1.一种基于高通量测序同时检测T细胞(TCR)和B细胞(BCR)免疫组库的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管;
(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077进行外周血单核细胞(PBMC)的分离;
(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA,所用试剂为RNAzol RT;
(4)RNA反转录成cDNA,并同时在cDNA 5’端添加接头;
(5)PCR1:通过1条上游引物、2条或2条以上的下游引物的方式扩增重组TCR和BCR cDNA;
(6)PCR2和纯化:为PCR1产物添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签,同时扩增,并利用磁珠进行DNA纯化;
(7)进行高通量测序:将所得的cDNA文库通过Illumina MiSeq平台进行测序,测序模式为PE300,文库变性浓度为2nM,上机浓度为20pM,并通过生物信息学分析高通量测序结果。
2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法,其特征在于:所述步骤(4)中接头为XCR 5’Oligo接头,其碱基序列为:5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG 3’。
3.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的方法,其特征在于:所述步骤(5)中单对引物及引物序列为。
4.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法,其特征在于:所述步骤(四)中,具体步骤如下:
按照以下比例混合每一个RNA样本:
试剂 体积1X(μL),
RNA 8,
XCR 3’Oligo(dT)引物(10μM) 1,
孵化于72℃ 3分钟,接着4℃ 1分钟;
按照以下比例制备PCR反应缓冲液:
5.根据权利要求1或2所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法,其特征在于:所述混合PCR反应缓存液与RNA样本,按照下面反应程序开始cDNA反转录:
42℃ 60分钟;70℃ 10分钟;4℃永久。
6.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法,其特征在于:所述步骤(五)中,按照以下比例制备反应体系:
7.根据权利要求1或4中所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法,其特征在于:所述步骤(五)中,PCR 1反应程序为:
95℃ 3分钟;95℃ 30秒;65℃ 1分钟,25循环;72℃ 1分钟;4℃永久。
8.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法,其特征在于:所述步骤(六)中,按照以下比例制备反应体系:
9.根据权利要求1或6所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法,其特征在于:所述步骤(六)中,PCR 2反应程序为:
94℃ 3分钟;94℃ 30秒;55℃ 30秒,18循环;72℃ 20分钟,72℃ 1分钟,4℃永久。
10.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法,其特征在于:所述步骤(六)中,具体纯化步骤如下:
(1)添加80μL AMPure XP Beads进入PCR2反应产物,混匀;
(2)在室温孵化10分钟;
(3)放置磁珠-PCR2产物混合物试管于磁力架上,等待所有磁珠吸附于磁力架上后,用移液器吸去所有上清液,丢弃;
(4)添加150μL 70%乙醇于磁珠上,孵化30秒,用移液器吸去所有上清液,丢弃;
(5)重复第四步2次;
(6)打开试管盖,等待5分钟,待磁珠风干,没有任何乙醇残留于试管内;
(7)把试管从磁力架上取下,并添加50μL去核酸酶水,利用移液器吹打悬浮磁珠;
(8)把试管放回磁力架,等待所有磁珠都吸附于磁力架后,转移上清液于新的试管中,上清液里就包含了纯化之后的PCR2产物。