架与sgRNA序列退火产物于16℃连接仪进行连接过夜。将连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃培养箱培养，待其长出单克隆后，挑取单克隆划线，并进行测序鉴定阳性单克隆。测序引物为F:5'-GAGGGCCTATTTCCCATGAT-3'；R：5'-GGAAAGTCCCTATTGGCGTTA-3'。构建好的质粒(打靶载体)命名为cas-1-3、cas-3-3。

实施例2、阳性菌落的大量培养

a.挑取测序正确的阳性单克隆菌落，将其加入2-5ml氨苄抗性的LB培养基中，于摇床中37℃，300rpm剧烈摇动8h。

b.将初始培养的菌液以1/500-1/1000的稀释比例加入到100ml氨苄抗性的LB培养基中，于摇床中37℃，300rpm剧烈摇动12h-16h。

实施例3、cas-1-3、cas-3-3质粒的去内毒提取

参见QIAGEN公司的EndoFree Plasmid Maxi Kit说明书。将提取好的质粒测浓度后分装、冻存，用于后续的猪胎儿成纤维细胞的转染。

实施例4、PL452-Neo质粒的酶切

使用NEB公司的限制性内切酶NotⅠ和NheⅠ对PL452-Neo质粒酶切，37℃水浴4h。使用Genstar的胶回收试剂盒回收,测浓度后分装，冻于-20℃冰箱备用。

实施例5、猪胎儿成纤维细胞的建系

a.将妊娠30天的农大小香猪麻醉，从其子宫内无菌取出胎儿，用含双抗的PBS清洗胎儿后，置于超净工作台中，用眼科剪去除胎儿的头部、四肢、内脏及软骨组织，用PBS冲洗干净；

b.在细胞培养皿内用眼科剪将剩余组织剪碎成约1mm³小块；

c.加入适量的FBS，保持组织不至于过分干燥。将剪碎的组织块转移到1个T75细胞培养瓶中，将组织块均匀铺开；

d.加入5mL细胞培养基，将铺有组织块的一面向上，不被培养基浸没，于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～5h后，将T75翻转，使组织块被培养基浸没；

e.培养3天左右，观察到组织块周围有大量细胞爬出，待细胞生长至约90％汇合度时，对细胞进行消化并冻存备用。

实施例6、猪胎儿成纤维细胞的转染和中靶单细胞克隆的筛选：

a.将一个六孔板孔中，已达到80-90％汇合的猪胎儿成纤维细胞，进行消化、离心，获得数量约2×10⁵-2×10⁶的猪胎儿成纤维细胞。

b.将质粒pX330-1-3、pX330-3-3及PL452-Neo基因线性化片段加入Lonza转染试剂中，混匀。

c.使用加入质粒的转染试剂重悬细胞，并将细胞悬液加入到电击杯中，T-016程序电击细胞。

d.电击完成后，立即将细胞吸出，加3ml含10％血清的DMEM到六孔板的一个孔中。

e.37℃，5％CO₂培养箱培养48h后，细胞达到80％-90％汇合，将细胞消化下来，稀释至20-30个10cm细胞培养皿中。

f.24-48h后，待10cm皿中的细胞贴壁、且状态良好，加入400-600μg/ml的G418，每隔一天补加一次G418，加药量根据细胞状态及汇合度灵活掌控，总加药量不能超过1000μg/ml。G418筛选10-14天，可见单克隆长出。

g.单克隆的挑取及扩大培养。在显微镜下，使用记号笔将状态良好的单克隆用圆圈圈出。弃掉10cm培养皿中的培养基，PBS清洗一次，将克隆环蘸取明胶，用克隆环将细胞单克隆圈住，加入10-30μl0.1％的胰蛋白酶，37℃消化1min。在显微镜下观察，细胞变圆、游离，加入含20％FBS的DMEM终止消化，将细胞吸出加入24孔板中。48-72h后，24孔板中细胞汇合至80-90％时，将细胞传至12孔板中。待12孔板中细胞达到80％-90％汇合时，对细胞进行冻存。

实施例7、中靶阳性单细胞克隆的鉴定

由于Cas9的切割造成双链断裂，NHEJ的修复方式会随机产生插入/缺失突变，因此我们需要以打靶单克隆的基因组为模板，PCR扩增打靶位点所在区域，对其区域进行测序，检测其碱基的插入/缺失突变的情况。

提取48个单克隆的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，PCR扩增引物为，PCR产物大小为1427bp。以野生型细胞的基因组作为阴性对照。PCR程序如下：98℃，30s；98℃，10s；56℃，30s；72℃，1min；72℃，2min。35个循环。缺失或者插入大片段的细胞单克隆，可以使用琼脂糖凝胶电泳进行初步判定。将PCR产物连接peasy-simple blunt载体进行测序，序列比对情况如图2所示。

实施例8、MC4R基因敲除猪的制备

a.以实施例7获得的阳性猪胎儿成纤维细胞为核移植供体细胞。培养胎儿成纤维细胞至100％汇合1-2天，去除培养皿内培养基，加入PBS洗涤1次，然后用0.1％胰蛋白酶消化约2min，待细胞变圆后立即后用含血清的细胞培养液终止消化，1000rpm离心5min，弃上清，用操作液T2重悬离心沉淀的细胞，冰浴放置备用。

b.以体外成熟的卵母细胞为核移植受体卵质。从母猪卵巢中采集卵丘卵母细胞复合体，经过体外成熟并用透明质酸酶脱去卵丘细胞，而后在体式显微镜下挑选排出第一极体、形态正常、胞质均匀的成熟卵母细胞备用。

c.在显微操作仪下，将核移植供体细胞移入去核的成熟卵母细胞中。经过电融合及化学激活，诱导细胞与卵子融合并同时激活卵母细胞。构建成重组胚胎，融合胚放入低氧培养环境下(低氧培养箱或充入低氧混合配气封袋密闭培养)培养。采用微滴或四孔板培养，气相条件为含7％O₂、88％N₂、和5％CO₂的混合气体，培养温度为39℃，湿度为100％。体外发育至1-4细胞期后观察卵裂情况及发育状态，并用于胚胎移植。

d.挑选形态正常、发育优良的克隆胚胎用手术法移植入胚胎同期的母猪内。移植步骤为舒泰常规麻醉，将母猪保定在手术架上面，尽量避开血管，在腹中线处切口，露出卵巢，输卵管及子宫，使用胚胎移植管吸取胚胎，然后沿输卵管伞部进入将克隆胚胎释放到输卵管壶腹部、峡部结合处。胚胎移植后给代孕母猪注射消炎针，30天后进行B超检测妊娠情况。

实施例9、MC4R基因敲除猪的DNA水平检测

使用新生公猪820#、11501#、11502#、11503#的耳组织提取基因组DNA，以其为模板对MC4R基因进行PCR扩增。PCR扩增引物F：5'-GATGCTAATCAGAGCCCTAC-3'；R：5'-TCCATTGTGCCTATAACCTG-3'。使用该引物对野生型猪基因组DNA进行扩增的PCR产物大小应为1427bp。若新生猪为基因敲除猪，则PCR产物大小约为420bp。结果表明11501#为部分缺失。其他样送测序比对结果表明820#及11502#发生移码突变，翻译提前终止。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。