一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用的制作方法

本发明涉及分子遗传学领域，具体的说是一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用。

背景技术：

褐飞虱属同翅目飞虱科，以水稻为主要的寄主。褐飞虱通过口针吸食水稻维管束鞘汁液，严重时造成稻株基部变黑、倒伏甚至枯死。褐飞虱在取食时传播水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病，同时也促使水稻纹枯病、小球菌核病的传播。随着耕作方式的改变和高产品种的大面积推广，褐飞虱危害逐年加重，已经成为我国和东南亚水稻生产的首要虫害，对粮食生产安全造成严重威胁。选育和种植抗褐飞虱水稻品种是最经济、最有效、对环境最友好的防控方法。

20世纪70年代以来，国内外学者在栽培稻和野生稻品种中相继鉴定出大量抗性材料，也开展了大量的抗虫基因定位和发掘工作。迄今为止，已报道定位了30个抗褐飞虱主效基因，其中Bph14基因是第一个通过图位克隆方法得到的抗褐飞虱基因。携带Bph14 的水稻品系B5 或者重组自交系RI35 抗褐飞虱，而没有携带Bph14 的水稻品种台中1号则对褐飞虱敏感，褐飞虱接虫后表现为茎秆枯黄，叶片萎蔫，育性降低甚至整株死亡。Bph14 cDNA 全长9576bp，包含有3 个外显子，编码一个由1323 氨基酸组成的蛋白产物。产物包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富亮氨酸重复序列（CC-NB-LRR）。重组自交系RI35与台中1号中的Bph14 基因序列差异很大，其中CC域和NB域很保守，而LRR具有独特的差异。

采用传统的回交选育抗虫水稻品种，需要在后代进行抗虫鉴定，费时费力，育种周期较长，利用分子标记辅助育种可以加快抗虫基因选育进程。目前选择Bph14基因改良水稻褐飞虱抗性的研究中主要利用其连锁标记（MRG2329，76-2等），但存在分辨率和准确性较低的缺点。

基于以上原因，需要新的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用被设计出来，通过Bph14基因在抗感品种中的DNA序列差异设计开发基因标记，并利用基因标记对水稻褐飞虱抗性进行定向改良，提高育种效率，即一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用。

技术实现要素：

为了解决上述现有水稻褐飞虱抗性改良的技术问题，本发明提供一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用，提供应用分子标记H14辅助选育抗褐飞虱水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，H14为引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有260bp的单条带，则表示该检测样品为Bph14基因纯合；如果有390bp的单条带，则表示该检测样品不含Bph14基因；如果有260bp和390bp两条带，则表示该检测样品为Bph14基因杂合。

进一步地，所述的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记H14，其正反引物序列为：

H14 F：5’- GCAGAGCTAACTAACGCAG -3’

H14 R：5’- TGGTCCTGAAACTGCTACT -3’

进一步地，所述水稻基因组DNA提取方法为常规CTAB法。

进一步地，所述PCR扩增体系为： 20ng水稻基因组DNA模板，10μl Taq PCR Mastermix，10 uM的前后引物各1 uL，补充dd H2O至20 μL。

进一步地，所述PCR程序为： 95℃预变性5 min，然后按95℃ 30 s，55℃下 30 s，72℃下 1 min 进行30个循环，最后72℃下延伸 5 min。

本发明的有益效果是：本发明利用核苷酸序列差异设计Bph14基因的功能分子标记，不存在遗传交换，准确性高；由于扩增片段差异较大可直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高效率。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明中Bph14基因在B5和日本晴基因组上的部分序列比对结果及H14标记的位置信息；

图2是本发明H14标记对8个水稻品种的电泳检测图。

其中：图1中虚线表示缺失碱基，从第7454到7593个碱基之间，B5和日本晴相比缺失了135碱基；图2中1-8分别表示水稻品种沪旱1B，秀水123，沪旱7B，黄华占，中组14，沪旱15，日本晴和B5。M表示D2000 Marker。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1-图2所示，本发明所述的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用，提供应用分子标记H14辅助选育抗褐飞虱水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，H14为引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有260bp的单条带，则表示该检测样品为Bph14基因纯合；如果有390bp的单条带，则表示该检测样品不含Bph14基因；如果有260bp和390bp两条带，则表示该检测样品为Bph14基因杂合。

进一步地，所述的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记H14，其正反引物序列为：

H14 F：5’- GCAGAGCTAACTAACGCAG -3’

H14 R：5’- TGGTCCTGAAACTGCTACT -3’

进一步地，所述水稻基因组DNA提取方法为常规CTAB法。

进一步地，所述PCR扩增体系为： 20ng水稻基因组DNA模板，10μl Taq PCR Mastermix，10 uM的前后引物各1 uL，补充dd H2O至20 μL。

进一步地，所述PCR程序为： 95℃预变性5 min，然后按95℃ 30 s，55℃下 30 s，72℃下 1 min 进行30个循环，最后72℃下延伸 5 min。

作为本发明一个较佳的实施例，本发明实施例中数据如下：

1、供试材料：抗虫水稻品种：B5感虫水稻品种：沪旱1B，秀水123，沪旱7B，黄华占，中组14，沪旱15，日本晴

2、水稻基因组DNA提取方法参考楼巧君（2006）中所述方法。（楼巧君, 陈亮, 罗利军. 三种水稻基因组 DNA 快速提取方法的比较[J]. 分子植物育种, 2006, 3(5): 749-752）

3、基因分子标记H14的开发：Bph14基因与参考基因组日本晴的同源基因有83%的相似性，在第7454到7593个碱基之间，B5和日本晴相比缺失了135碱基。根据核苷酸序列差异，利用Primer Premier 5.0软件设计引物H14，其正反引物序列为：

H14 F：5’- GCAGAGCTAACTAACGCAG -3’

H14 R：5’- TGGTCCTGAAACTGCTACT -3’

4、基因型检测：利用功能标记H14对供试水稻品种进行PCR扩增，PCR扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10μl Taq PCR Mastermix，10 uM的前后引物各1 uL，补充dd H2O至20 μL。PCR反应程序为： 95℃预变性5 min，然后按95℃ 30 s，55℃下 30 s，72℃下 1 min 进行30个循环，最后72℃下延伸 5 min。取PCR产物8 uL上样于2%的琼脂糖凝胶电泳检测，抗虫水稻品种B5扩增出260bp的单条带，在其他感虫水稻品种中均扩增出390bp的单条带，电泳条带清晰，差异明显，表明可以利用该标记进行水稻抗褐飞虱基因Bph14的辅助育种。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。