一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法与流程

本发明属于分子生物学检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法。
背景技术：
：T、B细胞基因座上大量的V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)基因片段在T、B细胞受体的形成中会产生各种多样性重组。这种V-D-J基因的重组赋予了每一种T、B细胞自己独特的T、B细胞受体(TCR、BCR)，从而使得每一个TCR和BCR的序列能有效的成为一个T、B细胞克隆的唯一生物标志物。由于TCR和BCR基因的最大特点是V、D、J基因片段的随机重组，所以，针对未知基因序列，很难设计一个上游引物用于识别TCR、BCR基因的5’端序列，所以也无法利用PCR技术扩增TCR、BCR基因和测序。而另外一种TCR测序方法，多重引物PCR的方法，只能测序TCR基因中的部分序列信息，这样使得测序基因信息不完整。另外，多重引物PCR方法的引物是根据已知V，J基因设计的，这种测序结果只局限于野生型的已知基因。但在癌症病人中，癌细胞的基因突变是很常见的，如果白血病癌细胞的BCR或TCR产生了突变，那么已知序列的引物就有可能无法识别突变后的基因，对检测结果来说，就容易造成假阴性。并且，多重引物PCR的免疫组库测序方法，仅仅对TCR或者BCR测序，就已经需要几十对的引物，如果同时检测TCR和BCR的话，庞大的引物数量会让整个PCR扩增的效率和特异性变得很差。所以，目前还没有一个技术可以在一次实验操作中同时检测TCR和BCR，利用我们的方法(单对引物法)可以同时检测多个样本的TCR和BCR，节约实验时间和试剂、人工成本。该技术可以应用在免疫基因组学的研究中，不仅能够检测淋巴恶性肿瘤治疗后的微小残留病，还能够评判HSC移植后的免疫重建、食物过敏、免疫性疾病的检测等等。技术实现要素：为了解决以上技术问题，本发明提供一种基于高通量测序同时构建T细胞受体和B细胞受体文库构建的cDNA接头和单对引物，以及文库制备方法，通过从接头的上游引物到C区的下游引物，同时获得TCR和BCR基因序列的全长信息。解决以上技术问题的一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；(2)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077(美国Sigma公司#10771)进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；淋巴细胞分离液的作用在于可以从全血里分离淋巴细胞，因为T细胞为我们检测对象，T细胞属于淋巴细胞的一种，分离后的细胞群所获得的RNA是除去了红细胞、血小板等细胞的RNA的。所以建库使用的总RNA内含T细胞RNA模板纯度更高。(3)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzolRT(美国MRC公司#RN190)；Trizol的方法提取RNA,步骤如下：收获细胞，转移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000g×10min，弃上清。加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500g×5min，弃上清。自然风干，加入50ul的DEPCH2O溶解，得到淋巴细胞总RNA。(4)RNA反转录成cDNA，并同时在cDNA5’端添加接头,用于后面PCR扩增时5’端引物结合；在反转录时，同时添加接头，可以最小化RNA在多步反应过程中的丢失。RNA在操作中稳定性极差，非常容易降解，少量的步骤可以最大程度上减少降解，同时也节约了可用于扩增的cDNA制备时间。接头即cDNA5‘端的核酸接头，XCR5’Oligo接头。(5)PCR1:通过1条上游引物、2条或2条以上的下游引物的方式扩增重组TCR和BCRcDNA；(6)PCR2和纯化：为PCR1产物(扩增后的TCR和BCR序列)添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时为增加更多的上机基因量再次扩增；PCR反应结束后，利用磁珠进行DNA纯化。PCR产物一般都含有过量的引物、TaqDNA酶及dNTP。这些成分的存在将直接影响到后续的文库质检、测序反应等过程，纯化可以去除这些影响后续实验的副产物。同时，纯化的过程也是一个片段大小筛选的过程，本发明中的DNA片段是在700bp左右，可利用不同体积的磁珠与PCR产物混合，磁珠/DNA不同的体积比例可以吸附不同大小的片段，利用上述磁珠体积，可以成功去掉PCR扩增时的错误(误差)片段和引物双聚体，让我们的测序上机文库只有我们的测序目标DNA片段，使得测序结果更加准确，减少误差。如图3所示，通过文库质检只发现了一个片段的峰。(7)进行高通量测序：将所得的cDNA文库通过IlluminaMiSeq平台进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果；通过本发明的XCR5’端接头、PCR引物以及测序文库制备方法获得的上百万条的TCR和BCR序列，该技术可以应用在免疫基因组学的研究中，不仅能够检测淋巴恶性肿瘤治疗后的微小残留病，还能够评判HSC移植后的免疫重建、食物过敏、免疫性疾病的检测等等。所述步骤(4)中接头为XCR5’Oligo接头，其碱基序列为：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG3’。所述步骤(5)中1条上游引物和2条下游引物及引物序列为：本发明中所述步骤(4)中按照以下比例混合每一个RNA样本：试剂体积1X(μL)，RNA8，XCR3’Oligo(dT)引物(10μM)1，孵化于72℃3分钟，接着4℃1分钟。按照以下比例制备PCR反应缓冲液混合PCR反应缓存液与RNA样本，按照下面反应程序开始cDNA反转录42℃60分钟70℃10分钟4℃永久反应结束后，就可获得已在5’端添加了接头的总cDNA(如图1)。所述步骤(5)中具体步骤如下：按照以下比例制备反应体系：按照上述的反应体系制备反应体系，混合上述5样试剂于PCR试管，混匀，离心数秒，把管壁上的液体残留离心于管底。放置试管于PCR扩增仪中，按照上述反应程序开始运行。所述步骤(5)中PCR1反应程序为:95℃3分钟；95℃30秒；65℃1分钟，25循环；72℃1分钟；4℃永久。所述步骤(6)中具体步骤如下：按照以下比例制备反应体系：所述步骤(6)中PCR2反应程序为:94℃3分钟；94℃30秒；55℃30秒，18循环；72℃20分钟，72℃1分钟，4℃永久。所述步骤(6)中具体纯化步骤如下：(1)添加80μLAMPureXPBeads进入PCR2反应产物，混匀。(2)在室温孵化10分钟。(3)放置磁珠-PCR2产物混合物试管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丢弃。(4)添加150μL70％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丢弃。(5)重复第四步2次。(6)打开试管盖，等待5分钟，待磁珠风干，没有任何乙醇残留于试管内。(7)把试管从磁力架上取下，并添加50μL去核酸酶水，利用移液器吹打悬浮磁珠。(8)把试管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，转移上清液于新的试管中。上清液里就包含了纯化之后的PCR2产物。本发明基于高通量测序技术，TCR、BCR测序单对引物的文库构建方法，通过在获得血液PBMCRNA后，在进行RNA至cDNA反转录的同时，给cDNA的5’端添加一个接头，从而通过这个已知序列的接头设计扩增上游引物，再配合TCR基因和BCR基因3’端C区基因(不变区)设计下游引物，从而达到扩增整个TCR和BCR序列全长基因的目的。因此，提供一种基于高通量测序技术同时构建T细胞受体和B细胞受体检测手段是十分有意义的，有效的节约实验时间和试剂、人工成本。本发明提供基于高通量测序同时构建TCR和BCR文库的接头，引物及方法的有益效果为：同时获得了人TCR(Alpha链或Beta链)和BCR(Heavy链或Light链)全基因序列；本发明在高通量测序平台的基础上，通过同时对人TCR和BCR基因测序结果进行全面的生物信息学分析，获得了TCR和BCR在VDJ重组时的基因偏好性，VDJ基因组合信息，免疫组克隆种类信息，免疫组多样性信息，免疫组的所有CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列和氨基酸序列信息，基因上的突变信息，等。正是这些因素形成数量庞大且种类多样的免疫组库。附图说明图1本发明中RNA反转录cDNA示意图图2为本发明中利用两次PCR扩增TCR和BCRcDNA并添加测序上机接头示意图图3为本发明中测序文库质检结果。图4为本发明中TCR测序结果进行生物信息学分析比对，找出每条序列的信息(部分)图5为本发明中BCR测序结果进行生物信息学分析比对，找出每条序列的信息(部分)具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述:实施例1一种利用高通量测序同时检测T细胞受体和B细胞受体的方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)获取人血液样本10mL于EDTA抗凝管；(二)利用淋巴细胞分离液Ficoll-1077(美国Sigma公司#10771)进行外周血单核细胞(PBMC)的分离；(三)利用Trizol的方法提取PBMC的总RNA，所用试剂为RNAzolRT(美国MRC公司#RN190)；(四)利用2.0Fluorometer(美国ThermoFisherScientific公司#Q32866)，配合RNAHSAssayKit试剂盒(美国ThermoFisherScientific公司#Q32852)测定RNA浓度，然后用于反转录RNA；(五)RNA反转录成cDNA，并在cDNA5’端添加接头用于后面PCR扩增时5’端引物结合，具体步骤如下，所使用到的试剂：XCR3’Oligo(dT)引物(10μM)5X反转录缓冲液(250mMTris-HCl(pH8.3),375mMKCl,15mMMgCl2)二硫苏糖醇，DTT(20mM)美国ThermoScientific#R0861dNTPMix(10mM)美国Invitrogen#18427088RNAseOut(40U/μL)美国Invitrogen#10777019XCR5’Oligo接头(10μM)SuperscriptIIRT(200U/μL)美国Invitrogen#18064022按照以下比例混合每一个RNA样本：孵化于72℃3分钟，接着4℃1分钟。按照以下比例制备PCR反应缓冲液试剂体积1X(μL)5X反转录缓冲液3.5DTT(20mM)1dNTP(10mM)1RNAseOut1XCR5’Oligo接头(10μM)1SuperscriptIIRT1混合PCR反应缓存液与RNA样本，按照下面反应程序开始RNA反转录42℃60分钟70℃10分钟4℃永久反应结束后，就可获得已在5’端添加了接头的总cDNA(如图1)(六)PCR1。通过“单对”或1对多引物的方式，或通过1条上游引物、2条或2条以上的下游引物同时扩增重组TCR和BCRcDNA，具体步骤如下：所使用到的试剂：Q5High-Fidelity2XMasterMix(美国NEB#M0492L)XCR5’端接头引物(上游引物)TCRC区引物(下游引物)BCRC区引物(下游引物)去核酸酶水(美国ThermoScientificAM9914G)按照以下比例制备反应体系：PCR1反应程序为:(七)PCR2(标签PCR)。为PCR1产物(扩增后的TCR与BCR序列)添加Illumina高通量测序仪的上机接头和标签，同时为增加更多的上机基因量再次扩增。具体步骤如下：所使用到的试剂：Q5High-Fidelity2XMasterMix(美国NEB#M0492L)标签上游引物标签TCR下游引物标签BCR下游引物去核酸酶水(美国ThermoScientificAM9914G)按照以下比例制备反应体系：PCR2反应程序为:(八)PCR2产物纯化。上述PCR反应结束后，利用磁珠进行DNA纯化，具体步骤如下：所使用到的试剂：AgencourtAMPureXPBeads(美国Beckman#A63882)具体纯化步骤如下：1.添加80μLAMPureXPBeads进入PCR2反应产物，混匀。2.在室温孵化10分钟。3.放置磁珠-PCR2产物混合物试管于磁力架上，等待所有磁珠吸附于磁力架上后，用移液器吸去所有上清液，丢弃。4.添加150μL75％乙醇于磁珠上，孵化30秒，用移液器吸去所有上清液，丢弃。5.重复第四步2次。6.打开试管盖，等待5分钟，待磁珠风干，没有任何乙醇残留于试管内。7.把试管从磁力架上取下，并添加50μL去核酸酶水，利用移液器吹打悬浮磁珠。8.把试管放回磁力架，等待所有磁珠都吸附于磁力架后，转移上清液于新的试管中。上清液里就包含了纯化之后的PCR2产物。(九)文库纯化结束后，利用Agilent2100Bioanalyzer(美国Agilent公司#G2939AA)检测文库的纯度和大小，使用的试剂盒是AgilentDNA1000Kit(美国Agilent公司#5067-1504)，检测结果如图3所示，文库大小在768bp左右的范围，并且文库纯度相当高，并未见到其他非特异性扩增序列。(十)利用2.0Fluorometer(美国ThermoFisherScientific公司#Q32866)，配合dsDNAHSAssayKit试剂盒(美国ThermoFisherScientific公司#Q32851)测定DNA文库浓度，并送公司进行高通量测序。将所得的cDNA文库通过Illumina平台(美国Illumina公司)进行测序，测序模式为PE300，文库变性浓度为2nM，上机浓度为20pM，并通过生物信息学分析高通量测序结果。材料及试剂说明健康自愿受试者知情同意。非特殊说明，本发明采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。具体地，本发明反转录5’端接头序列、引物序列如下(5’-3’)：反转录步骤XCR3’Oligo(dT)引物：5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA3’XCR5’Oligo接头：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG3’PCR1步骤XCR5’端接头引物：5’GTCTCGTGGGCTGGGCGATGTGTATGAGAGACAGCATGCATCGGATCTTCAGCATGA3’TCR-alpha链C区引物：5’TCGTCGCCAGCGTCGGAAGTGTATAAGAGACAGTCTCAGCTGGTACATATCGATGTCAGGGT3’TCR-beta链C区引物：5’TCGTCGCCAGCGTCGGAAGTGTATAAGAGACAGTCGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG3’BCR-Heavy链C区引物：IgA：5’TACGCGATATCGCTCTGCGCTAACTAGTCGTACTAGGCTCCTGGGTTCCGAAGCC3’IgG：5’TACGCGATATCGCTCTGCGCTAACTAGTCGTACTAGCGCCTGAGAAGGACGACAC3’IgM：5’TACGCGATATCGCTCTGCGCTAACTAGTCGTACTAGGGGAATTCTTCTGGGAGAC3’BCR-Light链C区引物：Kappa:5’TACGCGATATCGCTCTGCGCTAACTAGTCGTACTACCTTCCACTCTATATTGGCCTC3’Lambda:5’TACGCGATATCGCTCTGCGCTAACTAGTCGTACTAGCCACTGTATCCGCTCCCGGG3’对于下游引物根据需要选择，比如要做TCR-beta链就选择TCR-Beta的引物，如果要做BCR-light(kappa)，就选择这条引物。一般情况下做TCR测序，BCR测序，是一条链一条链测的，根据目的检测的链来定，TCR和BCR各选一条在一起测，本发明中也可以全部放在一起测，利用了1条上有引物和7条下游引物，能测TB细胞受体全部链。PCR2步骤标签上游引物：5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index1]GTCTCGTGGGCTGG3’标签TCR下游引物：5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[index2]TCGTCGCCAGCGTC3’标签BCR下游引物：5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[index3]TACGCGATATCGCT3’rG＝RNA核苷酸标签引物中下划线部分为Illumina测序标签序列，[]内序列可更换为下表序列，用于同时检测多个样本时，利用不同的index1-index2或者index1-index3组合和生物信息学算法区分多个样本的T细胞受体(TCR)与B细胞受体(BCR)测序结果。引物设计：针对RNA反转录时在5’端添加的接头序列和TCR于BCRC区基因进行分析，采用Oligo7.36和PrimerPremier6.0对引物二聚体以及茎环错配进行分析，在5’端人工接头设置了上游引物，针对C基因下游设计反向引物，扩增TCR与BCR全长转录子区域序列，其中包含了TCR与BCR免疫组库的FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4区域。采用本发明的PBMCRNA5’端接头、引物以及文库构建后，高通量测序得到大约几百万条TCR和BCR序列。测序结果进行生物信息学分析(生物信息分析采用Bowtie2aligner(Ver.2.1.0)，TCR和BCR数据库匹配来源于国际免疫基因信息系统www.imgt.org)，部分分析比对结果如下图4、5所示。通过生物信息学分析，可以准确的知道每条TCR和BCR序列的信息，氨基酸信息，条数以及所占比例等。经过TCR和BCR对比分析，本发明获得了高通量测序序列TCR和BCR序列信息的统计分析结果，结果如图4(TCR)和5(BCR)所示。上述结果表明，利用本发明的方法同时构建TCR和BCR文库能够覆盖TCR和BCR基因的多样性信息，提高低拷贝数免疫细胞克隆的检出率和节约时间、试剂和人工成本。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表SEQUENCELISTING<110>孙涛<120>一种基于高通量测序同时检测T细胞和B细胞免疫组库的方法<160>34<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<220><223>XCR3’Oligo(dT)引物<400>1ttttttttttttttttttttga22<210>2<211>32<212>DNA<213>人工合成<220><223>XCR5’Oligo接头<400>2atgcatcggatcttcagcatgaacttrgrgrg32<210>3<211>57<212>DNA<213>人工合成<220><223>XCR5’端接头引物<400>3gtctcgtgggctgggcgatgtgtatgagagacagcatgcatcggatcttcagcatga57<210>4<211>62<212>DNA<213>人工合成<220><223>TCR-alpha链C区引物<400>4tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtctcagctggtacatatcgatgtcagggt62<210>5<211>62<212>DNA<213>人工合成<220><223>TCR-beta链C区引物<400>5tcgtcgccagcgtcggaagtgtataagagacagtcgcagcgtcagatgtgtataagagacag62<210>6<211>55<212>DNA<213>人工合成<220><223>BCR-Heavy链C区引物-IgA<400>6tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggctcctgggttccgaagcc55<210>7<211>55<212>DNA<213>人工合成<220><223>IgG<400>7tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagcgcctgagaaggacgacac55<210>8<211>55<212>DNA<213>人工合成<220><223>IgM<400>8tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaggggaattcttctgggagac55<210>9<211>57<212>DNA<213>人工合成<220><223>BCR-Light链C区引物-Kappa<400>9tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactaccttccactctatattggcctc57<210>10<211>56<212>DNA<213>人工合成<220><223>Lambda<400>10tacgcgatatcgctctgcgctaactagtcgtactagccactgtatccgctcccggg56<210>11<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>11caagcagaagacggcatacgagatatctatcggtctcgtgggctgg46<210>12<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>12caagcagaagacggcatacgagattcaggtgagtctcgtgggctgg46<210>13<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>13caagcagaagacggcatacgagatcactagttgtctcgtgggctgg46<210>14<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>14caagcagaagacggcatacgagatgaattgccgtctcgtgggctgg46<210>15<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>15caagcagaagacggcatacgagatatgtacaagtctcgtgggctgg46<210>16<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>16caagcagaagacggcatacgagatgattcagtgtctcgtgggctgg46<210>17<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>17caagcagaagacggcatacgagatctgttcgtgtctcgtgggctgg46<210>18<211>46<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签上游引物<400>18caagcagaagacggcatacgagattatacggcgtctcgtgggctgg46<210>19<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签TCR下游引物<400>19aatgatacggcgaccaccgagatctacactagctacttcgtcgccagcgtc51<210>20<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签TCR下游引物<400>20aatgatacggcgaccaccgagatctacacattatagctcgtcgccagcgtc51<210>21<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签TCR下游引物<400>21aatgatacggcgaccaccgagatctacaccccgtacttcgtcgccagcgtc51<210>22<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签TCR下游引物<400>22aatgatacggcgaccaccgagatctacacgggtataatcgtcgccagcgtc51<210>23<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签TCR下游引物<400>23aatgatacggcgaccaccgagatctacacagcaggtgtcgtcgccagcgtc51<210>24<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签TCR下游引物<400>24aatgatacggcgaccaccgagatctacactatacgtatcgtcgccagcgtc51<210>25<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签TCR下游引物<400>25aatgatacggcgaccaccgagatctacaccacctagttcgtcgccagcgtc51<210>26<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签TCR下游引物<400>26aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttgctactcgtcgccagcgtc51<210>27<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签BCR下游引物<400>27aatgatacggcgaccaccgagatctacaccacgatgttacgcgatatcgct51<210>28<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签BCR下游引物<400>28aatgatacggcgaccaccgagatctacactaatcgcttacgcgatatcgct51<210>29<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签BCR下游引物<400>29aatgatacggcgaccaccgagatctacacatattacctacgcgatatcgct51<210>30<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签BCR下游引物<400>30aatgatacggcgaccaccgagatctacaccctatacttacgcgatatcgct51<210>31<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签BCR下游引物<400>31aatgatacggcgaccaccgagatctacacggatgaaatacgcgatatcgct51<210>32<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签BCR下游引物<400>32aatgatacggcgaccaccgagatctacacagtctttgtacgcgatatcgct51<210>33<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签BCR下游引物<400>33aatgatacggcgaccaccgagatctacactagtggtatacgcgatatcgct51<210>34<211>51<212>DNA<213>人工合成<220><223>标签BCR下游引物<400>34aatgatacggcgaccaccgagatctacacgtatgaactacgcgatatcgct51当前第1页1 2 3