一种酯酶EstP00714及其编码基因和应用的制作方法

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种酯酶EstP00714及其编码基因和应用。

背景技术：
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酯酶广泛存在于动物、植物及微生物中，是一类催化水解或形成酯键的酶，作用的底物通常是脂肪链小于十个碳原子的酯类。酯酶属于α/β折叠水解酶超家族，催化中心一般由丝氨酸、天冬氨酸/谷氨酸、和组氨酸组成，保守序列为丝氨酸附近的五肽(GXSXG)序列。酯酶能催化水解、酯化、转酯化等多种化学反应，是一种很重要的工业生物催化剂，被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、废水处理和饲料工业等领域。从催化特性来看，酯酶具有高度的化学选择性和立体异构选择性，且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。在生产应用中的酯酶的另一显著特点是它能在异相系统(即油-水界面)或有机相中作用。在水相中，酯酶通常催化水解反应，而在有机相中，它却能催化酯化和转酯化反应。通过微生物酯酶的生物转化制备新型药物中间体或者去除药物消旋体的非有效成分，是一种重要的手性技术，有着非常广阔的应用前景，它可以为合成手性药物提供新的平台，为大量制备光学纯化合物提供新的方法。酶法选择性拆分消旋体化合物，具有立体专一性高，副反应少，产率高，产物光学纯度好以及反应条件温和的优点，所以是一种被广泛认可的拆分方法。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种耐碱酯酶EstP00714及其编码基因和应用。

本发明从一株假单胞菌(Pseudonocardia antitumoralis)HUP007中开发得到一种酯酶EstP00714及其编码基因EstP00714，构建了含有酯酶基因EstP00714的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶EstP00714，其可应用于催化酯类水解反应。

本发明的第一个目的是提供一种酯酶EstP00714，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶EstP00714的酯酶基因EstP00714。

优选，所述的酯酶基因EstP00714的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种含有所述的酯酶基因EstP00714的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET-28a(+)载体。

本发明还提供了一种含有所述的酯酶基因EstP00714的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第三个目的是提供所述的酯酶EstP00714在催化酯类水解中的应用。

优选，所述的应用为酯酶EstP00714在催化拆分(±)-扁桃酸甲酯得到(S)-扁桃酸甲酯中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述的酯酶EstP00714在耐受Mg²⁺、Li⁺、Na⁺、K⁺、Tween-20、TritonX-100、正己烷、异辛烷、庚烷、DMSO和/或正癸醇环境下进行催化的应用。

本发明的酯酶基因Estp00714来自假单胞菌(Pseudonocardia antitumoralis)HUP007，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本发明利用生物信息学分析方法，比对得到一个酯酶基因EstP00714。通过PCR的方法，从上述假单胞菌(Pseudonocardia antitumoralis)HUP007中克隆得到一个酯酶基因EstP00714，全长为1146bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的酯酶EstP00714的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有381个氨基酸。将酯酶基因 EstP00714与表达载体pET-28a(+)连接后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的酯酶EstP00714。本发明的酯酶EstP00714对多种金属离子、表面活性剂和有机溶剂都有很好的耐受性；该酯酶Estp00714可用于制备(S)-扁桃酸甲酯，利用酯酶EstP00714作为催化剂，得到了底物对映体过量值95％以上的(S)-扁桃酸甲酯。本发明与传统的化学拆分相比具有反应条件温和、无污染、对映体过量值高的优点。本发明的酯酶EstP00714可用于生物医药、化妆品和精细化工等领域，具有非常大的应用价值。

附图说明：

图1是酯酶EstP00714的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白marker，泳道1为IPTG诱导后含有pET-28a(+)-EstP00714的E.coli BL21(DE3)蛋白上清，泳道2为IPTG诱导后含有pET-28a(+)-EstP00714的E.coli BL21(DE3)总蛋白，泳道3为纯化的酯酶EstP00714蛋白，泳道4为IPTG诱导前含有pET-28a(+)-EstP00714的E.coli BL21(DE3)总蛋白。

图2是酯酶EstP00714对不同侧链长度的对硝基苯酚酯的特异性。

图3是pH对酯酶EstP00714活性的影响。

图4是不同pH对酯酶EstP00714的稳定性影响。

图5是温度对酯酶EstP00714活性的影响。

图6是不同温度对酯酶EstP00714稳定性的影响。

图7是底物浓度对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响。

图8是反应时间对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响。

图9是(±)-扁桃酸甲酯气相色谱图；其中，S代表(S)-扁桃酸甲酯，R代表(R)-扁桃酸甲酯。

图10是酯酶EstP00714对(±)-扁桃酸甲酯的选择性水解气相色谱图；其中，S代表(S)-扁桃酸甲酯，R代表(R)-扁桃酸甲酯。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的酯酶基因EstP00714来源于基因组测序的假单胞菌(Pseudonocardia antitumoralis)HUP007，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。

实施例1：酯酶基因EstP00714开放阅读框边界确定及引物设计

提取假单胞菌(Pseudonocardia antitumoralis)HUP007的基因组DNA，经全基因组测序后，利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的酯酶基因，确定了酯酶基因EstP00714的开放阅读框，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，全长为1146bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的酯酶EstP00714的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共381个氨基酸。根据分析得到的酯酶基因EstP00714序列，设计全长扩增引物如下：上游引物：5′-CATGAATTCGTGCAGATCCAGGGTCAC-3′(下划线为EcoR I酶切位点)；下游引物：5′-CACCTCGAGTTAAAGGCAACTGCCAAG-3′(下划线为Xho I酶切位点)。

实施例2：酯酶基因EstP00714的克隆及载体构建

2.1PCR扩增

将实施例1设计的引物(上游引物：5′-CATGAATTCGTGCAGATCCAGGGTCAC-3′；下游引物：5′-CACCTCGAGTTAAAGGCAACTGCCAAG-3′)送至上海生物工程有限公司合成，合成的引物使用TE缓冲液溶解成终浓度为10μM，以提取的假单胞菌(Pseudonocardia antitumoralis)HUP007的总DNA作为DNA模板，建立如表1所示的反应体系：

表1 PCR反应体系

使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因EstP00714：95℃变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，进行32个循环；72℃延伸10min，冷却到18℃。

将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观察，回收1146bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用30μL无菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。

2.2酶切

将纯化回收的PCR产物使用以下酶切体系进行双酶切，酶切时间1.5h。酶切体系为：EcoR I 2μL，Xho I 2μL，DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至40μL。酶切后按照胶回收试剂盒的方法回收经过双酶切的PCR产物。

质粒pET-28a(+)的双酶切：挑取含有质粒pET-28a(+)的大肠杆菌DH5α单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoR I和Xho I按以下酶切体系进行双酶切，酶切时 间1.5h。酶切体系为：EcoR I 2μL，Xho I 2μL，质粒DNA<0.3μg，灭菌的双蒸水加至40μL。酶切后在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，按照胶回收试剂盒方法回收经过双酶切的线性pET-28a(+)载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶。酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen,Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，质粒提取试剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。

2.3连接

将经过双酶切的PCR产物和双酶切的pET-28a(+)载体按以下体系进行连接：双酶切的PCR产物5μL，双酶切的pET-28a(+)载体1μL，T4连接酶(5U/μL)0.5μL，连接缓冲液(5×)1μL，用去离子水补足5μL，连接温度为20℃，连接时间20min。由此得到连接产物。

2.4转化及筛选

取5μL连接产物加入50μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴20～30min，后于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm转速下，孵育培养1h。取一定量的菌液涂布于含50μL/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mL LB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

2.5基因核苷酸序列测定

将筛选的阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与酯酶基因EstP00714的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)进行比对，进一步确认是将酯酶基因EstP00714插入到pET-28a(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有酯酶基因EstP00714的 pET-28a(+)质粒(命名为pET-28a(+)-EstP00714)，可用于进行下一步试验。

实施例3：酯酶EstP00714在E.coli BL21(DE3)中的高效表达

3.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞制备

1.将少量大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入5mL LB试管液中，200rpm，37℃过夜培养；

2.按1％体积比的接种量将试管中的大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种到200mL LB摇瓶中，200rpm，20℃过夜培养，得到原培养物；

3.将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0℃，将原培养物分装至冰预冷的离心管(50mL)，冰置数分钟；

4.4℃，4000rpm离心10min回收细胞，弃上清；

5.用冰预冷的10mL 0.1M的CaCl₂重悬细胞，4℃，4000rpm离心10～15min回收细胞；

6.重复5，用10mL 0.1M的CaCl₂重悬细胞，冰浴30min以上；

7.4℃，4000rpm离心10min回收细胞；

8.每50mL原培养物得到的细胞用5mL含7.5％DMSO+CaCl₂来重悬，分装于1.5mL离心管，50～100μL每管。-80℃保藏。由此得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

3.2转化

取实施例2中得到的pET-28a(+)-EstP00714质粒0.5～1μL与50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，于42℃水浴锅热激90s，冰浴2min后加入500μL LB液体培养基，37℃200rpm培养1h。培养物离心后涂布50μL/mL的卡那霉素LB平板，培养20 h后挑选单菌。由此得到含有pET-28a(+)-EstP00714的大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例4：酯酶EstP00714的表达和纯化

4.1蛋白诱导

含有pET-28a(+)-EstP00714的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.85左右，加IPTG至浓度0.2mM，22℃培养16h。300mL菌液4000rpm，4℃离心20min，收集菌体，用30mL(50mM，pH 7.4)Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声400w，超4s，停6s，破碎15min分钟，离心，收集上清。

4.2酯酶EstP00714的纯化与SDS-PAGE电泳

用镍离子亲和层析柱纯化4.1中收集的上清，具体实施方案如下：使用25mM的咪唑洗脱5个柱体积，40mM咪唑洗脱20～30个柱体积，最后使用3.5mL 100mM咪唑洗脱，收集最后的3mL洗脱液。用脱盐柱SephadexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。将纯化的酯酶进行SDS-PAGE凝胶电泳，得到纯化的酯酶EstP00714(见图1)，纯化的蛋白大小约41.2kD，符合理论预期。

4.3酯酶EstP00714活性测定

酯酶EstP00714活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①用乙腈配制5mM的对硝基苯酚酯；②在0.2mL反应体系中加入187.5μL Tris-HCl buffer(50mM，pH 8.0)，10μL对硝基苯酚酯，2.5μL酯酶EstP00714纯酶液(0.0645μg/μL)；③20℃下，反应4min后，加入50μL正丙醇终止反应，于405nm测定吸光度。

酶活单位定义：1min内水解对硝基苯酚酯，释放1μM对硝基苯酚所需的酶量定义为一 个酶活单位。

实施例5：酯酶EstP00714的酶学性质

5.1水解不同侧链长度的对硝基苯酚酯

按照4.3的测定条件，比较酯酶EstP00714水解不同长度酰基的对硝基苯酚酯C₂-C₁₂，结果如图2。说明酯酶EstP00714对长链对硝基苯酚酯特异性差，而对于短链长度的对硝基苯酚酯的作用效果较好，最佳的底物是C₄，即对硝基苯酚丁酸酯。

5.2最适pH和pH稳定性

配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为50mM。

表2 不同pH的缓冲体系

将4.3中测定条件所述的缓冲液(pH 8.0Tris-HCl缓冲液)按照表2中的缓冲溶液分别进行替换，测定不同pH的缓冲溶液中酯酶EstP00714的酶活力，底物为对硝基苯酚丁酸酯。pH对酯酶EstP00714活性的影响结果见图3。在pH9.0的Tris-HCl缓冲溶液中，酯酶EstP00714的酶活性最高，pH值在8.0-10.0之间时有较高的酶活性。当pH低于7时，其活性迅速降低。酯酶EstP00714在20℃不同pH的缓冲液中的稳定性见图4。pH在8.0-12.0时酶活性较稳定，处理5h后残余活性在60％以上。而在过酸条件下，酶活丧失则较为明显。

5.3最适温度和温度稳定性

使用50mM的Tris-HCl pH8.0作为缓冲液，对硝基苯酚丁酸酯作为底物，按照4.3中的反应体系，在不同温度(4～65℃)下测定酶活。测得酯酶EstP00714催化水解对硝基苯酚丁酸酯的最适温度为40℃(图5)。在30-55℃间的酶活力达80％以上，温度大于55℃时酶活性急剧下降。将酯酶EstP00714在不同温度(30-50℃)下预处理，间隔一定时间取出按4.3中的测定方法测酶活，结果见图6。酯酶EstP00714在低于40℃时，酶活保持较高，处理1h后残余酶活仍保持70％以上。随着处理温度的升高，酯酶EstP00714残余酶活力逐渐下降，当温度高于50℃时酶活急剧降低，在50℃处理45min后，残余酶活力基本丧失(图6)，说明酯酶EstP00714在低于40℃时稳定性较好。

5.4金属离子对酯酶EstP00714活性的影响

按照表3中的金属离子种类和对应的终浓度，在反应体系Tris-HCl(pH 9.0)缓冲溶液中加入金属离子处理酯酶EstP00714，以未添加任何离子的反应体系中的酶活为100％作为对照，在20℃下孵育3h，按4.3的测定方法(以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)测定相对酶活。金属离子对酯酶EstP00714酶活性的影响见表3。与对照相比，2mM的Ba²⁺、Fe³⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺对酯酶EstP00714催化对硝基苯酚丁酸酯的活力有激活作用，2mM的Mg²⁺浓度作用下酶的活力达127.96％。低浓度的Li⁺、Ni²⁺、Na⁺、K⁺对酯酶EstP00714酶活影响较小，而Co²⁺和Zn²⁺对酯酶EstP00714的活力有明显的抑制作用。随金属离子浓度的增大，抑制作用加强。10mM的Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺对酯酶EstP00714酶活的抑制较强。

表3 金属离子对酯酶EstP00714活性的影响

5.5表面活性剂对酯酶EstP00714活性的影响

按照表4中的表面活性剂的种类和对应的终浓度，在反应体系Tris-HCl(pH 9.0)缓冲溶液中加入表面活性剂处理酯酶EstP00714，以未添加表面活性剂的反应体系中的酶活为100％作为对照，在20℃下孵育3h，按4.3的测定方法(以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)测定相对酶活。表面活性剂对酯酶EstP00714酶活性的影响见表4。TritonX-100在0.1％和0.5％两个质量浓度下对酶活影响不大，0.1％浓度的Tween-20和S10对酶活影响不大，并且随着浓度增加抑制作用增强。SDS、SDBS、CTAB在0.1％浓度下对酯酶EstP00714酶活具有强抑制性。

表4表面活性剂对酯酶EstP00714活性的影响

5.6有机溶剂对酯酶EstP00714活性的影响

按照表5中所示有机溶剂种类和对应的终浓度，在反应体系Tris-HCl(pH 9.0)缓冲溶液中加入有机溶剂处理酯酶EstP00714酶液，处理条件为20℃，孵育3h，以未加入有机溶剂的 反应体系中酯酶活性为100％作为对照，再按照4.3的测定方法(以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)测定相对酶活，结果如表5所示。在10％的浓度下，正己烷和异辛烷对酯酶EstP00714具有激活作用，庚烷和DMSO无明显影响，而其他有机溶剂对酯酶EstP00714有不同程度的抑制作用。在高浓度(50％)下，酯酶EstP00714在正己烷、庚烷、正癸醇中保持较高的酶活，残余酶活力为50％以上。以上结果说明该酯酶EstP00714能够耐受有机溶剂。

表5 有机溶剂对酯酶EstP00714活性的影响

实施例6：酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯

6.1pH对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

在不同pH反应体系中加入终浓度为60μg/mL酯酶EstP00714纯酶，30mM(±)-扁桃酸甲酯底物，在40℃下反应2h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算底物对映体过量值(e.e._s)和转化率(C)，结果见表6。从表中可以看出，在pH 8.5时，e.e._s达到99％，但转化率也达到99％，因此(S)-扁桃酸甲酯的得率很低，综合考虑，优化后的pH为7.0。

公式1：公式2：

式中：A_S和A_R分别表示(S)-扁桃酸甲酯和(R)-扁桃酸甲酯的峰面积，A₀和A分别表示反应前和反应后扁桃酸甲酯的峰面积。

表6 pH对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

6.2有机溶剂对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

在反应体系Tris-HCl(pH 7.0)缓冲溶液中加入终浓度为60μg/mL酯酶EstP00714纯酶，30mM(±)-扁桃酸甲酯底物，10％(v/v)表7中的有机溶剂，以未加有机溶剂为对照，在40℃ 下反应2h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算底物对映体过量值(e.e._s)和转化率(C)，结果见表7。

表7 有机溶剂对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

从表7中可以看出绝大多数有机溶剂的存在降低了酯酶EstP00714的立体选择性及转化率。乙醇对酯酶EstP00714的立体选择性影响相对较小。

6.3反应温度对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

在反应体系Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液中加入终浓度60μg/mL酯酶EstP00714纯酶，30mM(±)-扁桃酸甲酯底物，在不同温度下反应2h，手性气相色谱测定酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的立体选择性，结果见表8。

从表8中可以看出，e.e._s和转化率随温度的升高而增加，在45-50℃之间，e.e._s基本没变化，维持在95％，为得到(S)-扁桃酸甲酯最大产率，选择在相同e.e._s下转化率最小的温度为最适温度，即40℃。

表8 温度对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

6.4表面活性剂对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

在优化条件下(40℃，pH7.0 Tris-HCl缓冲液)，在反应体系中加入终浓度60μg/mL酯酶EstP00714纯酶，30mM的(±)-扁桃酸甲酯底物，0.01％(w/v)表9中的表面活性剂(Tween-20、Tween-80、TritonX-100、三聚磷酸钠)，以未加表面活性剂为对照，反应2h后，样品用于气相色谱检测，结果见表9。从表9中可以看出，与对照相比，在表面活性剂存在的情况下，e.e._s有不同程度的降低，三聚磷酸钠存在时，转化率提高，但e.e._s明显降低。TritonX-100的对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响相对较小。

表9 表面活性剂对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

6.5底物浓度对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

在优化条件下(40℃，pH7.0 Tris-HCl缓冲液)，在反应体系中加入终浓度为60μg/mL的酯酶EstP00714纯酶，20-90mM(±)-扁桃酸甲酯底物，反应2h后，样品用于GC检测，结果见图7。从图7中可以看出，随着底物浓度的增加，e.e._s和转化率会迅速下降。说明较高 的底物浓度下，反应的转化率下降。底物浓度为20mM时，e.e._s达到99％以上，但是转化率也达到99％以上，(S)-扁桃酸甲酯产率很低，因此选择30mM为最适底物浓度。

6.6反应时间对酯酶EstP00714拆分(±)-扁桃酸甲酯的影响

在优化条件下(40℃，pH7.0 Tris-HCl缓冲液)，在反应体系中加入终浓度为60μg/mL的酯酶EstP00714纯酶，30mM(±)-扁桃酸甲酯底物，隔不同时间取出500μL，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠除水，气相色谱手性柱检测，结果见图8。从图8中可以看出，随着反应时间的延长，e.e._s和C逐渐升高。反应2h后，e.e._s和转化率变化不明显，因此酯酶EstP00714催化(±)-扁桃酸甲酯的最适时间是2h，最适反应条件下的e.e._s为95％，转化率为86％。最适条件下反应前后气相色谱图见图9和图10。