一种新型的基因定量检测方法组合物、试剂盒和方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体而言，本发明涉及一种新型的基因定量检测方法-padlock-rca-elisa法，以及用所述方法进行动物组织中不同动物来源生长激素基因相对定量（猪和牛）以及线粒体细胞色素基因相对定量（猪和牛）的寡核苷酸探针组合物。还涉及包含所述组合物的padlock-rca-elisa试剂盒。
背景技术：
：基因定量检测在医疗诊断、传染病原监测、法医、食品安全中应用广泛。目前常见的方法是实时荧光定量pcr，最新的技术室数字化pcr。这些方法均需以pcr技术为基础，通过对目标基因在分子拷贝数上的放大来实现信号的检测。虽然该类技术灵敏准确，但需要依赖昂贵的仪器和试剂，难以满足现场或基层实验室的检测需求。本方法名为padlock-rca-elisa，通过将锁式探针和滚环复制技术结合，实现对目标基因分子的原位放大，配合传统elisa技术，通过微孔板固相捕获和酶联探针检测来获取目标基因的信号。该方法基于基因分子等温条件下的滚环复制原理，无需复杂的变温程序，因此在常规等温条件下即可操作。通过设定标准样品，可以通过类似elisa的流程来实现目标基因的定量检测。技术实现要素：本发明提供了padlock-rca-elisa检测方法，该方法采用基于padlock探针的rca技术，设计针对猪和牛生长激素基因及细胞色素b基因的特异性padlock探针，在液相环境中完成探针对相应基因序列的识别和成环连接，通过固定在elisa板上的捕获探针捕获padlock环，利用带报告基团标记的检测探针与固相rca滚环复制产物进行结合，最后在酶标仪通过检测探针的报告基团标记鉴定序列。本发明的方法在常规操作和等温条件下进行目标基因定量检测，突破实时荧光pcr方法和数字化pcr昂贵的成本限制。在本发明的一个方面，提供了检测牛和猪源性生长激素基因的特异性牛padlock1寡核苷酸探针seqidno.1（5’agctttgggctttagatcctcaatgctgctgctgtactaccaatagaggtacagtgaatgcgagtccgtctcgatggatgtgttcag3’）和特异性猪padlock1寡核苷酸探针seqidno.2（5’aaccttgggctttgcttctaatcctcaatgctgctgctttactagtgctggatgatcgtcccttctcggatggggcacc3’）。在所述两个序列的5’端是磷酸基团。该padlock1探针分别识别牛和猪生长激素基因的dna序列，并使其连接成环。另外，提供了检测牛和猪源性细胞色素b基因的特异性牛padlock1寡核苷酸探针seqidno.3（5’atccgatacatacacgccaagaaatcctcaatgctgctaggttccagtgaatgcgagtccgtctcagaaagaactacggctgaatc3’）和特异性猪padlock1寡核苷酸探针seqidno.4（5’attcgctatctacatgctcgtcaatcctcaatgctgctaaaagactagtgctggatgatcgtcccaagaagtaaattacggatgagtt3’）。在所述两个序列的5’端是磷酸基团。该padlock1探针分别识别牛和猪细胞色素b基因的dna序列，并使其连接成环。在本发明的一个方面，提供了牛生长激素基因模板seqidno.5（5’gttcacattcggaagccctaaagcccaaagctctgaacacatccatcggcaggg3’）和猪生长激素基因模板seqidno.6（5’gctcacattcggaagccccaaagcccaaggttggtgccccatccgtctgcatgg3’），该dna模板分别与牛和猪生长激素基因酶切产物序列相同。同时提供了牛细胞色素b基因模板seqidno.7（5’agctccgtttgcgtgtatgtatcggatgattcagccgtagttcacgtctcggcag3’）和猪细胞色素b基因模板seqidno.8（5’ctccgtttgcatgtagatagcgaataactcatccgtaatttacgtctcgacaaat3’），该dna模板分别与牛和猪细胞色素b基因酶切产物序列相同。在本发明的一个方面，还提供了生长激素基因和细胞色素b基因通用捕获探针序列seqidno.9（5’aaaaaaaaaagtacagcagcagcattgaggat3’）。在捕获探针5’端连接有能够使其固定在固相上的连接分子，例如生物素。通过该捕获探针，使连接成环的dna序列富集在固相上，例如固定在链霉亲和素包被的酶标板上。在本发明的一个方面，还提供了牛生长激素基因与细胞色素b基因通用padlock2寡核苷酸探针seqidno.10（5’atgatcgtccttatcactgccccgacaggcctcagacatcataatagctcctagtgctgg33’）和猪生长激素基因与细胞色素b基因通用padlock2寡核苷酸探针seqidno.11（5’gagtccgtctttatcactgccccgacaggcctcagacatcataatagctccagtgaatgc3’）在所述两个序列的5’端是磷酸基团。该padlock2探针分别识别牛和猪生长激素基因或细胞色素b基因rca产物的dna序列，并使其二次连接成环。在本发明的一个方面，还提供了对二次成环产物滚环复制的通用寡核苷酸探针seqidno.12（5’gatgtctgaggc3’）。该探针可将二次连接成环dna进行二次滚环复制，放大检测信号。在本发明的一个方面，还提供了牛检测探针序列seqidno.13（5’cagtgaatgcgagtccgtctuuuu3’）和猪检测探针序列seqidno.14（5’ctagtgctggatgatcgtccuuuu-3’），在所述两种检测探针的5’端均连接有报告基团，例如hrp标记。该检测序列与固相上的成环dna序列进行特异性连接，用于在酶标仪通过检测探针的报告基团标记鉴定序列。在本发明的另一个方面，提供了用于牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因定量检测的padlock-rca-elisa试剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。本发明提供的试剂盒包括本发明的用padlock-rca-elisa方法定量检测牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因的使用说明书。在一个实施方案中，本发明的牛肉和猪肉特异性padlock探针分别根据牛和猪的生长激素基因和细胞色素b基因序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含牛生长激素基因padlock1探针靶序列为ghpadlock1cow:5’agctttgggctttagatcctcaatgctgctgctgtactaccaatagaggtacagtgaatgcgagtccgtctcgatggatgtgttcag3’(seqidno.1)，猪生长激素基因padlock1探针靶序列为ghpadlock1pig:5’aaccttgggctttgcttctaatcctcaatgctgctgctttactagtgctggatgatcgtcccttctcggatggggcacc3’(seqidno.2)。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包含牛细胞色素b基因padlock1探针靶序列为cytbpadlock1cow:5’atccgatacatacacgccaagaaatcctcaatgctgctaggttccagtgaatgcgagtccgtctcagaaagaactacggctgaatc3’(seqidno.3)，猪细胞色素b基因padlock1探针靶序列为cytbpadlock1pig:5’attcgctatctacatgctcgtcaatcctcaatgctgctaaaagactagtgctggatgatcgtcccaagaagtaaattacggatgagtt3’(seqidno.4)。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包含牛生长激素基因模板序列为ghtemplatecow:5’gttcacattcggaagccctaaagcccaaagctctgaacacatccatcggcaggg3’(seqidno.5)，猪生长激素基因模板序列为ghtemplatepig:5’gctcacattcggaagccccaaagcccaaggttggtgccccatccgtctgcatgg3’(seqidno.6)。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包含牛细胞色素b基因模板序列为cytbtemplatecow:5’agctccgtttgcgtgtatgtatcggatgattcagccgtagttcacgtctcggcag3’(seqidno.7)，猪细胞色素b基因模板序列为cytbtemplatepig:5’ctccgtttgcatgtagatagcgaataactcatccgtaatttacgtctcgacaaat3’(seqidno.8)。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包含生长激素基因和细胞色素b基因通用捕获探针序列:5’aaaaaaaaaagtacagcagcagcattgaggat3’(seqidno.9)。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包含二次成环连接的生长激素基因与细胞色素b基因通用特异性牛padlock2探针序列为padlock2cow：5’atgatcgtccttatcactgccccgacaggcctcagacatcataatagctcctagtgctgg3’（seqidno.10）和二次成环连接的生长激素基因与细胞色素b基因通用特异性猪padlock2探针序列为padlock2pig：5’gagtccgtctttatcactgccccgacaggcctcagacatcataatagctccagtgaatgc3’（seqidno.11）以及二次成环产物滚环复制的生长激素基因与细胞色素b基因通用的猪和牛通用探针5’gatgtctgaggc3’（seqidno.12）。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包含生长激素基因与细胞色素b基因通用牛检测探针序列5’cagtgaatgcgagtccgtctuuuu3’（seqidno.13）和生长激素基因与细胞色素b基因通用猪检测探针序列5’ctagtgctggatgatcgtccuuuu3’（seqidno.14）。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于padlock-rca-elisa反应的试剂。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于定量检测牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因的padlock-rca-elisa扩增的条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的padlock探针成环连接反应条件是：生长激素基因体系为60℃1hr；细胞色素b基因体系为55℃1hr，捕获反应的条件是：37℃1hr，rca扩增反应的条件是：37℃1hr，二次padlock探针成环连接反应条件是：45℃1hr，二次rca扩增反应的条件是：37℃1hr。在一个具体的实施方案中，本发明的用于定量检测牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。本发明的另一个方面，提供了定量检测牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因的padlock-rca-elisa检测方法，所述方法使用了本发明的寡核苷酸序列、组合物或者试剂盒。该方法能在无需标准样品，无需数字化pcr仪的情况下，对牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因进行定量检测。本发明的另一个方面，提供了本发明的特异性padlock寡核苷酸探针、本发明寡核苷酸序列、组合物或者试剂盒的在检测牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因中的应用。所述padlock-rca-elisa检测方法包括步骤：1）使用牛生长激素基因padlock1探针序列seqidno.1或牛细胞色素b基因padlock1探针序列seqidno.3与牛生长激素基因模板序列seqidno.5或牛细胞色素b基因模板序列seqidno.7进行连接反应，获得环状dna序列；2）使用猪生长激素基因padlock1探针序列seqidno.2或猪细胞色素b基因padlock1探针序列seqidno.4与猪生长激素基因模板序列seqidno.6或猪细胞色素b基因模板序列seqidno.8进行连接反应，获得环状dna序列；3）使用生长激素基因和细胞色素b基因通用捕获探针seqidno.9进行捕获反应，将环状dna序列捕获在固相；4）恒温孵育进行滚环复制反应，从而扩增所捕获的序列；5）使用特异性牛生长激素基因与细胞色素b基因通用padlock2探针seqidno.10和特异性猪生长激素基因与细胞色素b基因通用padlock2探针seqidno.11进行二次连接反应，获得环状dna序列；6）使用二次成环产物滚环复制的通用探针seqidno.12进行二次滚环复制反应，放大检测信号；7）使用特异性牛生长激素基因与细胞色素b基因通用检测探针序列seqidno.13和特异性猪生长激素基因与细胞色素b基因通用检测探针序列seqidno.14与滚环产物进行结合，并通过酶标仪测量吸光值。在一个实施方案中，所述padlock-rca-elisa检测方法可检测到1pm浓度的猪生长激素基因和细胞色素b基因成分或1pm浓度的生长激素基因和细胞色素b基因。本发明的padlock-rca-elisa方法通过探针识别牛和猪基因特异序列，连接成环后通过rca滚环复制、二次连接成环、二次rca滚环复制以及检测探针结合，在酶标仪下通过检测探针的报告基团标记直接对样品中猪或牛生长激素基因和细胞色素b基因成分进行定量检测。本发明使用一种基于padlock-rca的技术，能够在等温条件使特异性探针与目标序列杂交成环、复制。本发明即基于该技术原理，设计猪或牛生长激素基因和细胞色素b基因特异性探针，优化技术条件，建立了能够对猪或牛生长激素基因和细胞色素b基因进行定量的elisa检测技术，利用实验室常规的恒温设备及酶标仪，实现对多个样品的同时简单、快速、特异且灵敏的定量检测。另外，本发明的padlock-rca-elisa法又无需数字化pcr仪和前处理试剂盒，极大降低成本，能同时处理多个样品，很大程度地提高方法通量。附图说明图1是padlock-rca-elisa反应示意图。图2是使用padlock-rca-elisa检测方法主要步骤电泳结果，a为cytb体系结果，b为gh体系结果，在连接成环反应后，可见成环产物，rca滚环复制后，可见明显滚环复制产物。图3是padlock-rca-elisa反应后酶标板检测结果照片，a为cytb体系结果，b为gh体系结果。结果表明在各自padlock体系中，模板浓度与elisa显色反应相应强度成正比。图4是padlock-rca-elisa检测方法对合成的猪和牛生长激素基因与细胞色素b基因靶序列进行检测。a为cytb体系，可定性检测1nm浓度含量猪或牛模板，定量检测10nm浓度含量猪或牛模板。b为gh体系，可定性检测1pm浓度含量猪或牛模板，定量检测10pm浓度含量猪或牛模板。具体实施方式通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。实施例1本实施例对猪和牛特异性padlock探针的特异性、灵敏度和线性相关性进行验证。探针序列由美国idt生物有限公司合成，padlock锁式探针5’端连接磷酸，捕获探针5’端标记生物素，检测探针5’端hrpmt标记。具体序列见下表。名称序列说明ghpadlock1cow探针5’agctttgggctttagatcctcaatgctgctgctgtactaccaatagaggtacagtgaatgcgagtccgtctcgatggatgtgttcag3’(seqidno.1)5’端连接磷酸基团ghpadlock1pig探针5’aaccttgggctttgcttctaatcctcaatgctgctgctttactagtgctggatgatcgtcccttctcggatggggcacc3’(seqidno.2)5’端连接磷酸基团cytbpadlock1cow探针5’atccgatacatacacgccaagaaatcctcaatgctgctaggttccagtgaatgcgagtccgtctcagaaagaactacggctgaatc3’(seqidno.3)5’端连接磷酸基团cytbpadlock1pig探针5’attcgctatctacatgctcgtcaatcctcaatgctgctaaaagactagtgctggatgatcgtcccaagaagtaaattacggatgagtt3’(seqidno.4)5’端连接磷酸基团ghtemplatecow模板5’gttcacattcggaagccctaaagcccaaagctctgaacacatccatcggcaggg3’(seqidno.5)-ghtemplatepig模板5’gctcacattcggaagccccaaagcccaaggttggtgccccatccgtctgcatgg3’(seq-idno.6)-cytbtemplatecow模板5’agctccgtttgcgtgtatgtatcggatgattcagccgtagttcacgtctcggcag3’(seqidno.7)-cytbtemplatepig模板5’ctccgtttgcatgtagatagcgaataactcatccgtaatttacgtctcgacaaat3’(seqidno.8)-通用捕获探针序列5’gtacagcagcagcattgaggat3’(seqidno.9)5’端标记生物素牛通用padlock2探针5’atgatcgtccttatcactgccccgacaggcctcagacatcataatagctcctagtgctgg33’(seqidno.10)5’端连接磷酸基团猪通用padlock2探针5’gagtccgtctttatcactgccccgacaggcctcagacatcataatagctccagtgaatgc3’(seqidno.11)5’端连接磷酸基团通用二次滚环通用探针5’gatgtctgaggc3’（seqidno.12）-牛通用检测探针序列5’cagtgaatgcgagtccgtctuuuu3’(seqidno.13)5’端标记hrpmt猪通用检测探针序列5’ctagtgctggatgatcgtccuuuu3'（seqidno.14）5’端标记hrpmt1.检测主要步骤：1）连接反应50μl连接反应体系由以下组成：10×ampligase缓冲液（美国epicentre公司）5μl，ampligase（美国epicentre公司）5u，padlock探针seqidno.1或2或3或4（10μm）1.5μl，模板seqidno.5或6或7或8（100nm）0.5μl，余量为去离子水。反应条件为生长激素基因体系60℃持续1h；细胞色素b基因体系55℃持续1h。通过该连接反应，使猪、牛生长激素基因或细胞色素b基因的直链dna序列成环。2）捕获将50μl捕获探针seqidno.9（100nm）加到链霉亲和素标记酶标板（美国thermo公司），室温放置震荡孵育30min，吸出溶液，用pbst(0.1%tween20)清洗2次，每孔加入0.5%pbsa（0.5%bsa）溶液200μl，37℃震荡孵育1h，用pbst清洗2次。由步骤1）获得的连接产物（每孔加45μl），37℃震荡孵育1h，用pbst清洗2次。通过该捕获反应，使成环的dna序列被固定在酶标板上。3）rca滚环复制在酶标板孔中进行滚环复制反应（rca）。rca反应体系由以下组成：10×phi29缓冲液（英国neb公司）5μl，dntp25mm0.5μl，phi295u，余量为去离子水。反应条件为37℃1hr。通过该rca复制反应，使固相酶标板上的捕获序列得到了扩增。4）二次连接反应50μl连接反应体系由以下组成：5×t4dnaligasebuffer（美国thermo公司）5μl，t4dnaligase（美国thermo公司）2u，padlock2探针seqidno.10或11（10μm）0.5μl，余量为去离子水。反应条件为45℃1hr。通过二次连接反应，获得环状二次连接dna序列。5）二次rca滚环复制在酶标板孔中进行二次滚环复制反应。反应体系由以下组成：10×phi29缓冲液（英国neb公司）5μl，二次滚环复制通用探针seqidno.12（10μm）0.5μl，dntp25mm0.2μl，phi295u，余量为去离子水。反应条件为37℃1hr。通过二次滚环复制反应，可以放大检测信号。6）检测探针偶联反应在酶标板孔中进行检测探针偶联反应。反应体系由以下组成：10×phi29缓冲液（英国neb公司）5μl，检测探针seqidno.13或14（10μm）0.5μl，余量为去离子水。反应条件为45℃45min。7）检测通过酶标仪测量酶标板个样品孔在450nm处的吸光值。2.特异性检测按照以上1）至7）的检测步骤，分别对合成的猪生长激素基因靶序列（浓度1nm）、牛生长激素基因靶序列（浓度1nm）进行padlock-rca-elisa检测。长激素基因体系特异性检测结果如图4-a所示，结果表明猪和牛的生长激素基因靶序列特异性良好，经统计分析，定性检测限为1nm模板浓度，定量检测限为10nm模板浓度。细胞色素b基因体系特异性检测结果如图4-b所示，结果表明猪和牛的生长激素基因靶序列特异性良好，经统计分析，定性检测限为1pm模板浓度，定量检测限为10pm模板浓度。该结果表明，本发明的方法特异性良好，可以对牛和猪生长激素基因和细胞色素b基因进行定量检测。当前第1页12