一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法与流程

本发明属于生物制药技术领域，，更具体的说，涉及到一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法。

背景技术：

乳腺癌是全世界女性最常见的癌病之一，占新发癌症的第三位，占因癌症导致死亡的第五位，发病率占全身各种恶性肿瘤的7％～10％，占全部女性恶性肿瘤总数21％。乳腺癌每年约有7.9万新病例，上升趋势明显，已经成为当前严重威胁女性健康和生命的一类疾病。研究乳腺癌的防治对策是摆在全世界科学工作者面前的重要任务。

目前，乳腺癌治疗主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗三种方法。手术治疗，对于较早期的乳腺癌来说，是一种根治的方法，对较晚期的乳腺癌则常作为一种姑息性的治疗手段，且术后患者多伴有一定的并发症，严重影响生存质量。化疗，由于目前常用的药物选择性和特异性差，在杀伤癌细胞的同时会杀伤正常的组织细胞，毒副作用强，尤其是消化功能受损和骨髓造血功能受抑制等反应最为明显，往往使乳腺癌患者因反应严重而难以接受化疗或不能坚持完成整个疗程。放疗也存在着明显的毒副反应，且仅对年青且局部复发相对高危者的疗效较好，而对老年患者和任何年龄局部复发的高危人群作用差。由于传统治疗方式的局限性、风险大、耗资高、药物的选择性差、毒副作用强、增加病人痛苦等缺点，研究者致力于寻找更加高效、低毒、特异性强的治疗方法。

多项实验及临床研究均提示机体的免疫系统具有特异性清除肿瘤的作用。免疫疗法成为肿瘤治疗重要手段之一。其最大优点是针对肿瘤细胞，最具有特异性，不损害正常细胞，治疗效果为全身性，适用于治疗早期和晚期的患者。免疫治疗通过调节机体抗肿瘤各环节(免疫系统、神经内分泌系统、癌基因与抑癌基因、血管生成、精神因素等)的平衡，达到控制肿瘤或减轻治疗相关副作用的目的。因此，乳腺癌治疗正从传统的治疗方式向针对机制的多环节作用的高效、低毒、特异性强新型治疗模式发展。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于：提供一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法，解决现有免疫疗法治疗乳腺癌的过程中，无法快速、大量的获得杀伤作用强、体内存活时间长的免疫治疗效应细胞的问题。

本发明解决上述问题的技术方案为：提供一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法，包括如下步骤：

S100、融合细胞的制备：从乳腺癌患者自体癌组织分离出乳腺癌干细胞，使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得成熟DC细胞，将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞融合得到融合细胞；

S200、培养乳腺癌特异性CTLs：使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得T细胞，将所述T细胞与所述融合细胞按照10-20∶1的比例进行混合，共同培养获得乳腺癌特异性CTLs。

在本发明提供的乳腺癌特异性CTLs的制备方法中，所述步骤S100中还包括：

S101、乳腺癌干细胞的分离：将乳腺癌患者自体癌组织剪碎，经过胶原酶消化、过滤、悬浮、混合血清、离心获得乳腺癌干细胞；

S102、DC细胞的体外培养：从乳腺癌患者自体的外周血中分离外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞在含5-10％灭活的正常人AB血清的1640培养基里培养30-90min，吸去悬浮细胞，贴壁细胞用含800-2000U/ml GM/CSF、500-1000U/ml IL-4和5％正常人AB血清的1640培养基中培养5-7天，获得有树突形状的成熟DC细胞；

S103、细胞融合：将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞按照5-20∶1的比例进行混合，离心去掉上清液，加入在37℃预温的50％聚乙二醇1ml作用2-3分钟，使肿瘤细胞与DC融合，用不含血清1640培养液轻轻混匀，离心去掉含有聚乙二醇上清液，获得融合细胞。

在本发明提供的乳腺癌特异性CTLs的制备方法中，所述步骤S103之后还包括：

S104、融合细胞培养：所述融合细胞置于含有500-2000U/ml GM-CSF和含有10％自体血清的AIM-V培养液中，培养5-6天，根据细胞培养的状况，进行半量换液；

S105、细胞收集：收集培养获得的融合细胞，经200Gy辐照后备用。

在本发明提供的乳腺癌特异性CTLs的制备方法中，所述步骤S200中还包括：

S201、T细胞的体外培养：从乳腺癌患者自体的外周血中分离外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞在培养瓶中用纤粘连蛋白来源的短肽包被过夜，补加100-1000IU/ml IFN-γ，置于37℃、5％CO₂浓度、饱和水蒸气环境中培养；24小时后补加1000IU/ml IL-2、100-250ng/ml CD3 mAb、5-10ug/ml CD28 mAb；每2-3天补加含5％自体血浆、100-200IU/ml庆大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb的AIM-V完全培养液；

S202、乳腺癌特异性CTL的获得：所述T细胞培养至第7天时，将所述T细胞与所述融合细胞按10-20∶1的比例进行混合，共同培养，每2-3天补加含5％自体血浆、100-200IU/ml庆大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28mAb、500-2000IU/ml GM-CSF的AIM-V完全培养液，第12-14天收获细胞并计数。

实施本发明，具有如下有益效果：使用兼具乳腺癌干细胞特性、DC细胞抗原传递性的融合细胞刺激T细胞，产生可以特异杀伤乳腺癌干细胞的CTLs，获得的CTLs对乳腺癌细胞的凋亡有明显的促进作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明乳腺癌特异性CTLs的制备方法较佳实施例的流程图；

图2为本发明乳腺癌特异性CTLs的制备方法的操作流程图；

图3为乳腺癌MCF7细胞凋亡实验的结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的实施例进行具体描述。

杀伤性T细胞(CTLs：Cytotoxic T-cell lymphocytes)为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。使用CTLs特异性清除肿瘤的免疫疗法在治疗过程中最关键的是要获得大量杀伤作用强、体内存活时间长的免疫治疗效应细胞。

本发明的主要创新点在于：通过乳腺癌患者自体癌组织分离出乳腺癌干细胞，然后利用细胞融合技术，将患者自体的树突细胞(DC细胞:Dendritic Cell)与患者自体乳腺癌干细胞融合，获得兼具乳腺癌干细胞特性、DC细胞抗原传递性的融合细胞，再刺激产生大量可以特异杀伤乳腺癌干细胞的杀伤性T细胞CTLs。将获得的特异杀伤乳腺癌干细胞的CTLs回输患者体内，可以达到杀伤乳腺癌干细胞，防止复发、转移的效果。

图1为本发明乳腺癌特异性CTLs的制备方法较佳实施例的流程图，如图1所示，制备方法包括如下步骤：

S100、融合细胞的制备：从乳腺癌患者自体癌组织分离出乳腺癌干细胞，使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得成熟DC细胞，将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞融合得到融合细胞；

S200、培养乳腺癌特异性CTLs：使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得T细胞，将所述T细胞与所述融合细胞按照10-20∶1的比例进行混合，共同培养获得乳腺癌特异性CTLs。

图2为本发明乳腺癌特异性CTLs的制备方法的操作流程图，如图2所示，所述步骤S100中还包括：

S101、乳腺癌干细胞的分离：将乳腺癌患者自体癌组织剪碎，经过胶原酶消化、过滤、悬浮、混合血清、离心获得乳腺癌干细胞；

S102、DC细胞的体外培养：从乳腺癌患者自体的外周血中分离外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞在含5-10％灭活的正常人AB血清的1640培养基里培养30-90min，吸去悬浮细胞，贴壁细胞用含800-2000U/ml GM/CSF、500-1000U/ml IL-4和5％正常人AB血清的1640培养基中培养5-7天，获得有树突形状的成熟DC细胞；

S103、细胞融合：将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞按照5-20∶1的比例进行混合，离心去掉上清液，加入在37℃预温的50％(体积分数)聚乙二醇1ml作用2-3分钟，使肿瘤细胞与DC融合，用不含血清1640培养液轻轻混匀，离心去掉含有聚乙二醇上清液，获得融合细胞；

S104、融合细胞培养：所述融合细胞置于含有500-2000U/ml GM-CSF和含有10％自体血清的AIM-V培养液中，培养5-6天，根据细胞培养的状况，进行半量换液；

S105、细胞收集：收集培养获得的融合细胞，经200Gy辐照后备用。

所述步骤S200中还包括：

S201、T细胞的体外培养：从乳腺癌患者自体的外周血中分离外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞在培养瓶中用纤粘连蛋白来源的短肽包被过夜，补加100-1000IU/ml IFN-γ，置于37℃、5％CO₂浓度、饱和水蒸气环境中培养；24小时后补加1000IU/ml IL-2、100-250ng/ml CD3 mAb、5-10ug/ml CD28 mAb；每2-3天补加含5％(体积分数)自体血浆、100-200IU/ml庆大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb的AIM-V完全培养液；

S202、乳腺癌特异性CTL的获得：所述T细胞培养至第7天时，将所述T细胞与所述融合细胞按10-20∶1的比例进行混合，共同培养，每2-3天补加含5％(体积分数)自体血浆、100-200IU/ml庆大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb、500-2000IU/ml GM-CSF的AIM-V完全培养液，第12-14天收获细胞并计数。

现分别说明本发明实施例中个各具体步骤如下：

一、乳腺癌干细胞的分离纯化及富集

在无菌条件下，将获取的0.5-10平方厘米大小的乳腺癌组织标本放入无菌离心管中密封保存，并放入冰盒中尽快送回实验室；

将标本放置于超净台上，在培养皿中以青霉素链霉素混合液(1:1)冲洗2次，再用PBS缓冲液冲洗2-3次，以组织剪修剪去除肿瘤组织表面的脂肪组织、坏死组织和血块，然后再以PBS缓冲液冲洗修剪好的组织块2次；

将修剪好的组织放在培养皿中，以10％(体积分数)标准胎牛血清的DMEM/F12培养液浸泡，并用无菌眼科剪将组织块剪碎，以200目滤网滤过，收集浸泡液，将滤过液收集入一50ml离心管中，静置；

将滤网表面的组织放入另一50ml离心管中，加入0.1-0.5％(质量分数)胶原酶I/IV的消化液(胶原酶I/IV＝1：1)。在37℃振荡消化1-2小时；消化后又以200目滤网过滤，将消化剩余组织再次重复上述消化过程，重复3-5次直至最后一次滤过后滤网上不见微小组织块而只剩下粘稠的胶原为止；

将收集到的所有液体合并放入50ml离心管中，以800rpm离心10分钟。去上清液，收获底部的细胞加入0.1-0.5％(质量分数)胶原酶I/IV的消化液(胶原酶I/IV＝1：1)在37℃振荡消化1-2小时；消化后又以200目滤网过滤，1500rpm离心10分钟得到肿瘤细胞。

将肿瘤细胞用PBS(1-5％质量分数的BSA，0.01-0/03％质量分数的NaN₃，pH7.4)洗3次，40-70μm尼龙网过滤去除细胞团块和碎片后调整细胞数为1-10×10⁷/ml。

加入CD44抗体，一般1×10⁷个细胞中加入0.1-20μg抗体，室温反应30min。

1000rpm离心5min，弃上清中未结合的抗体。加入1ml磁珠分选缓冲液重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清，洗2次(2×1ml)。

1ml磁珠分选缓冲液重悬细胞，将细胞与1-200μl免疫磁珠混合，室温反应30min，间隔10min轻轻晃动反应管。

将反应管置入磁分离器中，静置15min，将未与磁珠结合的细胞用无血清培养基(赛默飞世尔11320 Gibco^TM)重悬，接种入75ml培养瓶中悬浮培养。

结合了靶细胞的免疫磁珠用1ml磁珠分选缓冲液洗5次(5×1ml)后，加入CD24抗体。重复前面的分选操作。

将与磁珠结合的细胞和未与磁珠结合的细胞分别用无血清培养基(DMEM/F12，EGF，bFGF，B27，胰岛素、转铁蛋白等)重悬，接种入75ml培养瓶中悬浮培养。

3-5天后收集悬浮的细胞球，用胰酶消化后重新接种入75ml培养瓶中悬浮培养。

5-7天后收集悬浮的细胞球备用，这些细胞就是富集的乳腺癌干细胞。

二、DC细胞的体外培养

用肝素抗凝管采集患者自体的外周血40-50ml，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)，PBMC在含5-10％灭活的正常人AB血清的l640培养基里培养30-90min，吸去悬浮细胞，贴壁细胞用含800-2000U/ml GM/CSF、500-1000U/ml IL-4、5％正常人AB血清的1640培养基中在6孔培养扳中培养5-7天。可见悬浮的有树突形状的成熟DC细胞。

三、DC细胞与乳腺癌干细胞的融合

如何将抗原引入DC细胞成为关键，常用的引入方法有：(1)人工合成肽为抗原；(2)肿瘤细胞裂解物或抽提物为抗原；(3)凋亡、死亡肿瘤细胞为抗原；(4)肿瘤提取出的mRNA为抗原；(5)基因转染法；(6)全细胞融合法。

由于目前对肿瘤细胞的特征还未完全了解，选择某种抗原作为肿瘤的标志是有缺陷的，所以我们选择将自体DC与乳腺癌干细胞融合，制备出特异性自体DC细胞/乳腺癌干细胞的融合细胞，兼具乳腺癌干细胞全部特性、DC细胞抗原传递性，可以在体外或者患者体内直接激活初始T细胞形成CTLs。

细胞融合工艺：

收获培养的原代肿瘤细胞，收集成熟的自体DC细胞，使DC与肿瘤细胞充分混匀(DC与肿瘤细胞的比例为5-20：1)；

离心去掉上清液，加入在37℃预温的50％(体积分数)聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG-1450)1ml作用2-3分钟，使肿瘤细胞与DC融合；

用不含血清1640培养液轻轻混匀，洗两次，离心去掉含有聚乙二醇上清液，置于含有500-2000U/ml GM-CSF和含有10％自体血清的AIM-V培养液中在24孔板中培养5-6天；

根据细胞培养的状况，进行半量换液。最后将目的细胞收集，经200Gy辐照后备用。

四、体外制备特异性杀伤乳腺癌干细胞的TCLs

(1)获得T细胞

用肝素抗凝管采集患者自体的外周血40-50ml，通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。将PBMC悬液置于新的T175瓶中(用纤粘连蛋白来源的短肽包被过夜)，补加100-1000IU/ml IFN-γ，置于37℃，5％CO₂浓度，饱和水蒸气环境中培养。24小时后补加1000IU/ml IL-2，100-250ng/ml CD3 mAb，5-10ug/ml CD28 mAb。

每2-3天补液，使用AIM-V完全培养液，含5％(体积分数)自体血浆、100-200IU/ml庆大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb，并补加800-2000U/ml GM/CSF、500-1000U/ml IL-4、100-1000IU/ml IFN-γ。

(2)肿瘤特异性CTLs的获得

培养至第7天时，将T淋巴细胞与DC/乳腺癌干细胞融合细胞按20：1比例进行混合，共同培养，使之成为肿瘤特异性CTLs。每2-3天补液，AIM-V完全培养液中含5％(体积分数)自体血浆、100-200IU/ml庆大霉素、1000IU/ml IL-2、5-20ug/ml CD28 mAb、500-2000IU/ml GM-CSF，第12-14天收获细胞并计数。

五、乳腺癌特异性CTLs的检测

检测组(Exp-CTLs)：上述步骤四中所获得的CTLs细胞。

对照组1(Control 1)：和未经过抗原刺激的DC细胞融合的CTLs细胞。

对照组2(Control 2)：CTLs细胞。

将乳腺癌MCF7接种于六孔板中并与上述检测组和对照组培养箱孵育24小时。反应结束后，利用Annexin V-FITC早期凋亡试剂盒(BD)，检测凋亡的细胞百分率。测得结果如图3所示。由图3可知，与检测组共培育的MCF7的细胞凋亡比率要明显高于对照组共培养的细胞。且彼此之间均达到了显著水平。*P小于0.5，**P<0.05，***P<0.01。综上实验结果表明。特异性针对乳腺癌的CTLs对MCF 7细胞的凋亡有明显的促进作用。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。