本发明属于生物设备技术领域，尤其涉及一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒。
背景技术：
近年来，糖尿病患病率在全球呈现快速增长的趋势，我国人口患病率已达3％，该病给患者和社会带来了巨大负担。胰岛和干细胞的深入研究，为糖尿病治疗提出新的材料来源。
胰腺干细胞是干细胞的一个研究分支，干细胞是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞，它们可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。干细胞是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的始祖细胞。
胰腺组织存在一类具有多向分化潜力的细胞，即胰腺干细胞。胰腺干细胞具有较高的分化潜能。为满足科学研究的需求，大量培养胰腺干细胞成为主要的研究课题，目前专门用于培养胰腺干细胞的试剂盒较少，而试验人员进行分离培养胰腺干细胞的方式，培养用的各种试剂不尽相同，造成了培养的胰腺干细胞数量和质量无法达到试验的要求，并且现有技术有公开一些培养其他干细胞的试剂盒，例如CN104928238A公开的试剂盒，又如CN106047702公开的用于培养干细胞的试剂盒，以上试剂盒在培养胰腺干细胞时，其存在安全性、稳定性不高，细胞存活率和增殖率低等问题，为此，人们急需一种专门用于稳定的大量扩增培养胰腺干细胞的试剂盒。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，由该试剂盒培养的胰腺干细胞具有稳定性、活性高、增殖倍数显著提高等优点。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，该试剂盒包括保存液、培养液、培养液添加剂，所述保存液为含有5-10μg/mL双抗的L-DMEM培养基水溶液，所述双抗为重量份数比为1:1的青霉素和链霉素的混合物，所述培养液为L-DMEM培养基水溶液。
进一步的改进，试剂盒还包括生长因子a、生长因子b、第一组织分解液、第二组织分解液、细胞消化液、洗涤液和冻存液，所述第一组织分解液为含1-3mg/mL胶原酶IV型的PBS缓冲液或基础培养基，所述第二组织分解液为含1-3mg/mL胶原酶V型的PBS缓冲液或基础培养基，所述细胞消化液为含0.25-0.5mg/mL胰酶和0.02-0.05mg/mL乙二胺四乙酸的PBS缓冲液，所述洗涤液为PBS缓冲液。
本发明的培养液、培养液添加剂、生长因子a、生长因子b组成的溶液成为全培养液，配置方法为：将生长因子a、生长因子b和培养基添加剂溶于培养液中配置成全培养液，其中，生长因子a、生长因子b和培养基添加剂的浓度分别为10ng/mL、10ng/mL和50mg/mL。
本发明所指的L-DMEM培养基水溶液中L-DMEM培养基的浓度为10-20mg/mL。
本发明进一步为培养胰腺干细胞提供一种试剂盒，该试剂盒能够培养大量的胰腺干细胞，并且培养过程中能够保持胰腺干细胞的存活率和活性。
进一步的改进，所述冻存液主要由35-45％的L-DMEM培养基水溶液，40-60％的人血白蛋白水溶液和5-15％的DMSO组成。
进一步的改进，所述保存液中还含有15-30μg/mL的原花青素和10-15μg/mL的维生素C。
在保存液中加入原花青素和维生素C可以逆转分离的胰腺干细胞对青霉素和链霉素的耐药性，进而提高整个保存液的抗菌性能，保证胰腺干细胞的活性。
进一步的改进，所述保存液中还含有1-3μg/mL的羟乙基-β-环糊精和5-10μg/mL的氯化钠。
在保存液中加入乙基-β-环糊精和氯化钠的混合物，可以有效提高保存液的稳定性，避免保存液产生沉淀、分层和变色等问题。
进一步的改进，所述培养液添加剂包括如下重量份数的成分：木犀草素1-3份、小檗碱0.5-1份和枸橼酸钠5-10份。
在培养基添加剂中添加木犀草素、小檗碱和枸橼酸钠可以有效提高配置培养液的防止细菌、真菌和病毒感染的能力。
进一步的改进，所述培养液添加剂还包括重量份数如下的成分：β-胡萝卜素0.5-1份、氯化硒2-5份、白藜芦醇1-3份、聚甲基丙烯酸甲酯2-3份、麦芽糖醇1.3-2.5份和的谷氨酰胺2-3份。
在培养液添加剂中加入以上成分，可以提高培养液培养胰腺干细胞的增殖效率和扩增倍数。
进一步的改进，所述冻存液内含5-10μg/mL的聚丙烯葡聚糖、1-3μg/mL的月桂酰肌氨酸和0.2-0.5μg/mL的果胶。
在冻存液中加入上述成分可以使冻存性能更好好，胰腺干细胞复苏后存活率高，而且更利于胰腺干细胞冻存前后细胞形态的维持和稳定
进一步的改进，所述第一组织分解液和第二组织分解液内均含有1-3mg/mL透明质酸酶和0.3-0.5mg/mL透明质酸。
在第一组织分解液和第二组织分解液内加入透明质酸酶和透明质酸可显著缩短组织分解时间，提高分解效率，可以分解时间降低到8min以内。
进一步的改进，所述生长因子a为碱性成纤维细胞生长因子，所述生长因子b为表皮细胞生长因子。
通过对试剂盒结构的改变，使得该试剂盒结构简单，操作方便。
本发明另一方面还提供一种培养胰腺干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将离体的胰腺，放入盛装有保存液的试剂瓶，4℃保存；
(2)将生长因子a、生长因子b和培养基添加剂溶于培养液中配置成全培养液，其中，生长因子a、生长因子b和培养基添加剂的浓度分别为10ng/mL、10ng/mL和50mg/mL，配好的全培养液放置在4℃的冰箱中保存；
(3)用75％的酒精清洗胰腺3遍，加入3倍含10％双抗的洗涤液清洗3遍；
(4)用眼科镊子分离出胰腺组织；
(5)用洗涤液反复清洗；
(6)将所述胰腺组织用眼科剪剪成1-2mm3大小的胰腺碎块；
(7)将步骤(6)获得的所述胰腺碎块加入所述第一组织分解液和第二组织分解液中，水浴震荡，每3-5min震荡一次，持续20min，再加入步骤(2)配置的所述全培养液终止分解，过筛，离心；
(8)弃掉上层清液，得胰腺干细胞单细胞悬液，记为P0代胰腺干细胞，用步骤(2)配置的所述全培养液将P0代胰腺干细胞重悬，再按照1-2×106个/ml的密度接种在培养瓶中，将培养瓶放入37℃、5％CO2的CO2培养箱中，培养，每个三天换全培养液一次；
(9)将步骤(8)所得每三天更换全培养基一次，通过显微镜观察到胰腺干细胞生长面积达到80％左右时，先用所述洗涤液清洗2次，然后加入所述细胞消化液，适当震荡摇晃培养瓶，使所述细胞消化液与细胞充分接触，再放入培养箱中消化30-60s，最后加入步骤(2)配置的所述全培养基终止消化，所得胰腺干细胞记为P1代胰腺干细胞，取出一部分P1代胰腺干细胞放入所述冻存液中进行冻存，冻存密度为3-5×106个/ml冻存液，剩余P1代胰腺干细胞按照1：3比例进行传代；
(10)重复步骤(9)，将胰腺干细胞进行多次的培养和传代。
本发明提供的试剂盒为提供胰腺干细胞分离培养，扩增，传代，冻存一体的试剂盒，该试剂盒可在维持多能性和表面性同时减少的批量差异，并且节约时间和精力，可以更快得获得大量的胰腺干细胞，解决了胰腺干细胞分离数量少且纯度低、培养存活率低、培养效率不高、冻存复活率不理想等问题，使胰腺干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增培养，为利用胰腺干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源。
具体实施方式
实施例1
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，该试剂盒包括保存液、培养液、培养液添加剂，所述保存液为含有5μg/mL双抗的L-DMEM培养基水溶液，所述双抗为重量份数比为1:1的青霉素和链霉素的混合物，所述培养液为L-DMEM培养基水溶液。
实施例2
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，该试剂盒包括保存液、培养液、培养液添加剂、生长因子a、生长因子b、第一组织分解液、第二组织分解液、细胞消化液、洗涤液和冻存液，所述保存液为含有5μg/mL双抗的L-DMEM培养基水溶液，所述双抗为重量份数比为1:1的青霉素和链霉素的混合物，所述培养液为L-DMEM培养基水溶液；所述生长因子a为碱性成纤维细胞生长因子，所述生长因子b为表皮细胞生长因子，所述第一组织分解液为含1mg/mL胶原酶IV型的PBS缓冲液或基础培养基，所述第二组织分解液为含1mg/mL胶原酶V型的PBS缓冲液或基础培养基，所述细胞消化液为含0.25mg/mL胰酶和0.02mg/mL乙二胺四乙酸的PBS缓冲液，所述洗涤液为PBS缓冲液，所述冻存液由40％的L-DMEM培养基水溶液、50％的人血白蛋白水溶液和10％的DMSO组成。
实施例3
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，该试剂盒包括保存液、培养液、培养液添加剂、生长因子a、生长因子b、第一组织分解液、第二组织分解液、细胞消化液、洗涤液和冻存液，所述保存液为含有10μg/mL双抗的L-DMEM培养基水溶液，所述双抗为重量份数比为1:1的青霉素和链霉素的混合物，所述培养液为L-DMEM培养基水溶液；所述生长因子a为碱性成纤维细胞生长因子，所述生长因子b为表皮细胞生长因子，所述第一组织分解液为含3mg/mL胶原酶IV型的PBS缓冲液或基础培养基，所述第二组织分解液为含3mg/mL胶原酶V型的PBS缓冲液或基础培养基，所述细胞消化液为含0.5mg/mL胰酶和0.05mg/mL乙二胺四乙酸的PBS缓冲液，所述洗涤液为PBS缓冲液，所述冻存液由40％的L-DMEM培养基水溶液、50％的人血白蛋白水溶液和10％的DMS O组成。
实施例4
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述保存液中还含有30μg/mL的原花青素和15μg/mL的维生素C。
实施例5
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例2不同的是：所述保存液中还含有15μg/mL的原花青素和10μg/mL的维生素C。
实施例6
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例4不同的是：所述保存液中还含有3μg/mL的羟乙基-β-环糊精和10μg/mL的氯化钠。
实施例7
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例5不同的是：所述保存液中还含有1μg/mL的羟乙基-β-环糊精和5μg/mL的氯化钠。
实施例8
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养液添加剂包括如下重量份数的成分：木犀草素1份、小檗碱0.5份和枸橼酸钠5份。
实施例9
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例4不同的是：所述培养液添加剂包括如下重量份数的成分：木犀草素3份、小檗碱1份和枸橼酸钠10份。
实施例10
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例8不同的是：所述培养液添加剂还包括重量份数如下的成分：0.5份的β-胡萝卜素、2份的氯化硒、1份的白藜芦醇、2份的聚甲基丙烯酸甲酯、1.3份的麦芽糖醇和2份的谷氨酰胺。
实施例11
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例9不同的是：所述培养液添加剂还包括重量份数如下的成分：1份的β-胡萝卜素、5份的氯化硒、3份的白藜芦醇、3份的聚甲基丙烯酸甲酯、2.5份的麦芽糖醇和3份的谷氨酰胺。
实施例12
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例2不同的是：所述冻存液内含5μg/mL的聚丙烯葡聚糖、1μg/mL的月桂酰肌氨酸和0.2μg/mL的果胶。
实施例13
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例2不同的是：所述冻存液内含10μg/mL的聚丙烯葡聚糖、3μg/mL的月桂酰肌氨酸和0.5μg/mL的果胶。
实施例14
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例2不同的是：所述第一组织分解液和第二组织分解液内均含有1mg/mL透明质酸酶和0.5mg/mL透明质酸。
实施例15
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，该试剂盒包括保存液、培养液、培养液添加剂、生长因子a、生长因子b、第一组织分解液、第二组织分解液、细胞消化液、洗涤液和冻存液，所述保存液为含有7.5μg/mL双抗、20μg/mL原花青素、12μg/mL维生素C、2μg/mL羟乙基-β-环糊精和7.5μg/mL氯化钠的L-DMEM培养基水溶液，所述双抗为重量份数比为1:1的青霉素和链霉素的混合物，所述培养液为L-DMEM培养基水溶液；所述培养液添加剂包括如下重量份数的成分：木犀草素2份、小檗碱0.75份、枸橼酸钠6份、β-胡萝卜素0.8份、氯化硒3份、白藜芦醇2份、聚甲基丙烯酸甲酯2.5份、麦芽糖醇2份和谷氨酰胺2.5份；所述生长因子a为碱性成纤维细胞生长因子，所述生长因子b为表皮细胞生长因子，所述第一组织分解液为含2mg/mL胶原酶IV型、2mg/mL透明质酸酶和0.4mg/mL透明质酸的PBS缓冲液，所述第二组织分解液为含2mg/mL胶原酶V型、2mg/mL透明质酸酶和0.4mg/mL透明质酸的PBS缓冲液，所述细胞消化液为含0.25mg/mL胰酶和0.02mg/mL乙二胺四乙酸的PBS缓冲液，所述洗涤液为PBS缓冲液，所述冻存液由含7μg/mL聚丙烯葡聚糖、2μg/mL月桂酰肌氨酸和0.4μg/mL果胶且40％的L-DMEM培养基水溶液、50％的人血白蛋白水溶液和10％的DMSO组成。
对照例1
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例2不同的是：所述保存液中还含有30μg/mL的原花青素。
对照例2
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例2不同的是：所述保存液中还含有30μg/mL的原花青素和15μg/mL的维生素E。
对照例3
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例4不同的是：所述保存液中还含有3μg/mL的羟乙基-β-环糊精和10μg/mL的抗坏血酸钠。
对照例4
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养液添加剂包括如下重量份数的成分：小檗碱0.5份和枸橼酸钠5份。
对照例5
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例1不同的是：所述培养液添加剂包括如下重量份数的成分：青霉素1份、小檗碱0.5份和枸橼酸钠5份。
对照例6
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例8不同的是：所述培养液添加剂还包括重量份数如下的成分：2份的氯化硒、1份的白藜芦醇、1.3份的麦芽糖醇和2份的谷氨酰胺。
对照例7
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例8不同的是：所述培养液添加剂还包括重量份数如下的成分：0.5份的β-胡萝卜素、2份的氯化钾、1份的甘露醇、2份的聚甲基丙烯酸甲酯、1.3份的葡萄糖和2份的谷氨酰胺。
对照例8
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例2不同的是：所述冻存液内含5μg/mL的聚丙烯葡聚糖和0.2μg/mL的果胶。
对照例9
一种用于培养胰腺干细胞的试剂盒，与实施例2不同的是：所述冻存液内含5μg/mL的聚丙烯酸树脂、1μg/mL的月桂酰肌氨酸和0.2μg/mL的果胶。
试剂盒中保存液抗菌性能评价
取实施例1、实施例4、实施例15、对照例1-2的试剂盒中的保存液，均在温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置24个月，在试验期间1个月、3个月、6个月、12个月、24个月分别取样一次，检测保存液中细菌、真菌和病毒的感染情况，检验结果见表1。
表1保存液抗菌性能评价结果
其中：“-”表示“没有”，“√”表示“有”。
比较实施例4、实施例15、对照例1-2的试剂盒中的保存液内的细菌、真菌和病毒的感染状况可知，在保存液中添加原花青素和维生素C可以有效提高保存液防止细菌、真菌和病毒感染的能力，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，不但不会提高抗菌效果，还会导致保存液抗细菌、真菌和病毒感染的能力减弱。
试剂盒中保存液对胰腺干细胞存活率评价
将相同数量的胰腺干细胞分别放入实施例1、实施例4、对照例1、对照例2的试剂盒和CN 106047702的试剂盒的保存液中，在4℃下保存240小时，期间分别于第12h、24h、48h、96h、240h时观察胰腺干细胞形态，并用台盼兰染色计数胰腺干细胞存活率，试验结果见表2。
表2保存液对胰腺干细胞存活率的评价结果
其中：A表示细胞分散度好、大小均匀、形态不变、轮廓清晰；
B表示细胞体积变大、大小不等、轮廓模糊、出现椭圆或不规则等异常形态。
上述试验结果表明，采用本发明提供的保存液保存胰腺干细胞的效果与对比试验1-2的保存液和CN106047702的胰腺保存液相比，其保存的胰腺干细胞存活率明显较高，且胰腺干细胞的形态也保持得更好，由此可知本发明提供的的保存液可以有效保持胰腺干细胞活性、提高胰腺干细胞存活率。
试剂盒中保存液稳定性评价
取实施例1、实施例6、实施例15、对照例3的试剂盒，均在温度40℃±2℃下，相对湿度为75％±5％的条件下放置24个月，在试验期间1个月、3个月、6个月、12个月和24个月末分别取样一次，检测保存有胰腺干细胞的保存液的性状和色泽，试验结果见表3。
表3保存液稳定性评价结果
其中：“-”表示没有，“√”表示有。
比较实施例6与实施例15和对照例3的试剂盒内的保存液的稳定性状况可知，在保存液中添加羟乙基-β-环糊精和氯化钠可以有效提高保存液的稳定性，避免保存液产生沉淀、分层和变色等问题，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，不但不会提高稳定性，还会使保存液的稳定性减弱。
试剂盒中全培养液抗菌性能的评价
取实施例8、对照例4和对照例5的试剂盒，分别将其中的培养液、培养基添加剂、生长因子a和生长因子b配置成全培养液，将上述全培养液均在温度-4℃±2℃下，相对湿度为60％±5％的条件下放置24个月后，检测全培养液中细菌数量，检测结果见表4。
表4保存液抗菌性能评价结果
由上述试验结果可知，在培养基添加剂中增加木犀草素、小檗碱和枸橼酸钠可以有效提高全培养基防止细菌的能力，减少其中一个成分，或变化其中一个成分，都会导致配置的全培养夜抗细菌能力减弱。
试剂盒对胰腺干细胞增殖能力的评价
取实施例8、实施例10、对照例6、对照例7和CN106047702的试剂盒，培养胰腺干细胞，采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，分别统计原代、第3代、第6代和第9代活胰腺干细胞的数量，结果见表5。
表5胰腺干细胞体外培养扩增效果评价
由上述结果可以得出，采用本发明提供的培养基添加剂配置的全培养液培养胰腺干细胞的增殖速度明显高于CN106047702的细胞培养液，也优于采用对照例6和对照例7的培养基添加剂配置的全培养液。
试剂盒对胰腺干细胞冻存性能的评价
收集实施例10培养得到的P3代胰腺干细胞，将细胞重悬混匀后，进行细胞计数，将所需的细胞悬液分装至离心管中离心去除上清液，收集细胞沉淀，分别加入1.5mL实施例2、实施例12、对照例8-9的冻存液和CN106047702的冻存液中，并控制细胞数量为1×106个/mL；迅速将冻存液转移至已加好异丙醇的细胞程序降温盒中，放入-80℃超低温冰箱2～3天后，将冻存液转移至液氮保存；一个月后进行细胞复苏，将保存于液氮中的冻存液取出，转移至37℃水浴锅中迅速解冻，用移液管将细胞转入之前预温好的10mL按照本发明公开的方法配置的全培养液中，取0.5mL细胞悬液检测细胞存活率和细胞形态变化情况，结果见表6。
表6试剂盒对胰腺干细胞冻存性能的影响
将实施例2、实施例12的试剂盒的冻存性能与对照例8、对照例9和CN104928238A的试剂盒的冻存性能相比，可以得出本发明提供的试剂盒的冻存性能相对更好，胰腺干细胞复苏后存活率较高，而且更利于胰腺干细胞冻存前后细胞形态的维持和稳定。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。