一种新型溶酶体内pH比率荧光探针的制备与应用的制作方法

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种可以检测溶酶体内pH的比率荧光探针的制备及其应用。

背景技术：

细胞内pH值在调节细胞的新陈代谢、酶活性、免疫等生理过程有着重要作用。真核细胞溶酶体pH值在4.0-5.5之间，通过质子泵、氯离子通道、质子从细胞质跨膜运输到溶酶体内过程维持pH值的稳定。在酸性环境中溶酶体内的水解酶、蛋白质保持很高的生物活性。在pH 4.0-5.5之间，溶酶体内的水解酶可以降解蛋白质、DNA、细菌等。当溶酶体内pH值偏离正常值将会导致细胞内功能紊乱。因此需要研发一种选择性好、灵敏度高、能够快速检测溶酶体内pH的方法。荧光探针具有灵敏度高、操作简单、可以实时无损伤成像的特点。荧光探针在活细胞或生物组织中检测阳离子、氨基酸、生物分子方面已经成为科研工作者们研究的热点。此外，靶向识别的荧光探针可以在细胞内对细胞器进行定位，输出更准确更直接的信息。最近几年出现报道，关于溶酶体靶向识别的pH的荧光探针，但是这些靶向识别的荧光探针都是基于荧光强度的探针，这些探针在测试分析时会受探针浓度、仪器灵敏度、测试环境的影响，干扰实验数据的准确性。比率荧光探针可以通过两个不同波长的荧光强度比值作为输出信号，从而减小探针浓度、仪器灵敏度、测试环境等多方面的影响。目前，科研工作者们报道了几个比率型的溶酶体pH荧光探针，但是这方面的研究远远不足。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种合成简单、反应条件温和、成本较低的溶酶体内pH荧光探针的合成方法；目的之二是提供一种选择性好、灵敏度高、定位效果好、以及毒性较小的溶酶体内pH值比率型荧光探针。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种采用荧光比率法对环境或细胞内pH检测的荧光比率荧光探针，其分子结构式如下：

具体合成方法如下：(a)在50mL圆底烧瓶中，将对硝基苯酚(0.5760g，4.0mmol)，1,4-二溴丁烷(1.3281g，8.0mmol)溶于丙酮(6mL)，再将K₂CO₃(0.8428g，12.7mmol)加入到烧瓶中，53℃下搅拌，薄层色谱监测反应，回流2天，反应完成。冷却至室温，抽滤，除去碳酸钾，滤饼用二氯甲烷洗涤，旋干滤液得到无色油状液体，进行柱分离，得到化合物1，白色固体0.6012g，收率：54.5％；

(b)在25mL圆底烧瓶中，将上步所得产物1(1.0963g，4.0mmol)，吗啡啉(0.4482g，5.2mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，将KI(0.1713g，1.0mmol)加入到烧瓶中。氩气保护，80℃下反应，薄层色谱监测反应，12小时反应完全，冷却至室温，将反应液倒入到40mL去离子水中，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干，得到化合物2，固体1.1012g，收率为98.2％；

(c)将上步所得产物2(0.8402g，3.0mmol)溶于20mL甲醇中，再加入钯碳催化剂(0.1803g)，65℃反应12小时，抽滤出去催化剂，滤饼用30mL二氯甲烷洗涤，旋干溶剂，得化合物3，棕色固体0.6604g，收率：88.0％；

(d)在25mL烧瓶中加入化合物4(0.2173g，1.0mmol)，3-溴丙炔(0.2380g，2.0mmol)溶于丙酮(10mL)，再加入碳酸钾(0.2764g，2.0mmol)53℃下反应，薄层色谱监测反应，12小时完成反应，抽滤除去碳酸钾，旋干溶剂，柱层析分离，得化合物5，黄色固体粉末0.2002g，收率78.4％；

(e)在25mL烧瓶中加入化合物3(0.2503g，1.0mmol)，化合物5(0.2662g，1.0mmol)，溶于N,N-二甲基甲酰胺(5mL)，再加入碘化亚铜(0.057g，0.3mmol)，110℃反应，薄层色谱监测反应，4小时后反应完成。冷却到室温，将反应液倒入到40mL去离子水中搅拌1小时，抽滤，滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥有机相，旋干溶剂，进行柱层析分离，得到产物CQ-Lyso，黄色粉末90mg，收率18.53％。

本发明的荧光探针的作用机理如下，探针分子CQ-Lyso发射黄色荧光。在溶液中当质子与探针分子CQ-Lyso反应时，质子加成到探针分子的喹啉环的氮原子上，导致加成后的产物CQ-Lyso+H⁺分子分子内电荷转移效应增强，溶液由黄色荧光变成红色荧光，而呈现比值型的荧光响应。从而实现特异性检测pH的目的，同时吗啉部分作为细胞内溶酶体的靶向识别基团。探针分子的响应过程如下：

本发明的荧光探针在测试体系为水和乙醇的混合体系(水和乙醇的体积比为7比3)，溶液呈现浅黄色，最大吸收峰在397nm，发射峰在560nm。在酸性条件下，在410-580nm区域出现一个新的吸收峰，最大吸收峰在501nm，新发射峰在613nm。

本发明的荧光探针具有大斯托克斯位移，在该测试体系中，探针斯托克斯位移值为163nm。在酸性条件下形成的产物CQ-Lsyol+H⁺，斯托克斯位移值为112nm。

本发明的荧光探针选择性好。选择性测试体系为水和乙醇的体积比为7比3的混合溶剂。测试浓度为5.0μM，测试温度为室温。当pH为7.4时，I_613nm与I_560nm的比值为0.524，pH为4.0时候比值为5.2。在干扰离子存在时，I_613nm与I_560nm的比值基本保持不变。(1)Blank,(2)Al³⁺,(3)Ca²⁺,(4)Cd²⁺,(5)Co²⁺,(6)Cr³⁺,(7)Fe³⁺,(8)K⁺,(9)Mg²⁺,(10)Na⁺,(11)Ni²⁺,(12)Pb²⁺,(13)Zn²⁺,(14)Fe²⁺,(15)Cu²⁺,(16)Ba²⁺,(17)Mn²⁺,(18)glucose,(19)GSH,(20)Cys,(21)Hcy,(22)H₂O₂,(23)glycine,(24)glutamic acid,(25)valine,(26)arginine,(27)lysine,(28)tryptophan,(29)threonine,(30)aspartic acid。

本发明的荧光探针灵敏度高，随着pH值的降低，613nm处的荧光强度(I_613nm)与560nm处的荧光强度(I_560nm)的比值逐渐增大，在pH为4.0-6.0范围内具有良好的线性，线性相关系数为0.9909。

本发明的荧光探针快响应速度快，探针分子加入到不同pH溶液中，荧光立即发生变化。

本发明的荧光探针探针具有高的稳定性，在10min内I_613nm与I₅₆₀的比值保持不变，探针在pH由7.4与4.0重复之间重复变化12次，I_613nm/I_560nm保持不变，可以实现很好的回复性。

本发明的荧光探针生物毒性小，MTT实验表明，探针浓度小于10.0μM对细胞毒性很小，细胞存活率接近100％。

本发明的荧光探针在活细胞中成像具有单波长激发，对溶酶体的定位效果较好，与溶酶体标记物对比，皮尔森系数高达0.97。

附图说明

图1为本发明荧光探针的选择性，荧光探针在不同pH溶液中的荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。探针浓度为5.0×10^-6mol/L。测试体系为含30％乙醇的水溶液。

图2为本发明的荧光探针在DMSO-d₆中核磁滴定前后核磁图谱。

图3为本发明的荧光探针在不同pH溶液中I_613nm与I_560nm的比值，横坐标为pH，纵坐标为I_613nm与I_560nm的比值。探针浓度为5.0×10^-6mol/L。测试体系为含30％乙醇的水溶液。

图4为本发明的荧光探针在pH＝4.0和pH＝7.4溶液中I_613nm与I_560nm比值随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为比值。

图5为本发明的荧光探针在pH＝4.0与pH＝7.4之间恢复性图。横坐标为重复次数，纵坐标为I₆₁₃/I₅₆₀比值。

图6为本发明的荧光探针与溶酶体标记物对比，靶向识别Hela细胞中溶酶体图。

图7为本发明的荧光探针在不同pH下细胞的成像图。

图8为本发明的荧光探针检测氯喹引起溶酶体内pH变化图。

图9为本发明的荧光探针MTT细胞毒性实验图,横坐标为药物浓度，纵坐标为细胞成活率。

具体实施实例

实施例1：中间产物1-(4-溴-丁氧基)-4-硝基-苯的合成，化合物1

在50ml圆底烧瓶中，将对硝基苯酚(0.5760g，4.0mmol)，1,4-二溴丁烷(1.3281g，8.0mmol)溶于丙酮(6ml)，再将K₂CO₃(0.8428g，12.7mmol)加入到烧瓶中，53℃油浴搅拌，薄层色谱监测反应，回流2天，反应完成。冷却至室温，抽滤，去除碳酸钾等，滤饼用30ml×2二氯甲烷洗涤，旋干滤液得到无色油状液体，用二氯甲烷与石油醚作为洗脱剂(v/v,1:2)进行柱分离，得到化合物1无色固体0.6012g，收率：54.5％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ_H 8.18(d,J＝9.2Hz,2H),6.95(d,J＝9.3Hz,2H),4.10(t,J＝5.9Hz,2H),3.51(t,J＝6.4Hz,2H),2.40-1.81(m,2H).¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ_C 163.9,141.5,125.9,114.4,67.8,33.2,29.2,27.6。

实施例2：4-[4-(4-硝基-酚氧-丁基)]-吗啡啉的合成，化合物2

在25ml圆底烧瓶中，将上步所得产物1(1.0963mg，4.0mmol)，吗啡啉(0.4482g，5.2mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中，将KI(0.1713g，1.0mmol)加入到烧瓶中。氩气保护，80℃油浴加热反应，薄层色谱监测反应，12小时反应完全，冷却至室温，将反应液倒入到40ml去离子水中，用二氯甲烷30ml×3萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干，得到化合物2固体1.1012g，收率为98.2％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ_H 8.21(d,J＝9.3Hz,2H),6.95(d,J＝9.3Hz,2H),4.10(t,J＝6.3Hz,2H),3.89-3.58(m,4H),2.48-2.41(m,6H),1.92-1.85(m,2H),1.74-1.67(m,2H).¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ_C 164.1,141.4,125.9,114.4,68.5,67.0,58.5,53.7,26.9,22.9。

实施例3：4-(4-吗啡啉-4-丁氧基)-苯胺的合成，化合物3

将上步所得产物2(0.8402g，3.0mmol)溶于20mL甲醇中，再加入10％

Pb/C(0.1803g)，65℃反应12小时。用硅藻土抽滤，滤饼用30ml二氯甲烷洗涤，旋干溶剂，得化合物3棕色固体0.6604g。收率：88.0％。δ_H 6.73(d,J＝8.8Hz,2H),6.63(d,J＝8.8Hz,2H),3.90(t,J＝6.3Hz,2H),3.73-3.71(m,4H),3.37(s,2H),2.45-2.38(m,6H),1.87-1.72(m,1H),1.71-1.56(m,1H).¹³CNMR(400MHz,CDCl₃)δ_C 152.1,140.0,116.4,115.6,68.3,67.0,58.7,53.7,27.3,23.1。

实施例4：8-丙-2-炔基氧基-2,3,6,7-四氢-1H,5H-哌啶[3,2,1-i,j]喹啉-9甲醛的合成，化合物5

在25ml烧瓶中加入化合物4(8-羟基-2,3,6,7-四氢-1H,5H-哌啶[3,2,1-i,j]喹啉-9甲醛)(0.2173g，1.0mmol)，3-溴丙炔(0.2380g，2.0mmol)溶于丙酮(10ml)，再加入碳酸钾(0.2764g，2.0mmol)53℃回流反应，薄层色谱监测反应，12小时完成反应，抽滤除去碳酸钾，滤饼用20ml二氯甲烷洗涤，旋干溶剂，洗脱剂用石油醚、乙酸乙酯(v/v,3:1)柱层析分离，得化合物5黄色固体粉末0.2002g，收率78.4％。¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ_H 10.03(s,1H),7.34(s,1H),4.63(d,J＝2.4Hz,2H),3.52-3.05(m,4H),2.81(t,J＝6.3Hz,2H),2.73(t,J＝6.3Hz,2H),2.55(t,J＝2.4Hz,1H),2.01-1.82(m,4H).¹³CNMR(125MHz,CDCl₃)δ_C 187.8,157.8,148.8,127.5,117.5,117.0,112.6,78.7,76.1,62.1,50.0,49.7,27.3,21.4,21.3,20.7.

实施例5：探针CQ-Lysol的合成

在25ml烧瓶中加入化合物3(0.2503g，1.0mmol)，化合物5(0.2662g，1.0mmol)，溶于N,N-二甲基甲酰胺(5ml)，再加入碘化亚铜(0.057g，0.3mmol)，110℃反应，薄层色谱监测反应，4小时后反应完成。冷却到室温，将反应液倒入到40ml去离子水中搅拌一小时，抽滤，滤饼用30ml乙酸乙酯洗涤，滤液用40ml×4乙酸乙酯萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥有机相，旋干乙酸乙酯，进行柱分离，洗脱剂用石油醚、乙酸乙酯(v/v,3:1)，重结晶，得到产物CQ-Lyso红色粉末90mg，收率18.53％。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ_H 7.89(s,1H),7.81(d,J＝9.1Hz,1H),7.67(s,1H),7.29(dd,J＝9.1,2.8Hz,1H),7.25(d,J＝2.8Hz,1H),5.24(s,2H),4.10(t,J＝6.5Hz,2H),3.62-3.49(m,4H),3.20-3.16(m,4H),2.75(t,J＝6.3Hz,2H),2.63(t,J＝6.5Hz,2H),2.36-2.32(m,6H),1.91-1.88(m,4H),1.83-1.77(m,2H),1.65-1.58(m,2H).¹H NMR(100MHz,CDCl₃)δ_C156.1,153.7，148.4,145.6,144.4,130.1,129.0,127.6,125.1,122.5,121.5,116.1,111.0,107.9,106.4,68.6,67.9,67.0,58.6,53.7,50.1,49.6,27.4,27.2,23.1,22.1,21.3,21.0.

实施例6：本发明的荧光探针的应用

探针分子能够动态监控溶酶体内pH的变化，Hela细胞首先培养在该探针的溶液中也中15分钟，然后移除溶液，PBS缓冲液洗涤三次，再将细胞培养在含有氯喹的溶液中(100.0μM和200.0μM)分别培养30分钟，然后用激光共聚焦显微镜成像，研究发现未用氯喹的处理的溶酶体的pH为5.4,氯喹处理后的pH分别为6.5和6.8。实验结果表明氯喹处理后溶酶体内的pH升高了，这种变化能够用该探针进行检测，证实了该探针的应用性。