本发明涉及含119个天冬氨酸残基的聚天冬氨酰-赖氨酰-雌二醇(简称聚天冬-k-雌醇)，涉及它的制备方法，进一步涉及它在小鼠骨质疏松模型上的抗骨质疏松作用。因而本发明阐明了聚天冬-k-雌醇在制备抗骨质疏松药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和易发生骨折的全身性疾病。药源性骨质疏松症在临床普遍出现在服用糖皮质激素的患者。糖皮质激素，例如可的松、氢化可的松和地塞米松，是临床抗炎和免疫抑制的一线药物。虽然糖皮质激素有很好的抗炎和免疫抑制作用，但是它们引起骨质疏松症的副作用严重限制了它们的临床应用。虽然普遍使用的抗骨质疏松药物可以拮抗糖皮质激素引起的骨质疏松症，但是抗骨质疏松症药物都存在子宫内膜增生和凝血两种副反应。这种状态使得发明拮抗糖皮质激素的骨质疏松症副作用的新型抗骨质疏松药物，一直是药物研究的兴趣之一。不过，始终没有找到实质性解决办法。例如2006年美国公开的一项专利(us7067505b2)虽然涉及了一个天冬氨酸的主链和侧链羧基连接两个雌二醇的化合物(简称1-天冬缀2-雌醇)的合成方法，但是没有评价它的活性和副作用。2000年发明人就开始研究雌二醇的结构修饰，发现用天冬氨酸连接雌二醇的关键技术有两点。一点是天冬氨酸连接的雌二醇的数不得小于3，才能增强抗骨质疏松活性。另一点是天冬氨酸的两个羧基和一个氨基都不能裸露或者天冬氨酸数不少于2，才能保证消除雌二醇的凝血和子宫内膜增生两个副作用。为了确认us7067505b2的1-天冬缀2-雌醇的疗效缺陷，发明人特地合成了1-天冬缀2-雌醇并在手术摘除卵巢的去势模型和泼尼松诱导的化学阉割两个骨质疏松模型上评价了抗骨质疏松活性和副作用的改善状况。结果表明，同剂量下1-天冬缀2-雌醇的抗骨质疏松活性与雌二醇相当，与雌二醇一样1-天冬缀2-雌醇也引起子宫内膜增生和凝血。
发明人按照用天冬氨酸连接雌二醇的两个关键技术，将含119个天冬氨酸残基的聚天冬氨酰-赖氨酸与雌二醇缀合，实现了119个天冬氨酸通过118个赖氨酸残基连接118个雌二醇的目标。发明人发现，生成的含119个天冬氨酸残基的聚天冬氨酰-赖氨酰-雌二醇(简称聚天冬-k-雌醇)不仅可以完全拮抗糖皮质激素引起的骨质疏松症，还不会引起子宫内膜增生和凝血两种副反应。因此是理想的新型抗骨质疏松剂。根据这个发现，发明人提出了本发明。本发明的突出创造性在于目标化合物具有优秀的抗骨质疏松作用而避免了雌二醇的子宫内膜增生和血栓形成的副作用。
技术实现要素：
本发明的第一个内容是提供下式的聚天冬氨酸-赖氨酸-雌二醇衍生物(简称聚天冬氨酰-k-雌醇)。
本发明的第二个内容是提供聚天冬-k-雌醇的制备方法，包括以下步骤:
1)雌二醇与溴乙酸乙酯在丙酮中在k2co3存在下65℃回流，得到雌二醇-3-亚甲基乙酯；
2)将雌二醇-3-亚甲基乙酯在氢氧化钠水溶液中水解为雌二醇-3-o-乙酸；
3)用dcc法合成雌二醇-3-o-乙酰-lys(boc)-obzl。
4)雌二醇-3-o-乙酰-lys(boc)-obzl用氯化氢的乙酸乙酯溶液脱除boc，生成雌二醇-3-o-乙酰-lys-obzl。
5)dl-天冬氨酸脱水缩合，生成含118个丁二酰亚胺残基的聚丁二酰亚胺-天冬氨酸。
6)在四氢呋喃/蒸馏水为1/1的混合溶剂中，用三乙胺调节雌二醇-3-o-乙酰-lys-obzl的ph为8，在室温下先与含118个丁二酰亚胺残基的聚丁二酰亚胺-天冬氨酸反应，再氢解生成聚天冬-k-雌醇。
本发明的第三个内容的是测定聚天冬-k-雌醇的抗骨质疏松活性。
附图说明
图1聚天冬-k-雌醇的合成路线图。i)溴乙酸乙酯,k2co3,丙酮,回流,65℃；ii)2nnaoh；iii)lys(boc)-obzl,hobt/dcc,thf,nmm；iv)4n氯化氢/乙酸乙酯溶液；v)180℃,h3po4(80％),减压；vi)h2o/thf,tea；vii)h2,pd/c。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例。必须指出的是，这些实施例完全是例证性的。给出这些实施例的目的是为了充分明示本发明的意义和内容，决不对本发明造成任何形式的限制。
实施例1制备雌二醇-3-o-乙酸乙酯(1)
将10.00g(36.76mmol)雌二醇用丙酮溶解，之后加入5.60g(40.58mmol)k2co3和4.5ml(40.42mmol)溴乙酸乙酯，60℃回流12h，tlc(石油醚/乙酸乙酯，2/1)显示雌二醇消失。过滤除去k2co3固体，滤液减压浓缩，得到的残留物通过硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，100/1)，得到7.80g(59％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):358.85[m+h]+,739.93[2m+na]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝7.16(d,j＝8.4hz,1h),6.65(dd,j1＝8.4hz,j2＝2.7hz,1h),6.58(d,j＝2.7hz,1h),4.68(s,2h),4.50(d,j＝4.5hz,1h),4.16(q,j＝3.3hz,2h),3.52(m,1h),2.74(m,2h),2.26(d,j＝13.5hz,1h),2.11(m,1h),1.87-1.78(m,3h),1.53(m,1h),1.39-1.21(m,10h),0.66(s,3h)。
实施例2制备雌二醇-3-o-乙酸(2)
冰浴下将7.00g(19.55mmol)雌二醇-3-o-乙酸乙酯用150ml甲醇溶解，加入naoh水溶液(2m)调节ph到12，tlc(石油醚/乙酸乙酯，1/1，加入2滴冰醋酸)显示雌二醇-3-o-乙酸乙酯消失。反应混合物用5％khso4水溶液调节ph至中性，减压浓缩除去甲醇，残留物加入40ml蒸馏水，水溶液用5％khso4水溶液调节ph至2，然后用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯层用无水na2so4干燥，过滤，滤液减压浓缩得到5.89g(91％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):329.39[m-h]-,659.69[2m-h]-；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝12.95(s,1h),7.16(d,j＝8.4hz,1h),6.65(dd,j1＝8.4hz,j2＝2.1hz,1h),6.58(d,j＝2.7hz,1h),4.68(s,2h),4.50(d,j＝4.5hz,1h),3.52(m,1h),2.75(m,2h),2.26(d,j＝13.5hz,1h),2.11(m,1h),1.91-1.77(m,3h),1.53(m,1h),1.36-1.06(m,7h),0.67(s,3h)。
实施例3制备n-雌二醇-3-o-乙酰-lys(boc)-obzl
在冰浴下将3.60g(10.91mmol)雌二醇-3-o-乙酸用无水四氢呋喃(thf)溶解，加1.51g(11.19mmol)1-羟基苯并三唑(hobt)和2.52g(12.23mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)，活化0.5h。将4.81g(13.26mmol)hcl·lys(boc)-obzl溶于无水四氢呋喃中，用n-甲基吗啉(nmm)调节ph为8，并加到刚刚得到的活化液中，再用nmm调节反应液ph为8，撤去冰浴，室温反应8h，tlc板监测雌二醇-3-o-乙酸消失(二氯甲烷/甲醇，20/1)，反应液过滤除去二环己基脲(dcu)，滤液减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，过滤除去溶液中残留的dcu，乙酸乙酯层依次用5％碳酸氢钠溶液洗3次，饱和氯化钠溶液洗3次，5％硫酸氢钾溶液洗3次，饱和氯化钠溶液洗3次，5％碳酸氢钠溶液洗3次和饱和氯化钠溶液洗3次，得到的乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物用柱层析分离纯化(二氯甲烷/甲醇，40/1)得5.33g(75％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):649.41[m+h]+,1319.21[2m+na]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.34(d,j＝7.8hz,1h),7.34(m,5h),7.15(d,j＝8.4hz,1h),6.75(s,1h),6.69(dd,j1＝8.4hz,j2＝2.7hz,1h),6.62(d,j＝2.7hz,1h),5.13(s,2h),4.49(s,3h),4.34(m,1h),3.52(m,1h),2.84(d,j＝6.3hz,2h),2.74(m,2h),2.26(d,j＝13.5hz,1h),2.11(m,1h),1.87-1.57(m,6h),1.36-1.13(m,20h),0.66(s,3h)。
实施例4制备n-雌二醇-3-o-乙酰-lys-obzl
将2.40g(3.70mmol)n-雌二醇-3-o-乙酰-lys(boc)-obzl用25ml无水乙酸乙酯溶解，冰浴搅拌下加入30ml氯化氢的乙酸乙酯溶液(4m)。反应2h，tlc显示n-雌二醇-3-o-乙酰-lys(boc)-obzl消失(二氯甲烷/甲醇，15/1)，反应溶液用水泵反复抽干，除净氯化氢气体，残留物用无水乙醚反复研磨，得到1.83g(85％)标题化合物，为无色固体。esi-ms(m/e):548.71[m+h]+；1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.43(d,j＝7.5hz,1h),7.35(m,5h),7.14(d,j＝8.7hz,1h),6.68(dd,j1＝8.7hz,j2＝2.1hz,1h),6.62(d,j＝2.1hz,1h),5.13(s,2h),4.49(s,3h),4.38(m,1h),3.52(m,1h),2.73(s,2h),2.47(m,2h),2.34(d,j＝13.5hz,1h),2.11(m,1h),1.89-1.51(m,6h),1.36-1.13(m,11h),0.66(s,3h)。
实施例5制备含118个丁二酰亚胺残基的聚丁二酰亚胺(psi)
5g(37.6mmol)l-天冬氨酸，2ml(85％)磷酸和2ml蒸馏水彻底混匀。反应混合物在180℃空气浴下减压反应2.5h，趁热加入20mldmf，待溶液澄清后，将该反应液滴加至100ml蒸馏水中。收集沉淀，用蒸馏水洗至中性，干燥，得2.9g(84％)标题化合物，为无色固体。
实施例6制备含118个asp-lys(雌二醇-3-o-乙酰)-obzl的聚合物
将584.5mg(1.00mmol)n-雌二醇-3-o-乙酰-lys-obzl用10ml无水thf溶解，用三乙胺调节溶液ph至8，再慢慢滴加到含100mg(1.01mmol)psi(按照链中含118高丁二酰亚胺计算分子量)与40ml蒸馏水的悬浮液中。室温反应7天，反应液变澄清，减压浓缩去除溶剂，残余物用乙酸乙酯磨洗，得到501mg(77％)标题物，为无色粉末。1h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.55(s,1h),7.95(d,j＝6.0hz,1h),7.76(s,1h),7.32(m,5h),7.22(m,2h),6.64(m,3h),5.11(s,2h),4.73-4.35(m,8h),3.51-3.26(m,5h),2.72(m,10h),2.33(s,1h),2.08(s,1h),1.89-1.03(m,36h),0.76(s,1h),0.65(s,3h)。
实施例7制备含118个asp-lys(雌二醇-3-o-乙酰)的聚合物(聚天冬-k-雌醇)
将1.6g含118个asp-lys(雌二醇-3-o-乙酰)-obzl的聚合物用50ml乙醇溶解，加入160mg钯碳，通入氢气，室温氢解20h,反应结束。滤除钯碳,滤液减压浓缩，得到的残留物用蒸馏水溶解，通过葡聚糖凝胶g25纯化，得到1.2g(97％)目标化合物，无色固体。
实施例8估算聚天冬-k-雌醇的分子量
为了估算聚天冬-k-雌醇的分子量，本发明采用厌氧管充氮密封水解法测定天冬氨酸与赖氨酸的比例。厌氧管充氮密封水解法的具体实施步骤如下：
1)称取5mg样品于20ml厌氧水解管中，注意不要粘壁；
2)加入10mlhcl溶液(6mol/l，含0.1％的苯酚)，将样品全部浸没；
3)放入冰水中冷却10min；
4)充高纯氮气1-2min，注意保持水解管竖直，不要将液面溅起；
5)移开氮气后立即盖好软塞，旋紧密封盖；
6)将水解管置于110℃恒温烘箱中水解20h；
7)水解完成后冷却，充分混匀；
8)取水解液0.5ml，于45℃浓缩至干；
9)加入2ml样品稀释液，震荡混匀，用0.22μm针式过滤器过滤后，上机使用。
仪器采用全自动氨基酸分析仪(sykams433d)。样品通过分析得到氨基酸组成图谱，根据两种氨基酸的含量，再除以两种氨基酸的分子量，得到了两种氨基酸的摩尔比。计算得到聚天冬-k-雌醇中天冬氨酸与赖氨酸的摩尔比为1:0.911，说明psi与lys-obzl连接的准确性及聚丁二酰亚胺含118个丁二酰亚胺的准确性。再根据制备聚天冬-k-雌醇时雌二醇与聚丁二酰亚胺的1/1的mol比，可知聚天冬-k-雌醇的分子量为61053。
实验例1在去势模型上评价聚天冬-k-雌醇的抗骨质疏松活性
雌性icr小鼠(体重23.7±2.3g)80只随机分为假手术组、卵巢切除组+cmc-na(简称cmc-na组)、巢切除+雌二醇组(简称雌二醇组)、卵巢切除+聚天冬-k-雌醇组(简称聚天冬-k-雌醇组)、卵巢切除+聚天冬氨酸组(简称聚天冬氨酸组)。接受雌二醇治疗的小鼠每天口服给药，剂量为2.3μmol/kg。接受聚天冬-k-雌醇治疗的小鼠每天口服给药，剂量为10nmol/kg、1nmol/kg、0.1nmol/kg。所有小鼠都连续治疗4周。最后一次给药后30min进行鼠尾出血时间实验，次日，小鼠称体重，眼眶取血，然后处死、分离小鼠的肝和子宫，得它们的净重。取小鼠左侧股骨、剔除干净肌肉组织、用氯仿/甲醇(2/1)浸泡两次(每次3小时)脱脂、置120℃烘箱中烘6小时称干重、置800℃马福炉煅烧8小时称灰重、计算灰重与干重的比值(g/g)得矿含量。
称取每只小鼠手术前和治疗四周之后的体重，统计结果见表1。可以看出，经过四周治疗，雌二醇组小鼠的体重明显高于假手术组和cmc-na组小鼠体重，而聚天冬-k-雌醇治疗小鼠体重与假手术组和cmc-na组小鼠体重无显著差异。可见，聚天冬-k-雌醇消除了雌二醇的肥胖副作用。
表1聚天冬-k-雌醇治疗小鼠体重变化
n＝10；a)与cmc-na组比p<0.01，与假手术组比p<0.05；a)与cmc-na及假手术组比p>0.05。
给药四周后用stratecxctresearchsa+型双能x射线骨密度仪对小鼠股骨关节头下方0.2-0.4mm处进行定量断层扫描，得到总骨矿物质密度。表2表明，聚天冬-k-雌醇具有抗骨质疏松作用，活性随着给药剂量的降低而降低，具有剂量依赖关系。聚天冬-k-雌醇的抗骨质疏松活性等于雌二醇的230倍。同时聚天冬氨酸没有抗骨质疏松作用，说明在聚天冬-k-雌醇中聚天冬氨酸只起载雌二醇的作用。
表2聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的骨小梁密度
n＝10；a)与cmc-na比p<0.01；b)与cmc-na比p<0.01，与雌二醇比p>0.05；c)与cmc-na比和0.1noml/kg的聚天冬-k-雌醇组比p<0.01；b)与cmc-na比p>0.05。
测定得到的小鼠左侧股骨的干重、小鼠左侧股骨灰化后的灰重、小左侧股骨的长度和矿物质含量用表3表示。从中可以看到，聚天冬氨酰-k-雌醇具有抗骨质疏松作用，并具有剂量依赖关系。聚天冬-k-雌醇的抗骨质疏松活性等于雌二醇的230倍。
表3聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的股骨灰重及骨矿含量
n＝10；对骨灰重：a)与cmc-na比p<0.01,与假手术比p>0.05；b)与cmc-na比p<0.01，与雌二醇比p>0.05；c)与cmc-na比p<0.01；d)与cmc-na比p>0.05；对骨矿含量：a)与cmc-na比p<0.05；b)与cmc-na比p<0.05，与雌二醇比p>0.05；c)与cmc-na比p<0.05；d)与cmc-na比p>0.05。
给药四周后，小鼠摘除眼球取血，静置30min后，3000g/min离心20min，得血清，于-20℃保存。用邻甲酚酞络合酮法测定骨钙含量，用磷酸苯二钠为底物测定碱性磷酸酶含量。测得数据如表4所示。从骨钙和碱性磷酸酶水平可以看到，聚天冬氨酰-k-雌醇具有抗骨质疏松作用。聚天冬-k-雌醇的抗骨质疏松活性等于雌二醇的230倍。
表4聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的骨钙和碱性磷酸酶含量
n＝10；对骨钙含量：a)与cmc-na比p<0.05，与假手术比p>0.05；b)与cmc-na比p<0.05，与假手术和雌二醇比p>0.05；c)与cmc-na比p>0.05；对碱性磷酸酶含量：a)与cmc-na比p<0.05，与假手术比p>0.05；b)与cmc-na比p<0.05，与假手术和雌二醇比p>0.05；c)与cmc-na比p>0.05。
测定得到的小鼠的肝和子宫重及子宫厚度见表5。可以看到，雌二醇治疗的小鼠的肝和子宫重及子宫厚度明显大于cmc-na治疗小鼠的肝和子宫重及子宫厚度，存在脂肪肝和子宫内膜增生风险。而聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的肝和子宫重及子宫厚度与cmc-na治疗小鼠的肝和子宫重及子宫厚度没有显著性差异，消除了雌二醇的脂肪肝和子宫内膜增生风险。
表5聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的肝和子宫重及子宫厚度
n＝10；对肝重：a)与cmc-na和假手术比p<0.05；b)与cmc-na和假手术比p>0.05；对子宫重：a)与cmc-na比p<0.01；b)与雌二醇比p<0.01，与假手术比p<0.05；对子宫厚度：a)与cmc-na和假手术比p<0.01；b)与雌二醇比p<0.01，与假手术比p>0.05。
给药四周，最后一次给药30min后将小鼠装入固定装置内，使其尾巴暴漏在外，在距书尾末端2mm处做标记，在标记处快速剪去2mm末端，待血液能够自行溢出时开始计时，每隔30s用滤纸轻轻拭去伤口流出的血滴，直至血液自然停止，记录出血时间。结果如表6所示。可以看到，雌二醇治疗小鼠的尾出血时间明显短于cmc-na组小鼠，存在凝血风险。聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的尾出血时间与cmc-na治疗小鼠的尾出血时间没有显著性差异，不存在凝血风险。
表6聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的鼠尾出血时间
n＝10；a)与cmc-na组及假手术组比p<0.05；b)与cmc-na和假手术比p>0.05。
实验例2在泼尼松引起的小鼠骨质疏松模型上评价聚天冬-k-雌醇的抗骨质疏松活性
雄性icr小鼠(27.6±1.3g)随机分为泼尼松加cmc-na组(简称cmc-na组)、泼尼松加聚天冬-k-雌醇组(简称聚天冬-k-雌醇组)、泼尼松加雌二醇组(简称雌二醇组)和假手术组。各组小鼠每三天肌肉注射一次泼尼松(剂量为6.3mg/kg)及每天口服一次cmc-na溶液。接受聚天冬-k-雌醇或雌二醇治疗的小鼠每三天肌肉注射一次泼尼松，剂量为6.3mg/kg，以及每天口服一次聚天冬-k-雌醇或雌二醇的cmc-na溶液，剂量分别为1nmol/kg和230nmol/kg。所有小鼠都连续治疗4周。最后一次给药30min后，测定鼠尾出血时间。次日，小鼠称体重，眼眶取血，乙醚麻醉后处死、分离小鼠的肝和子宫称重。取小鼠左侧股骨、剔除干净肌肉组织、用氯仿/甲醇(2/1)溶液浸泡两次(每次3h)脱脂、置120℃烘箱中烘6h称干重、置800℃马福炉煅烧8h称灰重、计算骨矿含量。
称取每只小鼠手术前和治疗四周之后的体重，统计结果见表7。可以看出，经过四周治疗，雌二醇组小鼠的体重明显高于假手术及cmc-na组小鼠的体重。说明雌二醇明显引起小鼠肥胖症。聚天冬-k-雌醇组小鼠的体重与假手术和cmc-na组小鼠的体重没有明显差异，说明聚天冬-k-雌醇消除了雌二醇的肥胖副作用。
表7聚天冬-k-雌醇治疗前后小鼠的体重
n＝10；a)与cmc-na比p<0.01，与假手术组比p<0.05；b)与cmc-na及假手术组比p>0.05。
给药四周后用stratecxctresearchsa+型双能x射线骨密度仪对小鼠股骨关节头下方0.2-0.4mm处进行定量断层扫描定量骨小梁密度。从表8可以看到，与雌二醇一样，聚天冬-k-雌醇可有效地预防泼尼松引起的骨质疏松症。
表8聚天冬-k-雌醇治疗的小鼠骨小梁密度
n＝10；a)与cmc-na比p<0.05；b)与cmc-na比p<0.05，与雌二醇比p>0.05。
测定得到的小鼠左侧股骨灰化后的灰重和矿物质含量用表9表示。可以看到，与雌二醇一样，聚天冬-k-雌醇可有效地预防泼尼松引起的骨质疏松症。
表9聚天冬-k-雌醇治疗的小鼠股骨灰重及骨矿含量
n＝10；对骨灰重：a)与cmc-na比p<0.05，与假手术比p>0.05；对灰重/长：a)与cmc-na比p<0.05，与假手术比p>0.05。
给药四周后小鼠摘除眼球取血，静置30min后，3000g/min离心20min，得血清于-20℃保存。用邻甲酚酞络合酮法测定骨钙含量，用磷酸苯二钠为底物测定碱性磷酸酶含量。测得数据如表10所示。可以看到，聚天冬-k-雌醇可以预防泼尼松引起的骨质疏松。
表10聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的骨钙和碱性磷酸酶的含量
n＝10；对骨钙：a)与cmc-na比p<0.05，与假手术比p>0.05；对碱性磷酸酶：a)与cmc-na比p<0.05，与假手术比p>0.05。
测得的小鼠的肝和子宫重见表11。雌二醇治疗的小鼠的肝脏重量和子宫重量明显大于cmc-na组治疗的小鼠，存在子宫内膜增生风险。而聚天冬氨酰-k-雌醇治疗小鼠的子宫重量与cmc-na组治疗的小鼠没有显著性差异，不存在子宫内膜增生风险。
表11聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的肝和子宫重
n＝10；对肝重：a)与cmc-na和假手术比p<0.05；b)与雌二醇比p<0.05，与假手术比p>0.05；对子宫重：a)与cmc-na和假手术比p<0.05；b)与雌二醇比p<0.05，与假手术比p>0.05。
各组小鼠在最后一次给药30min后，将小鼠装入固定装置内并使其尾巴暴漏在外，在距小鼠尾末端2mm处快速剪断使血液能够自行流出并开始计时，每隔30s，用滤纸轻轻拭去切口处流出的血滴，直至出血自然停止，即滤纸上无血迹为止。记录出血时间，列入表12。结果表明，雌二醇治疗的小鼠的尾出血时间明显短于生理盐水组和假手术小鼠的尾出血时间。而聚天冬-k-雌醇治疗的小鼠的尾出血时间与生理盐水组和假手术小鼠的尾出血时间无显著差异。聚天冬氨酰-k-雌醇消除了雌二醇的凝血风险。
表12聚天冬-k-雌醇治疗小鼠的鼠尾出血时间
n＝10；a)与cmc-na组及假手术组比p<0.05；b)与雌二醇比p<0.05，与假手术比p>0.05。