科尔维尔氏菌属嗜冷新菌种及其培养方法与应用与流程

本发明涉及海洋微生物，尤其是涉及科尔维尔氏菌属嗜冷新菌种及其培养方法与应用。

背景技术：

科尔维尔氏菌属由Deming等人在1988年提出建立的，模式菌种为Colwellia psychrerythraea。目前科尔维尔氏菌属共包括14个种，全部分离自海水环境。菌属特征为杆状或曲杆状细胞，革兰氏阴性，不产生孢子，具运动性，兼性厌氧，大部分生活于低温海水环境。

多相分类的概念最初由Colwell于1970年提出，是指利用微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合起来研究微生物分类和系统进化的过程。其中DNA同源性分析是确定正确的分类地位的最直接的方法，而DNA-DNA杂交可以在总体水平上研究微生物间的关系，用于种水平上的分类学研究。1987年，国际系统细菌学委员会规定，DNA同源性≥70％为细菌种的界限。

低温酶由于其低温催化活性以及热不稳定性在工业应用上具有中温酶无法比拟的优势：可以通过温和的热处理使低温酶失活，快速而经济地终止反应；生产过程在低温或室温下进行，无需加热和冷却，可以降低成本。在食品、医药以及化工等行业较中温酶具有较大的优越性。科尔维尔菌属中大部分微生物都为嗜冷微生物，而且可以产生丰富的低温蛋白酶、淀粉酶和酯酶，在食品、医疗以及化工等行业显示出很好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1。

本发明的目的之二在于提供科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的培养方法。

本发明的目的之三在于提供科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的16S rRNA基因序列。

本发明的目的之四在于提供科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1在液体发酵生产低温蛋白酶、酯酶和淀粉酶中的应用。

所述科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1，已于2016年10月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2016597。

所述科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的培养方法如下：

将科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1接种于培养基中，在培养温度4～25℃，pH 6.4～9.7，质量百分浓度为1％～6％的NaCl条件下进行培养。

所述培养基可采用海洋细菌常规培养基，优选2216E培养基。

所述培养温度优选10～13℃，pH优选7.0～9.7，NaCl质量百分浓度优选2％～3％。

所述培养可在需氧条件下进行，培养可以是各种微生物的培养方式，可采用液体培养、固体培养、半固体培养、摇床培养或发酵罐发酵。

所述培养的接种量为常规，按体积百分比优选1％～2％。

所述科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的16S rRNA基因序列为SEQ所示的碱基序列。

所述科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1可在液体发酵生产低温蛋白酶、酯酶和淀粉酶中应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂盒及原料均市售可得。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了科尔维尔氏菌属的一个嗜冷新菌种，该菌株的分类地位是Colwellia sp.。该新种的发现和其潜在的利用价值丰富了我们的可利用海洋微生物资源，对以后更好地利用海洋细菌有一定的贡献。本发明的科尔维尔氏菌，可以提取低温蛋白酶、酯酶和淀粉酶，在食品、医药以及化工等行业将具有广泛应用。

附图说明

图1为科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1透射电镜照片。

图2为科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1在温度10℃、13℃、16℃下的生长曲线。

图3为科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1在温度19℃、22℃、25℃、28℃下的生长曲线。

图4为科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1 16S rRNA基因的系统发育进化树。

图5为科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1对干酪素与淀粉的降解。a，科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1降解干酪素产生透明圈；b，科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1降解淀粉，革兰氏碘液染色出现透明圈。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明局限在所述的实例范围之内，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件和方法，或按照商品说明书。

实施例1、本发明科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的分离纯化

取第六次北极考察所采集海水沉积物样品，利用稀释涂平板法，将其稀释后涂布于2216E固体培养基平板上，置于10℃培养箱培养5～7天，挑取单菌落，然后划线纯化。

实施例2、本发明科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的表观特征

1、菌落特征

取科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的单菌落，转接到2216E固体培养基上，于10℃恒温培养箱中培养60h，观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结果显示，科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1在2216E固体培养基上形成边缘整齐，光滑，湿润，不透明，白色的菌落，直径约为2mm。

2、细胞形态学特征

细胞为杆状，具端生鞭毛，革兰氏染色阴性，单生(如图1所示)。

实施例3、本发明新科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的生长特性

挑取在2216E固体培养基上培养60h的新鲜培养物，接种到2216E液体培养基，13℃摇床培养大约24h，作为种子。

1、生长温度

将所培养的科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1种子按1％接种量转接至新鲜的2216E液体培养基中并混匀。置于10℃、13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃摇床培养，每个温度梯度做三个平行，分别测定生长曲线。4℃下的生长情况通过固体平板上的培养来检测，将科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1接种至2216E固体培养基，置于4℃培养箱中培养，两天后有明显的菌落出现。以上显示科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的生长温度范围为4～25℃，最适生长温度约为13℃(如图2和3所示)。

2、NaCl耐受性

将所培养的科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1种子按1％接种量转接NaCl浓度分别为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％和8％的2216E培养基，13℃下摇床培养，并分别测定其生长的最大生物量，结果显示科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1可以在NaCl浓度范围为1％～6％的培养基中生长，最适生长NaCl浓度为2％～3％，没有NaCl的情况下检测不到生长。

3、生长pH范围

将2216E培养基用1M HCl和1M NaOH分别调整pH至3.4、4.4、5.4、6.4、7.0、7.8、8.8、9.8和10.8，并将所培养的NB09701种子按1％接种量接入，13℃下摇床培养，检测其生长的最大生物量，结果显示科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1生长的pH范围为6.4～9.8，最适生长pH为7.8～9.8。

实施例4、本发明科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的生理生化特性

利用API ZYM、API20NE和API20E鉴定系统以及常规的生理生化测定方法对科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1以及相关的同属菌株进行生理生化性质测定。

科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的主要生理生化特征：好氧生长，接触酶阳性，可以降解明胶、干酪素、淀粉、Tween 20，40，60，80；碱性磷酸盐酶、酸性磷酸酶、酯酶和白氨酸芳胺酶阳性，类脂酯酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、β-岩藻糖苷酶阴性；脲酶阳性，可以还原硝酸盐至亚硝酸盐，不产生吲哚，VP反应阴性。

实施例5、本发明科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定以及系统发育特征

1、提取基因组DNA

将科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1以1％接种量接种至2216E培养基，于13℃下进行摇床培养，收集生长至对数中后期的菌体，用革兰氏阴性细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)按照操作说明提取基因组DNA。

2、16S rRNA基因的PCR扩增及测序

以科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的基因组DNA为模板，27F与1492R为引物通过PCR扩增16S rRNA基因。27F与1492R的碱基序列分别为5’-AGAGTTTGCTCMTGGCTCAG-3’，5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR产物连接于载体pMD-18T后委托生工生物工程有限公司进行全长序列的测定，其16S rRNA基因的核苷酸如SEQ所示。

3、16S rRNA基因的系统发育特征

将科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的16S rRNA基因序列在Genbank以及EzTaxon数据库中进行同源比对分析，其序列与Colwellia aestuarii的16S rRNA基因序列最接近，序列相似性为97.8％。

将上述的16S rRNA基因序列使用软件MEGA绘制进化关系树，采用neighbor-joining计算，并以maximum-parsimony和maximum-likelihood进行验证计算，结果如图4所示。由图4可见，通过对16S rRNA基因的进化树分析，科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1可以归入到Colwellia菌属，与Colwellia aestuarii，Colwellia polaris，Colwellia chukchiensis亲缘关系最近。科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1与Colwellia aestuarii，Colwellia polaris，Colwellia chukchiensis的16s rRNA基因序列一致性分别为97.8％，97.2％，96.8％。

实施例6、本发明科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的脂肪酸含量特征

科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的总脂肪酸含量测定，以其近缘菌株Colwellia aestuarii，Colwellia polaris和Colwellia chukchiensis作为参比对照。

配制如下溶液：

试剂1：45g NaOH溶于150ml甲醇以及150ml双蒸水；

试剂2：325ml盐酸与275ml甲醇混合均匀；

试剂3，200ml正己烷与200ml甲基叔丁基醚混合均匀；

试剂4：10.8g NaOH溶于900ml双蒸水；

试剂5：饱和NaCl溶液。

具体步骤如下：

1)将科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1接种至2216E固体培养基平板上，13℃避光培养60h左右，挑取0.2g菌体；

2)加入1mL试剂1于测定管内，充入氮气5-10s后将管盖拧紧，涡旋振荡20s；将测定管放入超声破碎仪内超声处理10min，再充分振荡后放入100℃水浴锅内加热处理25min；每隔5min取出振荡5～10s；处理结束后放入凉水中快速冷却；

3)在测定管内加入2ml试剂2，迅速将管盖拧紧，涡旋振荡20s；80℃水浴10min；处理结束后放入凉水中快速冷却；

4)在测定管内加入1.25ml的试剂3，将管盖拧紧，涡旋振荡10min，使萃取更充分，静置3～5min待溶液分层后，用干燥洁净的玻璃吸管将下层溶液吸取掉，保留上层液相；

5)在上述溶液中加入3ml试剂4和500μl试剂5，拧紧管盖，涡旋振荡3～5min，静置10～15min使溶液分层，吸取约2/3的上清得脂肪酸样品。

HP 6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HP CHEMSTATION ver A 5.01)；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33mm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每分钟5℃升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2ml；检测器温度300℃，氢气流速30ml/min，空气流速216ml/min，补充气(氮气)流速30ml/min。

结果显示，科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的主要细胞脂肪酸为不饱和脂肪酸C_16:1w7c or C_16:1w6c，C_17:1w8c，C_18:1w7c以及十六碳饱和脂肪酸C_16:0，含量分别为40.71％，10.91％，9.55％，15.98％。符合Colwellia菌属主要的脂肪酸类型，而且同近缘菌株在脂肪酸种类与含量上均有一定差异，由此可以推断科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1为不同于其近缘菌株的一个新种。

实施例7、本发明科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1与其近缘菌株的DNA-DNA杂交试验

参考16S rRNA的比对结果，对科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1与遗传亲缘关系最相近(16S rRNA基因序列相似性大于97％)的种Colwellia aestuarii和Colwellia polaris进行DNA-DNA杂交试验。

采用液相复性率方法，所用仪器为Cary Series UV-Vi Spectrophotometer。温度控制用Peltier temperature-controlling programmer数字控温程序。

结果显示科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1与Colwellia aestuarii和Colwellia polaris的DNA相关性分别为48.5％，40.2％，低于国际系统细菌学委员会在1987年关于DNA相关性70％为细菌种的界限规定。结合实施例2～6的数据，可以判定科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1为Colwellia菌属的一个新菌种，科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的分类地位是Colwellia sp.。

实施例8、本发明科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1的应用价值

经生理生化性质测定，科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1在低温(10℃)下可以降解干酪素产生透明圈，降解淀粉，经革兰氏碘液染色出现透明圈(如图5所示)，说明其具有低温蛋白酶和淀粉酶活性。经API ZYM检定系统测定，科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1低温(10℃)下酯酶(C4)活性以及对明胶的降解呈阳性，说明其具有低温酯酶和蛋白酶的活性。该嗜冷菌来源的低温蛋白酶、酯酶和淀粉酶将在食品、医药和化工等行业显示出良好的应用前景。

本发明所述科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1分离自北极地区白令海域海水沉积物，保藏号为CCTCC M 2016597。依据多相分类学方法，该菌株是科尔维尔氏菌属的一个新种，其分类地位是Colwellia sp.。本发明所提供的科尔维尔菌属(Colwellia sp.)NB097-1低温生长(10～13℃)，易培养。该新种的发现及其潜在应用价值丰富了可利用的低温微生物资源。本发明所提供的科尔维尔氏菌嗜冷新菌种具有蛋白酶、酯酶和淀粉酶活性，为食品、医药以及化工等行业提供了产低温蛋白酶、酯酶和淀粉酶的菌种资源。

序列表

<110> 国家海洋局第三海洋研究所

<120> 科尔维尔氏菌属嗜冷新菌种及其培养方法与应用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1537

<212> DNA

<213> 科尔维尔氏菌种（Colwellia sp.）

<400> 1

gagtttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggcaggct taacacatgc aagtcgagcg 60

gtaacagaga tagcttgcta tctgctgaca agcggcggac gggtgagtaa tgcttgggaa 120

tatgcctttg agtgggggac aacagttgga aacgactgct aataccgcat aacgtctacg 180

gaccaaaggg ggggacgctt cggcacctct cgctcattga ttagcccaag tgagattagc 240

tagttggtaa ggtaatggct taccaaggcg acgatctcta gctggtttga gaggatgatc 300

agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt 360

gcacaatggg cgaaagcctg atgcagccat gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg 420

taaagcactt tcagcgagga ggaaaggtta gtagttaata actgctagct gtgacgttac 480

tcgcagaaga agcaccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga ggggtgcaag 540

cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt gcgtaggtgg tttgttaagc aagatgtgaa 600

agccctgggc tcaacctggg aactgcattt tgaactggca agctagagtt ttgtagaggg 660

tagtggaatt tccagtgtag cggtgaaatg cgtagagatt ggaaggaaca tcagtggcga 720

aggcggctac ctggacaaag actgacactg aggcacgaaa gcgtggggag caaacaggat 780

tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcaacta gccgtctgta gacttgatct 840

gtgggtggcg tagctaacgc gctaagttga ccgcctgggg agtacggccg caaggttaaa 900

actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgca 960

acgcgaagaa ccttaccatc ccttgacatc cagagaagag actagagata gacttgtgcc 1020

ttcgggaact ctgtgacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgttgt gaaatgttgg 1080

gttaagtccc gcaacgagcg caacccctat ccttatttgc cagcgagtta tgtcgggaac 1140

tctaaggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgg 1200

cccttacggg atgggctaca cacgtgctac aatggcaagt acagagggca gcaataccgc 1260

gaggtggagc gaatcccaca aagcttgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc 1320

catgaagtcg gaatcgctag taatcgtaga tcagaatgct acggtgaata cgttcccggg 1380

ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagtg gctagtttaa 1440

cccttcgggg aggacggtca ccactttgtg attcatgact ggggtgaagt cgtaacaagg 1500

taaccctagg ggaacctggg gttggatcac ctcctta 1537