本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一种生物法制备苯乙酸的方法。
背景技术：
：苯乙酸是一种重要的有机化合物，由于其具有羧基、亚甲基氢和苯环的典型反应，可以生成多种中间体，因此在医药、香料、农药等行业应用广泛，尤其是在青霉素工业盐的生产上具有巨大的需求量。目前，苯乙酸的合成路线多达数十种，其中常见的有：氰化钠法、苯乙烯法、苯乙酮法以及苄基卤化物羰化法。国内苯乙酸的生产主要采用氰化钠法，该方法主要分为两步，首先由氯苄和氰化钠合成苯乙腈，随后通过酸碱水解法将苯乙腈转化为苯乙酸。然而，在苯乙腈水解生产为苯乙酸的过程中，由于需要强酸强碱的参与以及持续保持高温的过程，能耗较高。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种生物法制备苯乙酸的方法，该方法的反应条件温和、能耗低并且原料苯乙腈的转化率较高。为达到上述目的，本发明的解决方案是：一种生物法制备苯乙酸的方法，其包括如下步骤：将苯乙腈分批次加入转化液中，在转化pH为6.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应5‐20个批次，待上一批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后终止反应，得到苯乙酸；其中，苯乙腈所分批次的数目可以为7‐15，优选为8‐12。下一批次的苯乙腈的添加时间为：待上一批次的苯乙腈的转化率达到80％‐95％后加入下一批次，优选为85％‐90％。转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。该转化液的制备方法包括如下步骤：(1)、将E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集静息细胞，并将其悬浮在pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液。每批次所加入的苯乙腈的量可以相等，为0.1‐20mL/g静息细胞，也可以为0.3‐10mL/g静息细胞，还可以为0.5‐1mL/g静息细胞。在步骤(1)中，发酵培养基的组分及含量如下：酵母膏16‐60gL‐1、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。在步骤(2)中的转化液中，静息细胞的浓度大于10gL‐1，优选为10‐100gL‐1，更优选为10‐50gL‐1，最优选为10‐20gL‐1。步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中和Tris‐HCl缓冲液的任意一种。步骤(2)中还添加了苯乙腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1％‐25％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种；步骤(2)中的缓冲液的浓度可以为20‐200mM。助溶剂的体积分数可以为5％‐10％。转化pH可以为7‐9，优选为7‐8.5，更优选为7.95‐8.10。转化温度可以为25‐37℃，优选为30℃。由于采用上述方案，本发明的有益效果是：本发明采用生物法来制备苯乙酸，其先将苯乙腈分为若干体积相等的批次，每隔一定时间将一批次苯乙腈加入转化液中(每批次所加入的苯乙腈的量也相等)，然后在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应，待上一批次的苯乙腈的转化率达到一定程度后再加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到一定程度后终止反应，得到苯乙酸。由上述可知，本发明的方法以苯乙腈为起始原料，利用高密度发酵获得的静息细胞(用于分泌MG腈水解酶)为生物催化剂，并采用具有较高水解活性的MG腈水解酶和苯乙腈的分批次加入工艺相结合来生产苯乙酸，不仅工艺路线简单、反应条件温和以及没有污染，而且能够通过不断控制苯乙腈的加入量来实现苯乙酸的高浓度积累，使单批次反应苯乙酸积累浓度高达1M，苯乙腈的转化率大于99％，从而具有良好的工业化应用前景。另外，本发明的方法成本低廉，能耗也较低。总之，相对于现有技术而言，由MG腈水解酶介导的苯乙腈水解为苯乙酸的过程反应所需条件温和，能够有效地降低能耗，对环境友好，成为苯乙酸生产的一条有效取代途径。附图说明图1为本发明的静息细胞催化水解苯乙腈制备苯乙酸反应进程曲线图。具体实施方式本发明公开了一种生物法制备苯乙酸的方法，该方法包括如下步骤：(1)、将用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心以得到静息细胞；(2)、收集步骤(1)所得的静息细胞，将该静息细胞悬浮于pH为6.0‐9.0的缓冲液中，得到转化液，故该转化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌；(3)、将苯乙腈分批次加入转化液中，在pH为6.0‐9.0和温度为20‐40℃的条件下反应5‐20个批次，待上一批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后终止反应，得到苯乙酸。其中，在步骤(1)中，MG腈水解酶是由BCJ2315腈水解酶突变而来的，BCJ2315腈水解酶来自BurkholderiacenocepaciaJ2315。用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌详见Wang等人在AppliedandEnvironmentMicrobiology,2015,81:24公开的非专利文献《ProteinEngineeringofaNitrilasefromBurkholderiacenocepaciaJ2315forEfficientandEnantioselectiveProductionof(R)‐ο‐ChloromandelicAcid》的记载。步骤(1)中的发酵培养基含有以下组分并且每种组分的含量(如表1所示)如下：酵母膏16‐60g/L、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。在步骤(1)中，还可以根据实际情况添加发酵补料培养基(如表2所示)。在步骤(2)所得的转化液中，静息细胞的浓度应大于10gL‐1，优选为10‐100gL‐1，更优选为10‐50gL‐1，最优选为10‐20gL‐1。催化反应所需的MG腈水解酶是通过静息细胞分泌的，所以静息细胞的浓度影响的是MG腈水解酶的浓度。而MG腈水解酶的浓度越高则相对的催化效率越高，即单位时间内苯乙腈的转化量越高。步骤(2)中的缓冲液为NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液中、Tris‐HCl缓冲液或其他任何常用pH缓冲液中的任意一种。步骤(2)中除了添加缓冲液外，还可以添加苯乙腈的助溶剂，助溶剂为体积分数为1％‐25％的甲醇、乙醇、异丙醇和正己烷中的任意一种或几种。该缓冲液的浓度可以为20‐200mM，助溶剂的添加量可以为5％‐10％(v/v)。在步骤(3)中，每批次的苯乙腈的反应条件均相同，均在转化pH为6.0‐9.0和转化温度为20‐40℃的条件下反应。当前一个批次的反应结束后，要重新检测pH值和温度并判断其是否在上述范围内，若不在，则需要将反应条件重新调整为初始反应条件，即pH为6.0‐9.0中的任意一个数值和温度为20‐40℃中的任意一个数值。例如，对转化时pH的调节可以采用氨水、NaOH溶液或者Na2CO3溶液进行。其中，氨水的浓度可以为1M到纯氨水，优选为2‐10M，更优选为4‐8M，最优选为6M。转化时pH和温度直接对MG腈水解酶的活力即MG腈水解酶的催化效率产生影响。酶的活力在不同的转化温度或者不同的转化pH条件下是不同的。本发明选择的转化温度与转化pH适于酶的最佳催化效率的发挥。在步骤(3)中，苯乙腈所分成的批次的数目还可以为7‐15，优选为8‐12。在步骤(3)中，每批次的苯乙腈的加入需要在前一批次苯乙腈反应达到一定程度之后。例如，前一批次的苯乙腈的转化率达到70％‐100％后加入下一批次，优选为80％‐95％，更优选为85％‐90％。在步骤(3)中，每批次所加入的苯乙腈的量相等，为0.1‐20mL/g静息细胞，优选为0.3‐10mL/g静息细胞，更优选为0.5‐1mL/g静息细胞。在整个反应过程中，MG腈水解酶的催化效率由于受到苯乙腈毒性的影响，是逐渐降低的，从而导致每批次苯乙腈的转化效率是逐渐降低的，因此，上一批次的苯乙腈必须在达到一定的转化率后再加入下一批次的苯乙腈，这样能够促使反应朝着终产物苯乙酸的方向移动。随着苯乙腈加入批次数目的增加，每批次苯乙腈的加入量可以适当降低，或者每批次苯乙腈的反应时间可以适当增加。在本发明的一个优选实施例中，通过采用适当延长每批次的反应时间的方式，已经达到较高的转化率。作为本发明的一个优选实施例，静息细胞催化水解苯乙腈制备苯乙酸反应进程曲线图如图1所示。图1的纵坐标表示浓度，横坐标表示时间，■图例代表苯乙腈的浓度变化，●图例代表苯乙酸的浓度积累。由图1可知，苯乙酸生成量能够达到1M，由于反应过程中向转化液中添加苯乙腈以及氨水造成的反应液体积的膨胀，实际检测浓度会低于1M。由此可知，本发明的制备苯乙酸的方法反应转化率高，单批次浓度积累高，生产安全简便，无任何副产品，不污染环境。本发明的测定MG腈水解酶活性的方法和下列实施例中酶活力的单位特定义如下：在pH8.0的50mM的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲体系中，以100mM的苯乙腈为底物，20mg/ml(湿重)的静息细胞浓度下，30℃下震荡30min，2M盐酸终止反应，HPLC方法检测苯乙腈转化情况。若苯乙腈转化完全，则认为该批次细胞酶活力合格，可用于进行后续苯乙酸的制备。以下结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例本实施例公开了一种生物法制备苯乙酸的方法，其包括如下步骤：(1)、取出在‐80℃下保藏的E.coli工程菌，在LB琼脂平板上进行接种，之后于37℃培养过夜；(2)、挑取LB琼脂平板上的单克隆菌落，并将其接种于LB液体培养基中，之后于37℃培养过夜；(3)、从过夜培养后的LB液体培养基中取适量菌液，接种于LB液体培养基中，于37℃培养8h，之后接种于发酵培养基(如表1所示，最终pH值为7)中，于37℃培养至OD600为20，然后加入适量IPTG，降温至30℃继续培养16h，离心收集菌体(取沉淀物)，用pH为8.0的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液洗涤两次，得到静息细胞；在37℃培养的过程中可以视情况添加发酵补料培养基。发酵补料培养基是为了提高静息细胞的发酵浓度，而不断的向发酵培养基中补加的营养成分。理论上当发酵培养基当中的碳源消耗至较低水平时即开始添加，实际操作过程中则通过观察发酵液的pH变化情况，当pH开始升高(一般反应3‐4h)时则开始添加发酵补料培养基(如表2所示)。(4)、取20g静息细胞加入到1L100mMpH为8.0的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中，然后加入100mL乙醇，搅拌均匀，使静息细胞悬浮在pH为6.0‐9.0的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液中，得到转化液；(5)、将苯乙腈分为5个批次，先将第一批次加入转化液中，加入量为11.5ml/L，在pH为7.95‐8.10和温度为30℃的条件下反应，待该批次的苯乙腈的转化率达到100％后加入下一批次，并视情况重新调节pH为7.95‐8.10和温度为30℃，以此类推，直至加入第五批次，待第五批次的苯乙腈的转化率达到100％后终止反应，得到苯乙酸。表1发酵培养基的组分含量表组分含量酵母膏16‐60gL‐1蛋白胨12‐80gL‐1甘油1‐500mlL‐1K2HPO424.75gL‐1KH2PO43.47gL‐1MgSO41gL‐1表2发酵补料培养基的组分含量表组分含量酵母膏60gL‐1蛋白胨80gL‐1甘油500ml上述的对实施例的描述是为便于该
技术领域：
的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3