1.大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的VdKu80基因敲除突变体菌株VdXS11-△VdKu80,其特征在于,所述微生物保藏号为CGMCC No.12873。
2.如权利要求1所述的大丽轮枝菌VdKu80基因敲除突变体菌株,其特征在于,所述VdKu80基因被潮霉素抗性基因所替代。
3.如权利要求1所述突变体菌株的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)利用Split-marker方法构建大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体;
2)利用PEG介导的方法,将VdKu80基因敲除载体导入野生型大丽轮枝菌的原生质体内,获得大丽轮枝菌VdKu80基因敲除的转化子;
3)利用PCR方法对大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子进行筛选。
4.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,步骤1)中所述构建大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体为VdKu80 5F+2/3Hyg片段和2/3Hyg+VdKu80 3F片段。
5.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,步骤1)中所述大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体按照如下步骤构建而成:
1A)以大丽轮枝菌基因组DNA为模板,分别以2对PCR扩增特异性引物Ku80-5F/Ku80-5R、Ku80-3F/Ku80-3R为引物进行PCR扩增,获得大丽轮枝菌VdKu80基因上游片段VdKu80 5F和下游片段VdKu80 3F;
1B)以质粒gGFP为模板,以Hyg-For/Hyg-Rev为特异性引物进行PCR扩增,获得潮霉素抗性基因片段Hygromycin片段;
1C)将VdKu80 5F、VdKu80 3F片段和Hygromycin片段分别与pMDTM19-T Vector质粒进行连接反应,获得VdKu80 5F重组质粒、VdKu80 3F重组质粒和Hygromycin重组质粒;
1D)以VdKu80 5F重组质粒为模板,以Ku80-5F/Ku80-5RO为引物,进行PCR扩增得到VdKu80 5FO片段;以VdKu80 3F重组质粒为模版,以Ku80-3FO/Ku80-3R为引物,进行PCR扩增得到VdKu80 3FO片段;以Hygromycin重组质粒为模版,以M13F/M13R为引物,进行PCR扩增得到HygromycinO片段;
1E)以VdKu80 5FO片段和HygromycinO片段为模板,以Ku80-5F/HY-R为引物,进行融合PCR扩增,获得大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体1:VdKu80 5F+2/3Hyg片段;以VdKu80 3FO片段和HygromycinO片段为模板,以YG-F/Ku80-3R为引物,进行融合PCR扩增,获得大丽轮枝菌VdKu80基因敲除载体2:2/3Hyg+VdKu80 3F片段。
6.如权利要求3或4所述的构建方法,其特征在于,步骤2)中所述野生型大丽轮枝菌菌株为大丽轮枝菌XS11菌株。
7.如权利要求3或4所述的构建方法,其特征在于,步骤3)中所述PCR方法筛选大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子包括如下步骤:
3A)使用CTAB法提取大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子的DNA;
3B)以步骤3A)提取的DNA为模板,以Ku80-IF/Ku80-IR为引物,对所有转化子进行PCR扩增;
3C)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测,PCR扩增产物中未能扩增出Ku80基因片段条带的转化子筛选为大丽轮枝菌VdKu80基因敲除突变体。
8.如权利要求3或4所述的构建方法,其特征在于,还包括步骤4),采用Southern blot方法对大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子进行分析、鉴定。
9.如权利要求8所述的构建方法,其特征在于,所述大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子的分析、鉴定包括如下步骤:
4A)制备标记探针
以VdKu80 3F重组质粒为模板,以Ku80-3F/Ku80-P1为引物,进行PCR扩增获得探针片段;接着使用DIG High Prime DNA Labling and Detection Starter Kit I(Roche)试剂盒中的DIG-High Prime并按照试剂盒说明书对探针片段进行标记,获得地高辛标记探针;
4B)杂交处理
使用CTAB法提取大丽轮枝菌VdKu80基因敲除转化子的DNA;接着用KpnI限制性内切酶对DNA进行酶切处理;然后将酶切后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移至N+的硝酸纤维素膜上;再利用地高辛(DIG)标记探针进行杂交。
10.如权利要求1所述的大丽轮枝菌VdKu80基因敲除突变体菌株VdXS11-△VdKu80-9作为受体菌株在基因敲除试验中的应用。